使用了以下市售细胞系：MCF10A（ATCC，CRL-10317）；带有PIK3CAP.H1047R/+敲门蛋白的MCF10A和匹配的PIK3CA+/+对照（Perkinelmer/Horizo​​n Discovery ，HD 101-011）;MCF10A带有Akt1E17K/+（Perkin Elmer/Horizo​​n Discovery，HD 101-007）;sum159（Asterand Bioscience/Bioivt
，sum159pt）;MDA-MB-468（ATCC，HTB-132）;T47D（ATCC ，HTB-133）;NIH-3T3小鼠胚胎成纤维细胞（ATCC
，CRL-1658）；HEK293T（ATCC，CRL-11268）。先前描述了Ptripz Vector的MCF10A细胞系稳定地表达可耐霉菌诱导的Akt2-E17K 。 　　所有MCF10A衍生的细胞系均在没有抗生素的标准MCF10A生长培养基中（DMEM/F12培养基（WISENT BIDORDUCTS ，319-075-CL）
，5％马血清（Gemini Bio，100508） ，10 µg ML-1胰岛素（Thermo Fisher Scientific/Gibco
，AGIBCO，AGERISIFIC/GIBCO） ，A11382ii
，A1138282ii）（Sigma-Aldrich，H4001） ，20 ng ML-1 EGF（R＆D Systems，236-EG-01M）和100 ng ML-1霍乱毒素（列表生物实验室
，100B））。MCF10A稳定地表达可耐霉素的HA-AKT2-WT和HA-AKT2-E17K（Ptripz构建体）在0.5μgml-1紫霉素中维持
。NIH-3T3小鼠成纤维细胞在DMEM（WISENT BIOPRODUCTS，319-005-CL）中生长 ，其热灭活FBS（Thermo Fisher Scientific
，10438026）。SUM159，MDA-MB-468和T47D细胞系在RPMI 1640（WISENT生物产品 ，350-000-CL）中保持10％热灭活的FBS 。在250 µg ml-1 G418（遗传素；新霉素类似物）（Invivivogen
，ant-gn-1）中，将稳定表达PANK2或PANK4变体构建体（Pluin）中的PANK2或PANK4变体构建体保持
。所有细胞系均在37°C下生长在5％CO2和高湿度下 ，通常每2天进行一次性胰蛋白酶
，并保持细胞密度亚汇合。使用MyCoAlert检测试剂盒（Lonza，LT07-218） ，证实细胞对支原体污染呈阴性 。 　　For experiments involving MCF10A stably expressing doxycycline-inducible HA–AKT2(WT) or HA–AKT2(E17K), cells were plated in standard MCF10A growth medium containing 200 ng ml−1 doxycycline (Sigma-Aldrich, D3447) for 30 h and then serum/growth factor deprived in medium containing 200 ng ml−1 doxycycline for18小时
，总计48小时
。在对细胞进行处理和收集细胞的那一天，强力霉素不包括在培养基中。 　　通过重悬于1×siRNA缓冲液中（5×siRNA缓冲液（PerkinElmer/Horizo​​n Discovery ，B-002000-UB-100），在无菌分子级RNase-fime RNase-free Water（PorkineLmer/Horizo​​n Discovery
，B-003000-WB-100）中稀释至1倍的siRNA库存 。添加缓冲液后，将汤料在室温下涡旋30分钟 ，将等分放入带有垫圈的螺丝瓶小瓶中
，在液氮中捕集，并储存在-80°C下
。每个等分试样都被冷冻 - 透视不超过五次。对于每个目标 ，将三个不同验证的siRNA以相等的浓度合并
，以使培养基中的最终总浓度为20 nm 。对于6厘米菜肴中的siRNA细胞培养处理，将siRNA稀释在250μl预热的Optimem（Thermo Fisher Scientific/Gibco ，31985062）A中的A中
，因此对细胞的最终浓度为20 nm
。同时，将lipofectamine rnaimax转染试剂（Thermo Fisher Scientific/Invitrogen ，13778075）稀释在250μlTubeB中的250μl预热的Optimem中
，以使细胞的最终浓度为2.5μllipofectamine in Plate In Plate In Plate。这些试管被闪烁混合（避免了涡旋） 。将管子与管B彻底混合，在室温下孵育15分钟 ，然后将其滴入细胞中。将细胞与siRNA/Transfection试剂孵育过夜，第二天将培养基完全用新鲜生长培养基取代
。转染后约30小时
，将细胞用无血清/生长因素培养基洗涤，并剥夺了18小时的血清/生长因子（如上所述 ，在自定义DMEM中）。然后将这些细胞用于代谢物分析实验
，如下所述 。有关siRNA序列，请参见补充表1（siRNA）
。 　　第二天将细胞接种在15厘米板中以达到70％的汇合。在15 cm板中 ，用20 nm的最终siRNA混合物将细胞用siRNA转染
，用20 nm的最终siRNA混合物和2.5μl脂肪切开胺 。24小时后，再次将细胞胰蛋白酶插入并在6厘米板中播种 ，第二天达到70％的汇合
。将细胞播种在补充有5％FBS或5％透析FBS的RPMI 1640培养基中（Life Technologies
，26400-044）。然后，在16–20小时后 ，将3 µM 13C315N1-VB5升入培养基中
，并如下所述进行追踪实验 。 　　Snapgene v.5.1用于所有克隆方法和处理测序数据
。 　　将靶向人PANK2的外显子2（补充表1（SDRNA））的单个指南RNA（SGRNA）插入TLCV2中，TLCV2是一种基于多核酸的载体 ，用于对强力林诱导表达的cas9-2a-egfp表达，并创建了SGRNA和pla and plna和Puromycin的构元（添加剂）（添加剂）（添加剂）（添加剂）（添加剂）（添加剂）（添加）（A. Karpf38）。使用E-Crisp39（http://www.e-crisp.org/）鉴定了指南靶向序列 。通过集成的DNA技术合成引导寡核体
，并将其插入TLCV2中，如前所述 ，该寡核酸寡核酸杆菌寡寡核酸杆菌40,41
。将质粒转化为NEB稳定的高效高效大肠杆菌（新英格兰Biolabs
，C3040H）。测序克隆以确认插入 。AKT1E17K/+ MCF10A细胞被含有PANK2 SGRNA-TLCV2构建体的慢病毒感染，并用1 µg ML-1嘌呤霉素选择 ，直到感染缺乏TLCV2的慢病毒的对照细胞完全死亡。为了诱导CAS9表达
，将细胞在强力霉素中维持5天，在250 ng ml -1中 ，然后在1 µg mL -1时保持12天
。To prepare live cells for GFP-based fluorescence-activated cell sorting (FACS), cells were trypsinized, resuspended in FACS medium (DMEM without phenol red, glucose, glutamine or pyruvate (Thermo Fisher Scientific/Gibco, A1443001), supplemented with 1× penicillin–streptomycin (Thermo Fisher Scientific, 15140163),5 µg mL-1浆菌素（Invivogen
，ANT-MPT-1），10 mM HEPES（Thermo Fisher Scientific/Gibco ，15630080）
，2％马血清（Gemini Bio，100508） ，20 mM葡萄糖，葡萄糖（Thermo Fisher Scientific Sc​​ientific
，15023021），1 mm Pyruvate and a pymmm-pyruvate and aigmmm-pym-pymma-aldrichardrich prichrich ichardhichare ，40μm滤网（Thermo Fisher Scientific
，22–363–547）去除细胞团。对具有最高荧光强度的最高25％的GFP+细胞进行了分类 。没有强力霉素生长的细胞（GFP阴性）用作门控的阴性对照
。将细胞收集在捕获培养基中（DMEM/F12， 1×青霉素 - 链霉素 ，5 µg mL -1质霉素
，10 mM肝素，10％马血清 ，1 mM谷氨酰胺和1 mM丙酮酸）。随后将细胞镀在标准的MCF10A生长培养基中
，但具有10％马血清，10 mM HEPES ，1×青霉素 - 链霉素和5 µg ML-1等血脂素
，可在有限稀释（每100 µL 0.5细胞）中，在100 µL中 ，在96孔的板块中，在100 µL中
