所有实验均根据1986年的《英国动物（科学程序）法》（PPL：PD867676F）进行
，此前塞恩斯伯里·惠康中心动物福利伦理评论机构在当地的道德批准后进行
。总共21 C57BL/6 J雄性小鼠（年龄= 34.5±15.8周（平均±S.D.））用于电生理记录。15只小鼠首先在急性电生理记录之前接受了头部固定的行为训练（请参阅“任务和训练阶段
”），在急性电生理记录之前 ，只有六只小鼠（未经训练的小鼠）进行记录设置 。 　　在进行行为训练和记录之前
，将所有小鼠植入大约1.5％的异氟烷​​下的头部固定棒和Meloxicam（5 mg kg-1）的给药，以允许在行为训练和电生理记录中进行头部固定
。 　　在训练过程中 ，将小鼠与同窝窝组合在单独排气的笼子中共同居住。植入记录室后
，将小鼠饲养以保护植入物 。将小鼠饲养在逆转的白天 - 夜间循环照明条件下，环境温度和湿度分别设置为23°C和56％的相对湿度
。 　　行为任务的设计如前所述。14 。简而言之 ，将小鼠头部固定并放在聚苯乙烯轮上
。将两个显示器（21.5英寸
，1,920×1,080，60 Hz）放在鼠标的每一侧 ，距离小鼠头约20厘米。使用PsychToolBox-3的自定义MATLAB脚本将显示器校正至40 cd M-2的最大亮度 。刺激呈现由MATLAB中的自定义书面软件控制使用PsychToolBox-3
。视觉刺激是一种正弦光栅
，每度0.04个周期的空间频率为0.04个，从而在屏幕上显示了3个光栅周期。每个试验都以覆盖两个屏幕的灰色纹理的介绍开始 。在随机延迟（至少3 s加上平均0.5 s的指数分布的随机样品）之后 ，出现了基线刺激。每50毫秒（3个监视器帧）从对数正态分布中绘制光栅的TF，以使log2变换的TF的平均值为0和s.d
。0.25八度且几何平均值为1 Hz。漂移方向是随机试验
，以向上或向下漂移之间的试验 。从基线开始开始时随机延迟（3-15.5 s）后，TF的持续增加（在文本中称为变更期）发生 ，持续了2.15 s
。对于早期和晚期训练（第8阶段）
，分别在[3
、8]和[10.5、15.5] s之间采样了变化时间，最早的延迟延迟了从平均值为4 s的指数分布采样的更改期。随机15％的试验被指定为不变试验 ，没有变化期 。对于第8阶段培训
，将10％的试验指定为探测试验，并从其他块类型的分布中淹没了变化的时间
。因为早期和晚期之间的神经TF脉冲反应没有质量差异（数据未显示） 我们已经将两种块类型的数据组合在一起 ，用于整个手稿中的分析。与第8阶段有关的发现（早期和晚期）将在即将发表的论文中提出 。 　　通过舔喷口以触发奖励输送（滴一滴豆浆）
，对小鼠进行了培训，以报告TF的持续增加
。在变化期之外发生的舔舔被称为早期舔。如果小鼠在方向方面移动（在50毫米窗口中的运动超过2.5毫米） ，则该试验被中止（第7阶段和第8阶段） 。如果小鼠在变化发作的2.15秒内没有舔
，则该试验被认为是错过的试验
。 　　植入头板后，允许小鼠恢复一周。之后 ，老鼠经历了几个训练阶段： 　　在未经训练的对照实验中使用的六只小鼠（图4E – H）经历了上面的1-3阶段 。随后，它们显示出与受过训练的小鼠相同的刺激
，不同的是，它们在方向盘上的运动或舔喷口没有终止试验或触发奖励。取而代之的是 ，他们在随机时间内以从60±15 s的均匀分布中得出的奖励间隔给予奖励
。 　　奖励输送（大豆牛奶）由电磁夹阀（161p011
，nResearch）控制，并通过放置在其前面的喷嘴传递到鼠标。鼠标舔抽烟的鼠标是通过压电元件（TDK PS1550L40N）测量的 ，该元件与喷口耦合并用定制的放大器系统进行放大 。用连接到车轮轴的旋转编码器（模型kübler）测量了跑步车轮运动
。所有行为数据和事件
，例如PXIE-6341收购卡（国家仪器）（httpsglx（httpsppps：/github.com/billkarsh/spikeglx），通过PXIE-6341收购卡（国家仪器）的模拟和数字通道等所有行为数据和事件 ，例如打开/关闭状态等。 　　通过计算相对于所有小鼠没有提早舔或流产的所有试验的命中量来计算心理测量曲线 。在每个变更大小的会话（n = 114）之间计算了命中率的平均命中率（性能）和95％置信区间（S.E.M.×1.96）
。在每个变化大小的情况下计算平均反应时间和参数95％置信区间（n = 114）
，并根据t检验估算了p值。 　　通过提取早期舔之前的-1.5至0 s的TF脉冲来估算舔刺激的刺激平均值，并在所有试验中平均均取平均值 ，揭示了早期舔之前的平均刺激TF 。通过计算S.E.M.估计参数95％置信区间在早期舔之前
，每50 ms bin（TF脉冲分辨率）处的TF值并乘以S.E.M.1.96
。 　　为了正式测试小鼠在任务中随着时间的推移而行为是否在任务中进行行为整合的刺激证据（TF脉冲），我们构建了一个具有两个可调参数的简单行为泄漏 - 积分器模型：衰减时间（τ）和阈值。我们通过估计哪个衰减时间和阈值预测最早的舔时间（从试验开始后的2 s ，以排除试验发作的舔舔），从而拟合了这两个参数
，然后确定小鼠整个小鼠的平均最佳效果衰减时间和阈值 。对于每个早期的LICK试验，我们计算了整个试验的衰减的集成对数尺度TF ，直到早期舔
。 　　对于每个早期的LICK试验
，我们估计是否在实际的早期发作的第二秒内预测了综合TF的阈值交叉。如果是这种情况，我们认为该模型已经预测了早期的舔时间 。如果没有 ，我们认为该模型无法正确预测该试验。我们使用58×151参数空间：58可能的衰减时间从0.05 s的衰减时间（即
，不整合）到1,000 s的衰减时间（即完美的整合）：（ 50日志间隔时间跨度为0.050-3 s，以及8个额外的衰减时间：4 ，以及4 、6
、6、7 、7
、7、7 、7
、7、7 、7
、7、7 、7、7
、7、7 、7
、7、7 、7
、7、7 、7
、7、7 、7
、7、7 、6、7
、7、7 、7
、7、7 、7
、7、7 、7
、7、7 、7
、7、7 、7、7
、7
，跨越阈值[0.01–0.16]
。用t检验对小鼠进行最佳衰减时间的显着性测试（即比没有整合（0.05 s））。 　　我们还测试了通过预测早期舔时间来估计的最佳拟合衰减/积分时间参数是否在预测单审命中反应时间（即，参数未优化的试验类型）在预测单次命中反应时间时也没有集成 。我们通过比较每个变化大小的实际反应时间和预测的反应时间来做到这一点 ，并计算出皮尔逊在实际反应时间和每个变化大小的反应时间之间的相关性
。我们通过查看所有反应时间
，或者仅包括在定义值下（即反应时间截止）的试验子集来计算这一点。这样做是为了更好地检测任何模型是否具体努力预测很晚的反应时间，而反应时间可能会受到诸如不集中或缺乏参与之类的非敏感因素的调节 。最后 ，对于没有整合的模型（衰减时间= 0.05 s）与具有最佳拟合衰减/整合时间（如上所述的早期舔试验估计）的模型（如上所述估计），在预测单个动物反应时间和预测的均值差异时
，是否有显着差异（1 s反应时间截止）和模型的所有预测反应时间，每只鼠标有或没有整合 ，并从集成与无整合模型进行了相关值的配对t检验（跨小鼠）