，将单个细胞均匀地铺平 。将单细胞克隆种植到克隆人群中，并使用Western印迹筛选Pank2表达
。有关SGRNA序列 ，请参见补充表1（SGRNA）。 　　CRISPR – CAS9介导的PANK4的敲除是使用配对的SGRNA与Cas9 D10A Nickase突变体结合使用的
，从而降低了脱靶双链DNA断裂的概率 。细胞的瞬时转染用于引入表达SGRNA和CAS9的向量，以确保最终克隆没有表达这些表达 ，并最终可用于创建具有未改变的表达构建体的稳定重新表达Pank4的基因敲除细胞系
。靶向人Pank4的外显子2（补充表1（SGRNA））的配对SGRNA分别插入PSPCAS9N（BB）-2A-GFP（PX461）（Addgene Plasmid
，48140，由F. Zhang41的实验室创建）。使用E-Crisp39鉴定了两个配对的指南序列 。如先前所述41 ，通过集成的DNA技术合成引导寡核酸寡核酸杆菌
，并插入PSPCAS9N（BB）-2A-GFP中
。使用Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific/Invitrogen，11668027） ，将两个矢量（每个包含一个GRNA序列）暂时共转染到Akt1E17K/+ MCF10A
，AKT1+/+ MCF10A或SUM159细胞中。然后，转染后2天 ，对GFP+细胞进行排序，铺板
，生长为单细胞克隆群体，并筛选出PANK4蛋白表达 ，如上所述
，Pank2-KO细胞所述 。有关SGRNA序列，请参见补充表1（SGRNA）。 　　Site-directed mutagenesis of phosphorylated residues on PANK2 and PANK4 was performed using primers designed with NEBasechanger (New England Bioloabs), the Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit (New England Biolabs, E0552S) and NEB Stable competent high-efficiency E. coli (New England Biolabs, C3040H). 　　PCDNA3.1中的N端标记标记的Pank4（Flag-Pank4）构建体由Flag-Tag序列（DykDDDDK）组成 ，然后是甘氨酸 - 赛烯接头（GS）
，随后是全长人Pank4缺乏其N-端甲基蛋白的序列
。Pank4变体包括突变体D623A，D659A ，T406A和T406E。空PCDNA3.1用作转染的对照 。将这些构建体瞬时转染到HEK293T细胞中以产生FLAG -PANK4
，以用于体外磷酸酶测定（见下文）
。 　　使用融合的HD Croning System（Takara/Clontech，639645） ，将未标记的人PANK2和PANK4序列（下列出的登录号）插入了plenti-ubc-ires-neo（Pluin）慢病毒载体（S. McBrayer和W.Kaelin42的礼物）中。Pluin由泛素C（UBC）启动子驱动的蛋白质和内部核糖体入口位点（IRES）序列驱动G418/neomycin抗性盒的序列 。除了新霉素的耐药盒外
，pluin与以前描述的plenti-ubc-ires-hygro构建体相同42
。有关序列，请参见补充表1（输注引物和测序引物）。 　　慢病毒是通过将目标质粒的短暂转染到HEK293T细胞中产生的 。将细胞以每10 cm板的9×106细胞镀式细胞 ，并用6.3μg感兴趣的蛋白质表达质粒转染，11.1 µg PSPAX2包装质粒（Addgene质粒
，12260，由D. trono实验室创建的） ，D
。trono实验室创建
，0.6μgpcmv-vsvsv-vsvsv-gsvsv-gpopope proty propy plasmid（添加）plasmid（添加）plasmid（B. Weinberg43）和3μL聚乙烯胺（Millipore-Sigma，408727）每µg转染的DNA。48小时后 ，收集培养基
，通过0.45 µM滤波器（Thermo Fisher Scientific，09-740-106）运行 ，并在-80°C下存储在等分试样中 。 　　在含有5μgml-1聚甲烯的培养基中
，以50％密度的培养基在50％密度下将细胞用慢病毒感染（Sigma-Aldrich，107689）
。随后在1μgml -1嘌呤霉素（TLCV2）或500 µg mL -1 G418（遗传素； pluin）中选择细胞。 　　将细胞（600,000–700,000）铺在标准生长培养基中的6厘米菜肴中 ，使细胞在24小时后约为75％汇合 。将三个用于代谢组学的重复板和两个平行收集的蛋白质裂解物的重复板被铺板
，处理和收集。 　　无VB5的DMEM是根据不含丙酮酸的标准DMEM定制的（Thermo Fisher Scientific/Gibco，11965） ，但也没有葡萄糖，谷氨酰胺和VB5（美国生物生命科学的定制生产）
。定制的DMEM无需补充剂用于洗涤
，定制的DMEM补充了5毫米葡萄糖，1毫米谷氨酰胺和3μM未定位的VB5用于血清/生长因子剥夺 ，并补充了5毫米葡萄糖的定制DMEM
，1 mm谷氨酰胺和1 mm谷氨酰胺和3μm13c315n1-vb5用于TRACIND。电镀（约30小时）后的第二天，将细胞洗涤 ，然后在血清/生长因子剥离培养基中孵育18小时 。在洗涤之前
，将新鲜的血清/生长因子剥离培养基添加在细胞上2小时，然后将细胞与13c315n1-vb5孵育3小时（除非另有说明时间点）
。在治疗组之间 ，中等变化和治疗相距15分钟
，以达到一致的治疗和收集时间。 　　首先将脉冲：血清/生长因素剥夺细胞与补充5 mm葡萄糖，1 mM谷氨酰胺和3μM13C315N1-VB5（脉冲）的自定义DMEM孵育4小时（脉冲） 。然后将细胞洗涤并在添加了5 mm葡萄糖和1 mM谷氨酰胺的自定义DMEM中孵育1小时 ，但缺乏VB5以耗尽未纳入的13c315N1-VB5的细胞内池
。追逐：最后
，将细胞用自定义DMEM洗涤，并在补充有5 mm葡萄糖和1 mM谷氨酰胺的自定义DMEM中孵育3小时 ，并用3μM13C315N1-VB5或无VB5和100 nm的胰岛素或车辆孵育3 h。 　　For heavy-isotope-labelled 13C315N1-cysteine tracing, treatment medium was prepared from DMEM formulated with 25 mM glu​​cose but without glutamine, methionine, cysteine and cystine (Thermo Fisher Scientific/Gibco, 21013024) that was supplemented with 4 mM glu​​tamine and 100 μM 13C315N1-cysteine (Cambridge Isotope实验室，CNLM-3871-H） 。镀层和处理与上述13C315N1-VB5跟踪相同
，除了使用的培养基和补充剂
。 　　对于信号实验，在指定的时间段内用胰岛素或生长因子处理血清/生长因子剥夺细胞（18小时）。最终浓度和库存如下：胰岛素（Thermo Fisher Scientific/Gibco ，A11382II）
，最终浓度，100 nm；库存浓度为100μM（溶解在0.1 N HCl中 ，然后在水中稀释至最终浓度）；IGF-1（Thermo Fisher Scientific
，291-G1-01M），最终浓度 ，50 ng ml-1;库存
，100 µg mL -1（以0.1％（w/v）BSA/PBS为0.1％）；和EGF（R＆D Systems，236-EG-01M） ，最终浓度
，50 ng ml-1；库存，100 µg ml -1（以0.1％（w/v）BSA/PBS为0.1％） 。在无菌条件下制备库存 ，并在-80°C下储存
。如上所述，如上所述的生长因子刺激和同位素追踪的开始通常是并发的。 　　The small-molecule kinase inhibitors used included the PI3K catalytic inhibitors GDC-0941 (Cayman Chemical, 11600)44 and GDC-0032 (Selleck Chemicals, S7103)45 and BYL-719 (Active Biochem, A-1214)46, the AKT catalytic inhibitor GDC-0068 (Selleck Chemicals,S2808）47和AKT变构抑制剂MK-2206（Cayman Chemical
，1032350-13-2）48 。请注意，已知AKT催化抑制剂可以通过稳定构象来增加苏氨酸308和丝氨酸473的Akt磷酸化 ，在这种构象中
，这些磷酸化残基在磷酸酶中无法获得磷酸化酶，而同一时间则完全抑制Akt激酶活性和磷酸化的下链苯二；在无菌条件下以10 mm的速度溶解在DMSO中 ，并在-80°C下储存。等分试样被冷冻 - 透视不超过五次