。 　　为了测试小鼠是随着时间的推移积累证据还是仅对瞬时刺激做出反应
，我们制定了一个无效模型，在该模型中 ，通过随机异常检测策略产生行为响应。在这里
，当刺激的嘈杂的感觉表示越过决策范围时，就会发生内部决策 ，并且在随机延迟后发生响应 。响应是由刺激的单个瞬时值触发的
。但是
，由于随机延迟，响应可能会显示出对刺激历史的统计依赖逐渐衰减 ，甚至可能模仿诸如Integration的证据积累策略42。 　　模型 。根据异常检测模型
，每个试验独立生成行为响应，如下所示
。让SI为每个时间点Ti的刺激振幅（log TF）。我们选择时间点与刺激的视频帧相对应 ，该视频帧以60 Hz（每个TF脉冲3帧）呈现 。在每个时间点，嘈杂的感觉表示Zi形成为刺激幅度的总和
，独立且分布相同（I.I.D.）高斯感觉噪声εi（平均零和方差σ2）： 　　内部决定在时间d发生，这是由第一个时间点给出的 ，即感觉表示超过b（如果在刺激结束之前未跨过界限）的决策B（或∞）： 　　因此
，决策时间的危害功能是： 　　其中φ是标准的正常累积密度函数（CDF）。 　　电动机响应从时间r开始，由决策时间和独立的 ，非负随机延迟∆表示代表非确定过程的持续时间（例如
，决定运动延迟）： 　　延迟具有位置α，比例β和形状γ的对数分布的变化 ，可以通过指出逻辑随机变量
，然后添加常数来获得
。我们限制了位置（α> 0）和形状（γ> 1），以给出分布的非负支撑和凸起的密度 ，该密度在模式的两侧降低。延迟时间概率密度函数（PDF）和CDF为： 　　由于决策和延迟时间是独立的
，因此边际响应时间分布是由决策和延迟时间分布的卷积给出的 。响应时间的边际PDF和CDF为： 　　如果可以从上面的危险函数HD计算决策时间概率质量函数（PMF）PD
。由于延迟是非负的，因此对于所有d> r ，pδ（r -d）=fδ（r -d）= 0，因此
，只需在给定响应时间之前按时间步长时间计算上述总和。 　　使用numpy，scipy和pytorch库使用自定义Python软件实现了异常检测模型 。所有涉及概率的计算均在日志空间中进行 ，使用旨在避免数值下/溢出的功能
。 　　配件。在两个阶段中适合每个鼠标的单独模型 。我们首先仅使用最大变化幅度的试验拟合延迟时间分布
，然后使用整个数据集（不包括中止试验）拟合其余的决策参数
。这种两阶段的方法取决于延迟在跨试验中分布相同的假设。作为回报，它允许对延迟时间分布进行更直接的估计 ，从而提供更好的能力
，以区分离群检测和更长的时间表策略，例如集成 。 　　对于每个试验i ，让n（i）为时间点
，为刺激幅度，c（i）为变化点的时间
。对于发生响应的试验 ，让r（i）为响应时间
，以面部运动的发作（请参阅“运动开始时间估计”部分），ℓ（i）为随后的舔时间（以奖励喷嘴测量）。 　　安装延迟时间分布 。我们假设最大的变化幅度（几何平均TF 4 Hz）足够大 ，可以触发变化点或附近的立即决定。在这个假设下，可以通过反应时间近似大变化命中试验的延迟时间
，可以将其直接测量作为变化点和面部运动开始之间的时间
。因此，我们将延迟时间分布（移动的对数分布分布）符合大变化命中试验（表示）的反应时间 ，但受到上述约束的约束： 　　这种方法是我们将离群检测用作无效模型的保守性。如果没有立即遵循最大的变化
，那么延迟将被高估，从而导致拟合的异常检测模型显示出长时间的依赖性 ，这些依赖性通常与证据积累策略（如集成）相关 。因此
，错误地拒绝此无效模型的风险不会增加
。 　　对于最大的变化幅度，错过的试验主要反映了任务脱离接触 ，而不是典型的感觉/运动延迟