。胰岛素/生长因子处理先于DMSO（Thermo Fisher Scientific
，BP231-100）或溶于DMSO中的小分子抑制剂进行15分钟的预处理。在标记过程中，抑制剂或DMSO也存在于培养基中 。 　　先前描述了特定的ATP柠檬酸裂解液（ACLY）抑制剂NDI-091143
。在无菌条件下以20毫米为单位溶解在DMSO中 ，并在-80°C下储存。工作浓度为15–20μm 。 　　泛素激酶抑制剂（Millipore-Sigma
，537983）等效于参考文献中所述的“化合物7 ”
。在无菌条件下以10毫米为单位的DMSO中溶解30。Pank抑制剂库存，并在-80°C下储存 。等分试样被冷冻 - 透视不超过五次
。对于泛酸激酶抑制剂治疗 ，如上所述
，血清/生长因子剥夺（18小时）后，将细胞更改为补充了5 mM葡萄糖 ，1 mM谷氨酰胺和无VB5的自定义的无VB5无DMEM，在治疗前2小时。用指定量的抑制剂预处理细胞15分钟
，然后更改为补充了5 mm葡萄糖，1 mM谷氨酰胺和100 nm 13c315n1-vb5加抑制剂3小时的自定义DMEM 。 　　除非另有说明 ，否则此处描述的体积用于6 cm细胞培养皿
。一个实验中的每个治疗组包括五种复制菜肴
，并与三种菜肴并行收集，用于代谢产物提取的三种菜肴和两种用于蛋白质裂解液的菜肴。 　　对于未标记的极性代谢组学分析 ，将细胞在80％HPLC级甲醇/20％HPLC级水的干冰上裂解
，没有乙酸铵，并处理代谢组学 ，如下所述 。 　　为了分析极性代谢物和乙酰辅酶A
，发现乙酸铵的添加可改善80％甲醇提取物中的乙酰辅酶A信号。用4毫升冰冷的1×PBS短暂洗涤细胞，以去除细胞外代谢产物和细胞碎片
。在1.7 mL的4°C 80％（v/v）HPLC级甲醇（Sigma-Aldrich ，34860）/20％HPLC级水（Sigma-Aldrich
，Sigma-Aldrich，270733）中添加了1毫米Ammon Acmmon-acmmon-acmmoo-armmemma-acma-arth ，将代谢物（包括VB5，COA和乙酰-COA）提取。将提取物刮成2 mL试管中
，并在4°C下以21,000g离心10分钟，以使泥沙蛋白和其他不溶性材料 。将上清液转移到50毫升圆锥管进行干燥
。 　　为了分析COA ，乙酰-COA和其他短链酰基-COA（但不是极性代谢产物）
，用4 mL 4°C 1×PBS短暂洗涤细胞，以去除细胞外代谢物和细胞碎屑。将代谢物（包括COA和短链酰基-COA）在4°C新鲜制备中提取在4°C 10％（w/v）三氯乙酸（Sigma-Aldrich ，T6399）中
，在HPLC级水中 。将提取物刮成2 mL试管中，并在4°C下以21,000g离心10分钟 ，以使泥沙蛋白和其他不溶性材料
。然后将上清液转移到绿洲HLB逆转剂柱中（用甲醇预先激活并用水预平衡）（Waters
，WAT094226），用HPLC级水洗涤 ，并用2×750 µL的HPLC级甲醇和25mmmmmmmmon的含量为含2×750 µl的含量
，并通过2×750 µl的摄入量（由25毫升甲醇）摄取（通过摄入量为含量）。根据制造商的说明） 。在50毫升圆锥管中收集洗脱液进行干燥
。改编自先前描述的方法12,50。 　　将所有样品在室温下（通常为2-3 h）的氮气在50 mL圆锥管中干燥，并使用有机化的24位n- evap氮蒸发剂在-80°C下储存干燥的颗粒（在存储之前始终将样品储存在-80°C下） 。 　　在样本分析的当天 ，将50毫升管中的干燥代谢产物（从6厘米菜肴中）重悬于30μlHPLC级水（Sigma-Aldrich）中，转移至1.5 mL管
，以21,000g的分离为21,000g，在4°C下以4°C ，超级中段转移到新鲜的1.5 mL tube中
。对于每个样品
，立即提交一半以进行MS分析，而其余样品则在液氮中捕集 ，并将其存储在-80°C作为备份。对于每个样品
，使用杂交5500或6500 QTRAP三倍四极杆质谱仪（AB/SCIEX）对5μL注入并分析，并与突出的UFLC HPLC系统（Shimadzu）耦合 。HPLC系统使用亲水相互作用色谱（HILIC）和400μlmin -1的4.6 mm内径×10 cm酰胺Xbridge柱（水）。从85％缓冲液B（HPLC级乙腈）开始运行梯度 ，从0–5分钟开始运行；从5–16分钟开始42％B至0％B；0％B从16–24分钟持有；从24–25分钟开始0％B至85％B；将85％的B持续7分钟
，以重新校准色谱柱
。缓冲液A在95：5水中包含20毫米氢氧化铵/20毫米乙酸铵（pH 9.0）：乙腈。使用以正/负离子极性切换进行的选定反应监测（SRM）分析传递到质谱仪的代谢产物 。电喷雾电离（ESI）源电压在正离子模式下为+4,950 V，在负离子模式下为-4,500 V
。每个SRM过渡的停留时间为3 ms ，总周期时间为1.39 s。每个检测到的代谢产物获得了大约10-14个数据点 。使用多物种V.3.0（AB/SCIEX）整合了每个代谢物的总离子电流的峰面积
。将给定过渡的代谢产物总离子计数标准化为每个治疗组匹配的裂解物的蛋白质含量
，并将治疗重复缩放在其复制组的平均值中，以使重复组之间的运行顺序效应正常化51。对于未标记的 ，有针对性的代谢组学屏幕， 283个内源性水溶性代谢物的靶向
，有些是正离子模式和负离子模式的，总共304 srm跃迁为13,52 。在每个实验中 ，所有代谢产物均未检测到明显的信号
。对于重与同位素标记的代谢产物痕迹
，SRMS是从先前的研究中进行的12,50,52，并在需要时优化了碰撞能和最可靠的Q3产品离子。使用纯化的代谢物和/或未暴露于标记的代谢产物作为对照的细胞中的纯化代谢物和/或提取物对关键SRM进行验证 。有关更多信息 ，请参见补充表1（MS-MS过渡）
。 　　MCF10A AKT1P.E17K/+
，PANK4-KO与空矢量（矢量）重构，野生型Pank4或Pank4d623a细胞在无血清无定制的VB5无vb5 dmem中生长48 h胰岛素 ，0.5 mg ML -1氢化可的松
，20 ng ml -1 EGF，100 ng ml -1霍乱毒素 ，10 mM葡萄糖
，2 mM谷氨酰胺，并且在没有VB5的情况下。24小时后 ，将细胞在同一培养基中洗涤1小时 。48小时后，将细胞在同一培养基中的6 cm板中接种
，但含有1 µM VB5。将三个重复板接种以进行代谢物收集，两个用于蛋白质收集 ，三个包含培养基但没有细胞作为空白对照的板
。电镀后48小时和72小时
，将代谢物收集在80％（v/v）的甲醇/水中。为了进行统计分析，如果所有治疗组平均值的最大强度小于1.5倍的平均强度 ，则将代谢物过滤出来
，或者小于10,000 。将代谢物强度标准化为相对蛋白浓度
。通过与细胞系之间的COA水平的相关性，可以鉴定出在Pank4-磷酸酶活性依赖性方式中显着改变的代谢产物（载体 - 纳特氏菌 ，代谢型v.4.0
，2-1-1- vector – pank4（wt） - pank4（wt）–pank4（d623a），误解速率速率速率速率速率率< 0.1). Of these hits, metabolites altered in the same direction at both time points were analysed using one-way ANOVA (false-discovery rate < 0.1, MetaboAnalyst 4.0). Significantly altered metabolites were visualized by heat map as the fold change relative to vector for each respective time point. 　　In each experiment, four cell lines were compared with five replicate sample plates per cell line in parallel (three plates for collecting lipids and two plates for collecting protein lysates). The cell lines included MCF10A AKT1p.E17K/+ and MCF10A AKT1p.E17K PANK4-KO cells stably reconstituted with empty vector or full-length untagged wild-type PANK4, PANK4D623A, PANK4D659A, PANK4T406A or PANK4T406E. For comparison of vector, wild-type-, D623A- and D659A-expressing cell lines, cells were seeded in 6 cm plates such that they were around 50% confluent the next day, in serum-free custom VB5-free DMEM supplemented with 10% KnockOut Serum Replacement (Thermo Fisher Scientific/Gibco, 10828028), 10 µg ml−1 insulin, 0.5 mg ml−1 hydrocortisone, 20 ng ml−1 EGF, 100 ng ml−1 cholera toxin, 10 mM glucose, 2 mM glutamine and 3 μM VB5. For comparison of PANK4-KO cell lines expressing vector, wild-type PANK4, PANK4T406A or PANK4T406E cells were grown for 48 h in the above-described medium in the absence of VB5. After 24 h, cells were washed for 1 h in this same medium. After 48 h, cells were seeded into 6 cm plates in the same medium but containing 1 µM VB5. The three replicate plates for lipidomics and two replicate plates for protein lysates were seeded, treated and collected in parallel. Three plates with medium but without cells served as blanks. Plates were changed into fresh medium 24 h after seeding and lipids were extracted 48 h after seeding. For the collection of protein lysates, cells were lysed in NP40 lysis buffer as described in the ‘Immunoblotting (western blotting)’ section. The following lipid collection procedure was adapted from previous methods53. For extraction of lipids, plates were placed on wet ice and quickly washed with 4 °C 1× PBS. Then, 1.5 ml of 80% (v/v) HPLC-grade methanol in HPLC grade water at 4 °C was added to the dishes and cells were scraped into prechilled 15 ml glass vials (Cole-Parmer, EW-34534-10) on wet ice. Once all samples were collected, all of the remaining steps were performed at room temperature. For each sample, 4 ml of HPLC-grade MTBE (methyl tert-butyl ether; Sigma Aldrich, 34875) was added to each glass vial with a glass pipette (Cole-Parmer, EW-2555-3-16), and all of the vials were vortexed for 1 min before rocking for 15 min. To induce phase separation, 0.7 ml of HPLC-grade water was added to each vial and the vials were vortexed for 1 min before centrifugation at 1,000g for 10 min. The final ratio for the MTBE:methanol:water mixture was 10:3:2.5 and the final volume was 6.2 ml. Then, 3.5 ml of the upper (organic) layer from each vial was transferred to a fresh glass vial and dried under nitrogen gas. Dried metabolites were stored at −80 °C until the day of analysis. Immediately before LC–MS/MS analysis, dried samples were resuspended in 35 μl of 1:1 HPLC-grade isopropanol:methanol and centrifuged briefly to collect the liquid in the bottom of the glass tube. The samples were then transferred to a 1.7 ml polypropylene microcentrifuge tube, and centrifuged at 21,000g for 2 min. For each sample, half of the supernatant was transferred to a glass autosampler vial for LC–MS/MS analysis, and the other half was stored in a second glass autosampler vial at −80 °C as a backup. 　　For each resuspended sample, 5 μl was injected into an Agilent 1100-Thermo QExactive Plus-Thermo LipidSearch lipidomics platform. A reverse-phase Cadenza 150 mm × 2 mm C18 column with 3 μm particle size (Imtakt) heated to 40 °C at 240 μl min−1 was used with a 1100 quaternary pump HPLC with room temperature autosampler (Agilent). Lipids were eluted over a 22 min gradient from 32% B buffer (90% isopropyl alcohol (IPA)/10% acetonitrile (ACN)/10 mM ammonium formate/0.1 formic acid) to 97% B buffer. A buffer consisted of 59.9% ACN/40% water/10 mM ammonium formate/0.1% formic acid. Lipids were analysed using a high-resolution hybrid QExactive Plus Orbitrap mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) in DDA mode (Top 8) using positive/negative ion polarity switching. DDA data were acquired from m/z 225 to 1,450 in MS1 mode and the resolution was set to 70,000 for MS1 and 35,000 for MS2. MS1 and MS2 target values were set to 5 × 105 and 1 × 106, respectively. 　　Raw lipidomics data were analysed for both identification and relative quantification using LipidSearch v.4.1.30 software (Thermo Fisher Scientific) using an internal database of more than 20 main lipid classes and more than 80 subclasses53. 　　