，因此在拟合延迟时间分布时被排除在外。根据隐藏的马尔可夫模式，脱离接触是大多数大变化试验的后验最有可能的状态（95.2％的大变化失误是在脱离接触状态下） 。 　　拟合决策参数
。随后使用整个数据集拟合决策参数（感觉噪声方差和决策阈值） ，并固定延迟时间分布。在一般情况下
，无法直接观察到决策和延迟时间，并将其边缘化为潜在变量 。选择决策参数以最大化观察到的响应数据的对数边际可能性： 　　对于命中和早期的舔试验（表示） ，可能是通过观察到的运动开始时间的响应的边际概率密度给出的
。对于小姐试验（表示），响应时间被视为右审查；它的确切值未知
，但已知超过试验中的最后一个时间点。因此，错过试验的可能性是由超出这一点的边际概率质量质量给出的 。 　　采样
。为了将鼠标行为与离群检测NULL模型进行统计比较 ，我们从适合每只鼠标的模型中抽样了10,000个合成数据集。对于每一量的兴趣
，将根据实际数据计算得出的值与从每个合成数据集计算出的值进行了比较，其中包括10,000个来自零分布的样本 。如下所示 ，为每只鼠标生成合成数据集。 　　每个试验都使用了实际数据中介绍的相同变更点和刺激幅度
。真正的刺激在小鼠反应的试验后结束
，如果没有舔，就会留下未知的未来值。通过从用于产生原始刺激的相同分布（对于每个合成数据集独立于）的相同分布中进行采样来填充这种缺失的刺激值 。 　　鉴于刺激 ，从上述的分布PD和Pδ中取样了决策时间和延迟时间
。这些数量的总和产生了一个合成的响应时间
，代表运动开始。 　　为了产生合成的舔时间，我们假设运动开始和舔之间的额外延迟是I.I.D 。跨试验
。因此 ，我们用实际数据中测得的移动延迟延迟进行了替换。通过在合成运动时间中添加采样的运动延迟来获得合成的舔时间 。 　　合成舔时间用于确定试验结果（HIT
，早期Lick，Miss）
。每个试验都被归类为：如果在变更期间发生舔 ，则命中；如果舔在变化点之前发生，早期舔；或者如果在变更期结束之前没有舔时会错过。 　　为了分析TF脉冲对早期舔概率的影响
，我们使用了用于神经质子记录的15只小鼠的训练数据 。在这里，我们仅使用小鼠达到任务熟练的会话 ，并且按照最终的训练协议（平均每只鼠标为77.5次）
。请注意
，这里的发作时间是通过吐出的舔lick的注册来测量的，而不是关于手稿中其他地方的Neuropixels记录会话的摄影分析。我们仅使用试验 ，即早在基线发作后至少2 s发生早期舔
，以降低冲动性舔对结果的影响 。 　　为了凭经验验证小鼠使用多种感觉证据来影响其在基线期间舔的决定，我们分析了早期舔概率如何受到TF脉冲之前的幅度和时间的影响。首先 ，我们测试了单个TF脉冲相对于平均基线1 Hz的偏差是否会使小鼠或多或少地在随后的0.2-1.0 s内产生早期舔
。为此
，我们将TF脉冲的大小（以八度）分离为15个箱，使每个垃圾箱包含大约相等数量的TF脉冲。为了计算给定幅度的TF脉冲后的特定时间 ，早期舔的条件概率
，我们发现了此类事件的实例（在所有鼠标上都以稳健的性能拉动了所有会话），并将其除以早期舔的总量（扩展数据图6C） 。为了计算TF脉冲对早期舔概率的总体影响 ，我们相对于早期舔发作（扩展数据图6D），总结了[-1
，-0.2] s窗口中的条件概率： 　　也可以写入：p（l | tf）= p0+Δp（l | tf），其中 　　并且可以认为是在不偏离平均基线TF值的情况下舔舔的机会水平
。 　　两种TF脉冲对LICK概率的经验效应是从行为数据以类似方式计算得出的。为了比较两个TF脉冲的测量效应与它们的预期效果 ，如果它们独立影响舔lick的概率