Three independent replicate experiments were performed with four cell lines compared in each experiment and three replicate plates per cell line for collecting lipids. Lipid species with any cellular sample values lower than the average of the blanks were filtered out. Remaining lipid species were normalized to the relative protein concentration of the respective treatment group. For each independent experiment, lipid species with differential abundance between cell lines were identified by one-way ANOVA analysis (MetaboAnalyst v.4.0, false-discovery rate < 0.1). For each lipid that passed this criterion in two out of three independent experiments, the fold change in that lipid between vector-expressing cells and the other three cell lines was calculated, and the values from each independent experiment were averaged. In the analysis, replicates with ‘N/A’ readings were treated as ‘no value’. Using an absolute fold change cut-off (vector-expressing cells versus PANK4-WT expressing cells) of 25%, relative changes were tested for correlation to CoA levels in these cell lines (Fig. 4c) (PatternHunter, MetaboAnalyst v.4.0; k-means clustering by sample; pattern: 2–1–2–2 for cell lines empty vector–PANK WT–PANK4D623A–PANK4D659A; false-discovery rate < 0.1)54. Significantly correlated hits were visualized by heat map as average log2-transformed fold change relative to vector-expressing cells. 　　Three replicates between the four cell lines were analysed as above. After analysis using one-way ANOVA, significantly altered lipids (false-discovery rate < 0.1, fold change >如上所述 ，测试了25％）与COA级别的相关性（patternhunter
，metaboanalyst 4.0;模式：3–2–1–2用于细胞系空的空载体 - pank-pank-pank-pank-pank406a – pank406a – pank406e; false-discovery速率< 0.1). Significantly correlated lipids with even-chain fatty acids were visualized by heat map as the average fold change relative to the row mean of each lipid. 　　Cells were grown for 48 h in custom DMEM in the presence of 10% Knockout Serum Replacement, MCF10A medium growth factors, 10 mM glucose, 2 mM glutamine and in the absence of VB5. Three medium-only samples were plated at the same time as blanks, and one set of samples was grown in unlabelled glucose as a control. After 24 h, cells were washed for 1 h in this same medium. After 48 h, cells were seeded into 6 cm plates in the same medium but containing 1 µM VB5. After 48 h in the presence of VB5, cells were washed in 2 ml of custom medium, and the medium was changed into the same medium but containing 10 mM unlabelled glucose or 10 mM 13C6-glucose (Cambridge Isotope Laboratories, CLM-1396). After 16 h of glucose labelling, lipid extracts were collected as described above. At the time of submission, a quality control sample dilution curve was included with pooled samples diluted at 1×, 0.3× and 0.1× in 50% isopropanol:50% methanol. 　　The non-polar lipid samples were resuspended in 35 μl of 1:1 HPLC-grade isopropanol:methanol before LC–MS/MS analysis, 5 μl was injected. A Cadenza 150 mm × 2 mm 3 μm C18 column (Imtakt) heated to 37 °C at 200 μl min−1 was used with a 1200 quaternary pump HPLC with room temperature autosampler (Agilent). Lipids were eluted over a 25 min. Gradient from 32% B buffer (90% IPA/10% ACN/10 mM ammonium formate/0.1 formic acid) to 97% B. A buffer consisted of 59.9% ACN/40% water/10 mM ammonium formate/0.1% formic acid. Lipids were analysed using a high-resolution hybrid QExactive HF Orbitrap mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) in DDA mode (top 8) using positive/negative-ion polarity switching. DDA data were acquired from m/z 225–1,450 in MS1 mode and the resolution was set to 70,000 for MS1 and 35,000 for MS2. MS1 and MS2 target values were set to 5 × 105 and 1 × 106, respectively. Lipidomic data were analysed for both identification and relative quantification using Elements v.2.0 (Proteome Software) using the National Institute of Standards and Technology (NIST) v.17 and Human Metabolome Database (HMDB) v.4.0 small-molecule spectral databases. The Elements software was also used to trace the incorporation of 13C isotopologues into identified lipids as described previously55. 　　