，我们根据单个TF脉冲对早期舔概率的经验测量的影响，计算了它们对早期舔概率的累积独立效应 。然后 ，两个TF脉冲之间的独立效应在它们之间延迟ΔTS
，则可以如下写入： 　　在哪里： 　　两种TF脉冲与两种TF脉冲的独立效应所预测的概率后的舔概率的偏差将表明脉冲之间的互动效果，如果小鼠利用感觉证据的整合 ，则应该预期
。为了测量行为结果与两个快速TF脉冲的预期独立效应之间的相对差异（图3D和扩展数据图6i）
，我们计算了： 　　在将此分析应用于离群检测代理数据时，我们仅从导致早期舔的试验中使用数据 ，这意味着该模型决定在基线期间和TF变更时期启动Lick。对于适合特定鼠标数据的离群检测药物模型
，我们在4,000个合成数据集（请参阅上面的部分）中对相同数量的早期舔试验进行了采样，因为该鼠标的所有行为会议中都存在 。然后将数据拉动到与不同小鼠相对应的所有模型中 ，并将分析步骤应用于上述小鼠数据的组合数据集
。重复该过程4,000次，以估计异常检测剂结果的非参数95％置信区间。 　　在进行急性电生理记录之前
，我们将小鼠习惯于电生理记录设置2-7天（取决于小鼠在电生理记录设置中的性能），以允许在电生理记录过程中最佳地表现小鼠 。 　　一旦将小鼠习惯录制设置 ，我们就在内部植入了一个或两个3毫米颅骨的录音室
，并在对侧半球中植入了一条不锈钢接地线，以及1.5％的异氟烷​​ ，以及甲状腺素（5 mg kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-1）和右右甲虫（2–3 mg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg-kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg-1）
。在手术期间
，将Kapton磁盘（激光微加工有限）放在每个颅骨切开术内的硬脑膜顶部。该磁盘的直径为0.5毫米，以蜂窝状形状排列为0.5毫米 ，以跟踪探针插入 。颅骨切开术和椎间盘上覆盖了杜拉格（剑桥神经科学）
，以保护大脑。然后将一个高1-2毫米的塑料围栏放置在颅骨周围，并用骨水泥围绕边缘密封
。最后 ，我们用可移动的塑料盖覆盖了塑料外壳
，以在杜拉格密封的颅骨切开术上形成一个刚性的物理屏障，以提供对记录会话之间记录准备的强大保护。在第一次录音会议进行之前 ，允许小鼠恢复24小时 。 　　使用Neuropixels 1.0探针（IMEC，比利时）进行电生理数据收集
，并使用基于PXI的系统（National Instruments）收集，并使用SpikeGLX（https://github.com/billkarsh/spikeglx）保存
。对于训练有素的小鼠 ，我们每只鼠标最多记录了13个会话（总共114个疗程（15只小鼠）插入167个探针）。对于未经训练的小鼠
，我们每只鼠标最多记录了9个会话（总共45个疗程（6只小鼠）的89个探针插入） 。插入之前，将探针浸入CM-DII（Sigma-Aldrich）中
。在每个会话中 ，我们一次最多插入2个探针。探针总是在冠状平面（相对于垂直轴10°和-15°）内以相同角度插入
，以帮助随后的组织学探针跟踪 。 　　在每个会话的开始时，我们在记录室上方取下了塑料盖 ，以暴露于杜拉格尔覆盖的颅骨切开术
，并使用微控制器（sensapex）以5-10μms -1插入探针（s）
。允许探针定居20分钟，以在整个录制过程中提高稳定性。在会话探针结束时 ，将探针（在15μms -1处）进行
，并重新设置录音室的塑料盖以保护记录准备 。 　　呈现刺激和监测行为的设置与训练小鼠的设置相同（请参阅“行为任务 ”）