Lipid intensities were normalized to the treatment group protein content. Features were filtered out that had minimum values across experiment samples below the average of three blank medium-only samples. Next, features measured within a linear range were selected for by a correlation coefficient of r ≥ 0.9 between the measured lipid intensities and the expected intensities in the quality control sample dilution curve (1×, 0.3×, 0.1×). Overall, lipid isotopologues of M + 3 and above were enriched in labelled samples relative to unlabelled samples, so features that met this criterion were analysed by t-test between labelled vector and PANK4-WT samples. Lipid species with even-chain fatty acids that were significantly different between treatment groups (false discovery rate < 0.1, fold change >当倍数变化相对于矢量样品的平均值，将20％）通过热图观察到。 　　在有10％基因敲除血清替代物 ，MCF10A培养基因子，10 mM葡萄糖
，2 mM谷氨酰胺以及没有VB5的情况下，在自定义DMEM中生长48小时 。24小时后 ，将细胞在同一培养基中洗涤1小时
。48小时后
，将细胞转移到同一培养基中，但含有1 µM VB5。在存在VB5的48小时后 ，将细胞以每孔7,500个细胞在Agilent XF 96孔板中（Agilent
，101085-004）播种 。根据制造商的说明，在Seahorse XFE96分析仪上进行了Seahorse XF细胞MITO应力测试 ，并用1 µM寡霉素
，1 µM FCCP和500 nm的紫杉酮/抗霉素对细胞进行处理
。如DC测定法测量，将氧气消耗值标准化为细胞蛋白含量。 　　在有10％基因敲除血清替代物 ，MCF10A培养基因子
，10 mM葡萄糖，2 mM谷氨酰胺以及没有VB5的情况下 ，在自定义DMEM中生长48小时 。24小时后，将细胞在同一培养基中洗涤1小时
。48小时后
，将细胞在同一培养基中的6 cm板中接种，但含有1 µM VB5。并联两组板 ，一组板在低渗性裂解缓冲液中裂解以进行酸提取
，一套如上所述在NP40裂解缓冲液中裂解 。在VB5存在的48小时后，改变了培养基。然后 ，16小时后
，将细胞放在湿冰上，并吸出培养基
。将细胞在4°C 1×PBS中洗涤 ，然后在低渗性裂解缓冲液（0.05％NP40
，10 mM HEPES pH 7.4，10 mM KCl）中裂解 ，并搭配蛋白酶抑制剂鸡尾酒
，并刮入1.5 mL管中。将裂解物在4°C摇动20分钟，然后以16,000克离心10分钟 。将上清液保存用于蛋白质浓度测定和蛋白质印迹分析
。将颗粒重悬于0.2 N HCl中 ，并在4°C下摇动20分钟，然后以16,000克离心10分钟。将上清液转移到新的管中
，并用1 M Tris-HCl pH 8.0中和 。将酸提取的裂解物从非酸提取的蛋白质裂解物中标准化为蛋白质水平
。在初始免疫印迹中，基于总组蛋白H3水平也将裂解物归一化。 　　对于14C-VB5标记实验 ，将细胞镀至具有全血清的培养基中的70％密度约为70％
，其中三个用于放射性标记测量值，一个板作为放射性空白 ，两个用于蛋白质裂解物的板 。除了使用100 NCI ML-1 14C-VB5（特定活性
，50-60 MCI MMOL-1; American Radiolageled Chemicals，ARC 0653）外 ，所有板平行处理的所有板并行处理
。4小时后收集蛋白质裂解物的板。与14C-VB5孵育4小时后
，用自定义DMEM洗涤放射性标记的细胞，然后用含有5 mM葡萄糖 ，1 mm谷氨酰胺和无泛素的自定义DMEM追逐1小时 。该1 h孵育​​的目的是去除未掺入COA中的游离放射性标记的VB5
。用室温1×PBS洗涤细胞
，收集在1 ml可溶解水溶液中（0.4 M氢氧化物在水中的氢氧化钠，另外三种专用表面活性剂； Perkinelmer ，6ne9100），并在60°C孵育1 h。将细胞提取物转移到玻璃闪烁瓶中
，并与10 mL Ultima Gold闪烁液（Perkinelmer，6013321）混合 ，然后在测量闪烁计数器上测量每分钟14C的崩解（Beckman LS LS 6500） 。在给定实验的治疗组之间
，所有中等变化和处理都交错了15分钟，以实现一致的治疗和收集时间。 　　用4°C 1×PBS短暂洗涤细胞（波士顿生物产物 ，BM-220）
，并在4°C NP40裂解缓冲液中收集在湿冰上（4°C储存在4°C：40 mm Hepes：pH 7.5，pH 7.5 ，pH 7.5
，Thermo Fisher Scientific/Gibco/Gibco/Gibco，15630080）； 15630080）； 1200 MM Nac-Nac-sig（SIG） ，SIG
，SIG，SIG ，SIG，SIG
，SIG，SIG ，SIG
，SIG，SIG ，SIG
，SIG，SIGL（SIG）；1毫米EDTA ，pH 8.0（Sigma-Aldrich
，E6758）；50毫米氟化钠（Thermo Fisher Scientific，S25547）;（Sigma-Aldrich ，P8340））在使用当天添加
。将板刮成1.5毫升管中
，并在4°C下以15,000克离心10分钟。将上清液转移到新的试管中，并通过DC蛋白质测定法测量蛋白质含量（基于Lowry分析； Bio-Rad ，5000116） 。将裂解物归一化蛋白质浓度，并添加LAEMMLI样品缓冲液的最终1倍浓度（1×：50 mm Tris碱基
，pH 6.8（Thermo Fisher Scientific，BP152）； 2％（W/V）SDS（Thermo Fisher Scientific ，NC0755841）; 5％（V/V/V/V/v/v/v）β-MERCAPT（v/v）M3148; 5％（v/v）甘油（Thermo Fisher Scientific
，G33-500）;蛋白质印迹样品通过SDS-PAGE在Tris-甘氨酸运行缓冲液（25 mM Tris碱基; 0.1％（w/v）SDS; 250 mM甘氨酸）或4–12％BIS-BIS-TRIS梯度凝胶（Thero Fisher Scientific，NP0329Bobs）中的10％Tris-Glycine凝胶上运行
。Proteins were transferred to PVDF membranes (Millipore-Sigma, IPVH00010) at a constant 300 mA for 90 min at 4 °C in Tris-glycine transfer buffer (10× Transfer (Electro) Blotting Buffer (Boston BioProducts, BP-190) diluted to 1× (25 mM Tris-base, 192 mM glycine, pH 8.5) 在10％甲醇（v/v）的水中）。Membranes were briefly washed in 1× TBST buffer (20× Tris-buffered saline with Tween-20 (Boston BioProducts, IBB-870) diluted to 1× (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20, pH 7.6) in water) and blocked in 5% (w/v) non-fat dry milk (Thermo Fisher Scientific,NC9022655）在室温下在TBST中持续1小时 。将膜在TBST中短暂洗涤 ，并在原代抗体中孵育在5％（w/v）无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）（BOSTON BIOPRODUCTS
，P-753）中，用0.01％（w/v）Azide（Heplo Fishericific）和洛克斯（Rocknerific）和洛克（Rocking）cock cock and ocknewhern
。将膜在室温下在TBST中洗涤3次10分钟 ，并在辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二级抗体中孵育5％（w/v）在TBST中稀释1小时
，持续1小时，并在室温下摇摆。将膜在室温下在TBST中洗涤3次 ，并在清晰的西ECL底物（Bio-Rad