。 　　首先，使用CATGT（https://billkarsh.github.io/spikeglx/#catgt）过滤电生理数据 ，并使用经过改进的公共平均参考（-dlbdmx flag）进行了修改的形式。 　　尖峰分类 。我们使用Kilosort2.065（https://github.com/mouseland/kilosort）在每个探针中尖到每个探针的电生理数据。为了最初选择进行进一步策划的单元，我们仅选择了由Kilosort2.0指定为“良好
”（基于跨率图污染）的单位
。 　　质量检查。对于我们训练有素的老鼠的电生理记录
，我们在Phy2.0（https://github.com/kwikteam/phy）中手动检查和策划了，Kilosort2.0指定为“好” 。对于我们在受过训练的老鼠中的录音中 ，这剩余的44,288个单位要进行手动检查和策划
，并在手动策划后保留了15,406个单元进行分析
。根据训练有素的鼠标记录的手动策展数据（请参阅“训练有素的小鼠的尖峰分组单元的手动策划 ”），我们建立了一系列启发式方法来创建单元自动策划（请参阅“未经训练的小鼠的尖峰分组单元的自动策划
”） ，并将其用于未经训练的小鼠中的记录。 　　训练有素的小鼠的尖峰单元手动策划 。我们根据跨绩效图污染了Kilosort2.0指定为良好的所有单元手动检查和策划了所有单元
。在Phy2.0中
，我们首先检查并合并了显然属于同一群集但已被Kilosort2.0分开的单元，或者以明显可分离的噪声污染的单位将噪声从信号中拆分。然后 ，我们将每个单元指定为五个类别之一： 　　我们的目标是从具有多单位活动的大污染的分析单元中删除
，在整个会话的整个过程中都没有记录，或者是由于记录信号中的伪影而导致的 。因此 ，我们使用上述第1-3类指定的单位进行了训练有素的小鼠的所有进一步分析
。 　　来自未经训练的小鼠的尖峰单元的自动策划。接下来
，我们使用单元的手动名称来建立一组标准，用于自动检测我们将通过手动策划包含的单位 。根据上面的手动策展数据 ，我们确定了以下7个标准，以考虑一个有益于分析的单元： 　　发射率标准： 　　这些标准选择了大约90％的单位
，我们将用手动策划指定类别1（完美或几乎完美）或2（可用且良好的信号）（可用且良好的信号），并排除了大约85％ ，我们将指定为4（漂流/突然的损失）或5（噪声）和手动策划
。 　　这种自动选择的单元用于选择单元以从未经训练的小鼠录制中进行分析
，并在20,292个“良好” kilosort2.0单元中产生6,215个单位。 　　时钟拖式校正 。使用SpikeGLX中的同步选项记录了每个媒体和国家仪器（NI）采集卡的共享1 Hz方波信号。通过共享方形波信号，通过TPRIME（https://billkarsh.github.io/spikeglx/#tprime）纠正了从NI采集卡记录中提取的不同探针和从NI获取卡记录中提取的行为事件之间的时钟漂移
。 　　使用两个Chameleon3摄像头（CM3-U3-13Y3M-CS ，Frair）获得了前面（100帧S-1、640×512像素）和侧视图（50帧S-1 、976×1,024像素）的高速摄影。这些视频以8位灰度格式获得 。在每个获得的框架接触时
，摄像机被配置为将TTL信号发送给国家仪器PXIE板
。这些TTL信号用于将框架时间与行为事件和峰值时间的时间保持一致。 　　为了估算学生的大小，我们训练了DeepLabCut66 ，以使用侧摄像头获得的视频来跟踪学生的大小和位置 。该模型经过训练