，1705061）或Clarity Max Max Western ECL底物（Bio-Rad，1705062）中孵育2-5分钟 。使用膜（Thomas Scientific ，F-BX810）或Bio-Rad Chemidoc成像系统（Bio-Rad，17001401）检测到化学发光信号
。 　　有关原始免疫印迹膜扫描
，请参见补充表1（免疫印迹抗体）。 　　所有步骤均在湿冰或4°C上进行 。将10 cm培养皿中的细胞裂解在冰上的700μlNP40裂解缓冲液中，并刮入1.5 ml管中
。将裂解物在4°C下以15,000克离心10分钟 ，将上清液转移到新的管子上
，在4°C下以15,000克的第二次离心5分钟，并将清除的上一剂转移到新管中。将蛋白质浓度归一化 ，并在NP40裂解缓冲液中提高样品到相同的体积（至少600 µL） 。总共保存了100μl裂解物进行免疫印迹。将剩余的裂解物（至少500μl）与1μg免疫沉淀抗体一起孵育2小时
，在4°C下摇动
。免疫沉淀抗体与蛋白质A/G琼脂糖珠（Thermo Fisher Scientific，20421）或蛋白质G Dynabeads（Thermo Fisher Scientific ，10004D）结合。将蛋白A/G琼脂糖珠用珠洗手液（40毫米HEPES
，pH 7.5和120 mm NaCl）洗涤两次，在不超过2,500g的情况下离心1分钟 ，并在珠洗缓冲液中重悬于1：1浆液中 。通过在Dynamag-2磁铁上颗粒（Thermo Fisher Scientific
，12321-D），将蛋白质G大太角类似洗涤并重悬于
。然后 ，将20 µL重悬的珠添加到每个免疫沉淀样品中，在4°C下摇动2小时。用500 µL NP40裂解缓冲液进行三个洗涤液
，并以2,500G离心珠或使用磁铁进行沉淀，然后去除在沉降的珠子上方的所有上清液 ，然后在1×样品缓冲液中重新悬浮 。将样品在95°C加热5分钟
，并在-80°C下储存
。有关更多信息，请参见补充表1（IP抗体）。 　　对于体外AKT激酶测定 ，如上所述
，直到最后的重悬步骤进行了10厘米菜肴的裂解物进行免疫沉淀 。在NP40裂解缓冲液中进行了三次洗涤后，在500 µL激酶反应缓冲液（20 mM HEPES ，pH 7.5（Thermo Fisher Scientific/Gibco
，15630080），10 mM MGCL2（Sigma-Aldrich）（Sigma-Aldrich） ，0.5 mm egta（Sigma-egta（Sigma-aldrich））中
，进行了两次洗涤
。除去所有上清液，并将珠子重悬于20 µL的激酶反应缓冲液中+100 µM ATP（Sigma-Aldrich）和1 mM DTT（Thermo Fisher Scientific） ，有或没有250 ng纯化的GST-AKT1（Sigma-Aldrich）。将样品与周期性搅拌在32°C下孵育30分钟，并放在冰上以停止反应 。保存每个样品上清液的一部分
，并将样品缓冲液添加到每个上清液中的1×最终浓度中
。将珠子重悬于1×Laemmli样品缓冲液中。将样品在95°C加热5分钟，并在-80°C下储存 。对于免疫印迹 ，每个SDS-PAGE凝胶加载了大约四分之一的免疫沉淀样品。 　　D.B.制备了4'-磷酸抗硫酸盐
。在J.L.M.有关4'-磷酸抑制合成的反应步骤的图
，请参见图2。 　　除非另有说明，否则所有试剂均可从商业供应商那里获得 ，并没有进一步纯化 。所有反应的产量涉及纯化产品
。使用预包装的硅胶墨盒在指示的溶剂系统中进行二氧化硅色谱法
，以在Teledyne ISCO纯化系统上使用。在500 MHz的Bruker 500 MHz仪器上获得了1H和31p NMR光谱，为1H ，为1H
，为126 MHz，为13C ，为202 MHz
，为31p 。据报道，相对于δ24.7的三苯基膦氧化物作为外标 ，据报道31p化学位移
。 　　如前所述，磷酸化磷酸盐分为从市售钠 - pantothenate的三个步骤中合成
，如先前所述，次要修饰56。 　　将钠磷酸钠（0.500 g ，2.07 mmol）悬浮在二甲基甲酰胺（7.5 mL）和苯二苯基溴化物（0.246 mL
，2.07 mmol）中 。反应混合物在70°C下搅拌18小时
。在降压下除去溶剂，并将所得残留物溶解在乙酸乙酯（50 mL）中 ，并用盐水洗涤（三次用10 mL）洗涤。将有机层在无水硫酸钠上干燥
，在降压下过滤和冷凝 。用二氧化硅闪光色谱法（3：1至1：0乙酸乙酯：己烷）纯化原料，以产生 - 耐甲酸苯甲酸酯作为无色油（0.510 g ，80％的产率）
。 　　将二苯二唑磷酸盐（1.09 mL
，4.95 mmol）溶于甲苯（6.6 mL），并加入N-氯糖酸酰胺（0.661 g ，4.95 mmol）。将反应混合物在22°C搅拌16小时
，然后过滤成干燥的烧瓶 。在单独的干烧瓶中 - 耐苯甲酸苯甲酸酯（0.51 g，1.65 mmol）用无水吡啶（2×5 mL）干燥 ，然后溶解在无水吡啶（7.4 mL）之前，并冷却至-40°C（干冰/actonitrile）。将二苯二氯磷酸溶液滴入-40°C下滴至 - 耐甲酸苯甲酸苯甲酸酯溶液中
。在-40°C下2小时后
，将反应混合物在-20°C下保持16小时，然后将其温暖至22°C ，并用水淬火（3 mL）。在降压下除去挥发性
，并将所得的残基溶解在乙酸乙酯（25 mL）中，并用1 m H2SO4（用5 mL两次）和饱和的NAHCO3（两次用5 mL）依次洗涤 。将有机层在无水硫酸钠上干燥 ，过滤并在减压下凝结
。二氧化硅闪光色谱法（2：1至1：0乙酸乙酯：己烷）的纯化产生了4-磷酸 - - 甲状腺硫酸酯酯酯作为无色油（0.617 g
，66％的产率）。1H NMR（500 MHz，DMSO）δ7.86（t ，j = 5.9 Hz
，1H），7.42–7.29（M ，14H）
，5.70（d，d ，j = 5.7 Hz，1H）
，5.07（s，2h） ，5.03（s
，2h），5.03（s ，2h）
，5.02（s，5.02（5）1H） ，3.79（DD
，J = 9.4，4.4 Hz ，1H）
，3.68（D，J = 5.7 Hz ，1H），3.40
，3.40（DQ，J = 13.2 ，6.7 Hz
，1H），3.28（DT ，DT
，J = 12.9，6.5 Hz ，1H）
，2.5 Hz，1h） ，2.54（2.54（2.54）（S
，3H） 。13C NMR (126 MHz, DMSO) δ 172.04, 171.27, 136.18, 136.12, 136.05, 128.46, 128.42, 128.31, 128.01, 127.98, 127.77, 73.84, 72.96 (d, J = 6.1 Hz), 68.40 (d,J = 5.5 Hz），65.57 ，38.51（D，J = 8.1 Hz）
，34.28，33.77 ，20.39
，19.68
。31p NMR（202 MHz，DMSO）δ-0.42。 　　将4-磷酸 - 甲状腺硫酸酯酯酯（0.200 g ，0.35 mmol）溶解在甲醇（2 mL）中 。将烧瓶用N2冲洗
，然后加入PD/C（10％，10 mg）
。将反应混合物用H2释放5分钟 ，然后在H2（1 atm）下剧烈搅拌2小时。将反应混合物通过0.45 µM PTFE滤波器过滤
，以去除催化剂，并在减压下冷凝滤液 。通过反相闪光色谱（C18 ，0至50％乙腈在水中）纯化该粗产物
，以产生4-磷酸 - 甲酸作为无定形固体（0.065 g，62％的产率）后 ，在作冷冻水性化后
。1H NMR（500 MHz，d2O）δ4.04（s
，1h），3.83（dd ，j = 9.6
，4.0 Hz，1H） ，3.63（dd
，j = 9.7，4.9 Hz ，1H）
，1H），3.52（3.523H） ，0.91（S
，3H）。13C NMR（126 MHz，D2O）δ176.13 ，174.83，74.40
，71.37，52.31 ，38.26（d
，j = 7.8 Hz），34.73 ，33.51
，20.57，18.54 。31p NMR（202 MHz ，D2O）δ0.24。ESI计算为C9H17NO8P- [M - H] -298.1
，发现298.1
。 　　T.T.Z.制备了4'-磷酸耐药。在J.L.M.使用先前描述的方案57的适应性，使用金黄色葡萄球菌泛素激酶和ATP通过酶促磷酸化制备了4'-磷酸耐药 。在酶促反应之前 ，通过硼氢氢钠新鲜降低了泛氨酸58
。通过反相HPLC纯化了4'-磷酸耐乙烷的产物
，以产生与先前报道相同的NMR和LC-MS光谱固体36,59。 　　磷酸酶测定是从先前的方法33改编的 。请注意，参考文献中使用了pank4的孤立的DUF89磷酸酶结构域（c-末端HIS标签）
。33 ，而在这项研究中，我们使用了全长pank4（n-末端标记标签）。HEK293T细胞用含有空载体或标记为Flag标记的Pank4的PCDNA3.1构造48小时
，并如“ Pank1/2/4”部分的“免疫沉淀分析
”中所述 。将抗FLAG M2琼脂糖珠（Millipore-Sigma，A2220）添加到裂解液中4小时 ，在4°C下摇动以进行免疫应变旗-pank4
。在4°C 1％NP40裂解缓冲液中用蛋白酶抑制剂洗涤两次珠
，但没有磷酸酶抑制剂，在4°C的磷酸酶反应缓冲液中两次（50 mM Tris-HCl pH 7.5 ，100 mm NaCl
，NaCl，0.5 mm ，0.5 mm CO2+）。在添加与底物的反应缓冲液之前
，将过量的缓冲液从上方取出，请参见（见下文） 。使用ImageJ对SDS -PAGE凝胶进行免疫沉淀 ，并使用ImageJ染色
，成像和定量凝胶，以确定FLAG -PANK4蛋白浓度
。 　　将M2琼脂糖珠上的FLAG-TAG免疫疗法与20μl的50 mM para-硝基苯基磷酸盐（PNPP）（PNPP）（新英格兰Biolabs ，P0757L）在30°C中的反应缓冲液中孵育30分钟，并在30°C中孵育30分钟。通过将10μl反应上清液与90μl的1 N NaOH混合
，从而停止反应 。在分光光度计上测量405 nm处的吸光度。 　　将M2琼脂糖珠上的FLAG-TAG免疫疗法与20μl水作为对照或2 mM 4'-磷酸抗硫酸盐或4'-磷酸耐药在30°C的反应缓冲液中5分钟
。使用孔雀石绿色磷酸盐检测试剂盒（R＆D Systems，DY996）对反应过程中释放的无机磷酸盐释放。在分光光度计上测量了620 nm处的吸光度 。 　　将细胞在无血清定制的无VB5无DMEM中培养24小时 ，并补充10％敲除血清替代（Thermo Fisher Scientific/Gibco
，10828028），10 µg mL-1胰岛素 ，0.5 mg ml-1胰岛素
，0.5 mg ml-1谷氨酰胺和无VB5，然后以24孔格式以每孔7,500个细胞在相同的培养基中播种
。含有可变浓度的VB5的血清被用敲除血清替换替换为不包含VB5的敲除血清 ，以精确控制VB5浓度。第二天（24至30小时后）
，将细胞切换为自定义DMEM，并补充了上述营养和生长因子 ，加上1μMVB5 。在第2天将细胞与完整的培养基变化一起孵育4天
。在第0 、2和4天
，通过将三氯乙酸直接添加到培养基中，固定细胞 ，最终浓度为8.33％（w/v）。总蛋白质染色是通过磺胺胺B分析进行的60 。使用使用MCF10A细胞创建的标准曲线将510 nm处的原始吸光度转换为单元格数
。 　　在标准的MCF10A生长培养基中，将1.25％的琼脂（Thermo Fisher Scientific
，BP1423）的股票稀释至0.625％（请参阅“细胞线和培养条件”部分中的上面的公式），将六孔板上的每孔2毫升铺板为底部琼脂层。在标准MCF10A生长培养基中稀释的2.5 mL的0.28％琼脂以六孔格式以每孔30,000的速度以30,000种子播种 。两周后 ，将细胞用0.01％晶体紫（Sigma-Aldrich
，c6158）染色，并在Bio-Rad Chemidoc成像系统（Bio-Rad ，17001401）上成像
。使用ImageJ手动计数菌落。 　　在贝丝以色列执事医疗中心（BIDMC）进行的所有动物实验均由BIDMC机构动物护理和使用委员会（IACUC）（动物方案
，102- 2015年）批准并进行 。将小鼠维持在带有通风笼架和自动浇水系统的屏障设施中。动物握持室的温度为70–72°F的湿度为70–72°F，并在12 h – 12 h – 12 h Day – Night循环中保持房间 ，从07:00到19:00
。ES272同种异体移植肿瘤研究得到了根据Weill Cornell Medicine IACUC的指南批准并进行的（动物方案2013-0116）。 　　原位同种异体移植乳腺肿瘤模型实验是由B.D.H.进行的 。在Weill Cornell Medicine
。小鼠乳腺癌细胞系ES27229（也称为FR-161）先前源自在有条件表达乳腺限制的PIK3CAP.H1047R（C57BL/6J背景）的转基因小鼠中产生的乳腺肿瘤61。ES272同种异体移植肿瘤的生长已被证明对PI3K抑制剂治疗敏感29 。在注射小鼠之前
，将ES272细胞在DMEM加上10％FBS中培养
。为了产生原位同种异体移植乳腺肿瘤，将1×106 ES272细胞悬浮在无血清培养基中 ，将1：1与基质胶混合
，并注射到8-10周大的免疫能力C57BL/6J小鼠的第四个乳腺中。一旦肿瘤达到0.65 cm的直径，将小鼠用45 mg kg-1的Byl-719（Alpelisib）或媒介物（0.5％甲基纤维素 ，0.5％Tween-80-80）治疗，每天每天一次口服饲料一次 。然后在最终处理后3小时
，通过二氧化碳窒息对小鼠安乐死，然后颈椎脱位
。然后快速切除肿瘤 ，在液氮中捕获冻结
，并储存在-80°C下。 　　该小鼠实验是在BIDMC与J.G.C.实验室合作进行的 。BYL-719（Alpelisib）（Chem Express，HM-206_014-20120614）在5 mg ML-1的媒介物（0.5％甲基纤维素 ，0.5％TWEEN-80）中溶解/悬浮在使用浴缸中
，并使用浴缸超声剂溶解/悬浮在5 mg ML-1中，并存储在4°C中 ，并在4°C中储存
。C57BL/6J雄性小鼠（Jackson Laboratories
，000664；年龄为11-12周）与随意喂食标准食物，然后给予50 mg kg-1 byl-719或通过口服饲养的车辆。然后 ，治疗后1小时
，将小鼠用叶腹蛋白麻醉，并收集胃肌肌肉 ，立即在液氮中快速冻结，并储存在-80°C下 。 　　将frozen的小鼠异种移植肿瘤和骨骼肌储存在-80°C下
，然后将其保存在干冰上，直到加工前。裂解物保持在湿冰上
。将样品在及其标准磷酸酶抑制剂的标准补体（见上文）加上1:50 Halt蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Thermo Fischer Scientific ，78429）中进行预呼应（4°C）NP40裂解缓冲液（48429）。在蛋白质M管设置中
，将样品在Gentlemacs M管（Miltenyibiotec，130-096-335）中均质（Miltenyibiotec ，130-096-235）匀浆 。通过以3,000克离心5分钟来清除裂解液
，然后在1.5或2 ml管中以20,000克的速度离心10分钟，直到将裂解物清除为不溶性碎片
。通过DC测定 ，在确定蛋白质浓度之前
，将裂解物等分试样稀释1：5或1:10。除上述所有免疫沉淀步骤外，除了将组织裂解物与NP40裂解缓冲液中的抗体和珠一起孵育 ，并用1:50 Halt蛋白酶抑制剂鸡尾酒孵育 。 　　该小鼠实验是在BIDMC与J.G.C.实验室合作进行的
。将SUM159细胞维持在10％FBS的RPMI培养基中。细胞在注射前测试了支原体阴性 。注射当天
，将80％的融合细胞被胰蛋白酶胰蛋白酶进行，洗涤和计数
。将每只小鼠总共5×106个细胞重悬于100μl无血清的RPMI培养基中 ，并将其放在湿冰上。将细胞悬浮液与母质（Corning，356230）以1：1（v/v）的比率混合
，并在原位注射到6-8周大的NCR裸体小鼠（Taconic Biosciences，NCRNU-F）的第四个乳腺脂肪垫中 。每周三次（长度和宽度）用卡尺测量肿瘤50天 ，肿瘤体积为（宽度×宽度×长度）/2计算
。当肿瘤达到两个端点之一时
，将小鼠安乐死：750 mm3的体积或溃疡。在研究结束时，其余小鼠安乐死 。每个治疗组注入十只小鼠（每只小鼠注射一组） ，并且在任何单个组中发展为终点的最大数量肿瘤为四个（在pank4敲除+空载体组中）。因此
，每个治疗组中排名前四的最大肿瘤用于分析
。 　　以下人类序列用于siRNA和GRNA设计，蛋白质序列比对以及实验中的表达：pank1 ，pank2
，pank3，pank4。磷酸硫代二酰半胱氨酸合成酶（PPC） ，磷酸甲甲基二酰半胱氨酸脱羧酶（PPCDC）和辅酶A合酶（Coasy） 。补充表1（人类序列参考）提供了登录代码的列表
。 　　对于PANK4和其他含DUF89-域蛋白质之间的氨基酸对齐
，物种，蛋白质和相应的序列标识符如下：Homo Sapiens Pank4（Uniprot：Q9NVE7） ，拟南芥Thaliana Thaliana at2G17340（uniprot）（uniprot：q949ph），pH1579PUR Horikoccc hor horipoccc
，（Uniprot：O59272）和酿酒酵母YMR027W（Uniprot：Q04371）。以前鉴定出非pank4蛋白中的催化天冬氨酸33 。使用Clustal Omega对齐序列
。 　　使用两尾学生的t检验分析了两个治疗组的实验（α= 0.05）。使用单向方差分析（α= 0.05），使用单向方差分析（α= 0.05） ，分析了三个或多个治疗组的实验 。使用双向Sidak测试（α= 0.05）的双向ANOVA分析了三个或多个治疗组和多个代谢物的实验
。使用Excel V.16.46（Microsoft）
，Metaboanalyst V.4.0和ImageJ V.1.50i（W. Rasband，NIH）处理数据。统计分析是在Prism 8图形软件（GraphPad）中进行的 。生物学重复是在单个实验中并行铺板 ，处理
，收集和分析的细胞的单个平板
。实验重复是独立的实验，每个实验的平均三份值的平均值。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得 。