，可以跟踪围绕小鼠瞳孔的12点
。为了评估模型性能，在训练后 ，对未用于培训的会话的视频进行了测试。估计学生的大小是椭圆形的最佳拟合面积
，可与学生周围的12点保持拟合 。 　　为了计算运动能量，我们主要使用了使用前置摄像头获得的视频来访问更精细的时间分辨率（除了2个会话外 ，由于技术原因，我们使用了Side Camera Video中的下颌ROI）
。为了估计运动的开始时间
，我们使用了鼠标脸上围绕的ROI，尽管从侧摄像头的下颌或晶须垫ROI获得了几乎相同的结果（数据未显示）。运动能被定义为平方框架到框架像素值差的总和 ，除以ROI内的像素数 。 　　为了找到口面运动的发作时间
，我们想估计运动能信号的典型噪声水平，并找到信号与噪声波段显着偏差的时间点
。作为第一步 ，我们计算了在围绕Lick登记时间围绕的2-S窗口中运动能值的分布。接下来
，我们拟合了高斯分布的混合物，其目标是捕获舔过程中运动能值方差的贡献以及由于噪声的贡献 。三个高斯分布的混合物效果很好 ，可以在所有课程和小鼠中拟合数据。运动的存在的阈值定义为平均值加斯的两个标准偏差
，其平均值与高斯混合物的最低值
。 　　最后，为了找到运动时间的时间 ，我们从压电信号舔舔式注册的时间后向后看。运动能量的第一个实例之前的时间点低于上面定义的阈值
，被认为是口面运动的开始时间 。 　　为了鉴定记录探针的位置和单位位置在小鼠大脑中的分配，我们遵循了类似于参考的协议
。67。 　　末端给药后 ，将小鼠用磷酸盐缓冲溶液（PBS）灌注，然后是4％多聚甲醛（PFA）溶液 。我们在4％多聚甲醛中将大脑固定在大约5 C时至少24小时
。固定后
，大脑在成像之前将大脑移至PBS至少12小时。为了进行成像，将大脑嵌入5％琼脂糖凝胶中 ，并安装在显微镜物镜下的振动组切割阶段 。大脑使用串行段二光子显微镜成像68
。显微镜由Scanimage Basic（Vidrio Technologies）和自定义软件（bakingtray（https://github.com/sainsburywellcomecentre/bakingtray）控制）。使用自定义软件（https://github.com/sainsburywellcomecentre/stitchit）将图像缝合到大脑的完整3D渲染中） 。我们以x的分辨率为x：大约2μm
，y：约2μm，z：20μm ，用920 nm的两光子激光器（样品下的100-150 mW功率）对整个大脑（从嗅球到脊髓的开头）进行了成像
。我们将大脑切成40μm的切片
，并在每个40μm的截面后成像2 Z-planes（约25μm和距组织表面约45μm）。两个PMT，一个用于捕获绿色（带通滤波器ET525/50 m）和红色（带通滤波器ET570LP）荧光的荧光获取了随后用于分析的数据的2个通道 。 　　在图像处理之前 ，我们使用自定义软件（https://github.com/stevenjwest/brainregister）将显微镜图像缩小到10μm的体素中
，并将大脑注册到标准化的Allen Comman Concom坐标框架（Allen CCF69））。然后，我们使用自定义软件（lasagna（https://github.com/sainsburywellcomecentre/lasagna） ，我们在3D中手动将每个神经蛋白探针通过大脑中的大脑追踪
。最后
，我们评估了单个神经质子通道的整体点火率和LFP光谱，并将其与Atlas位置进行了比较。在需要的情况下 ，我们手动调整了沿探针轨迹的大脑区域的缩放，以使通道上的响应与使用自定义软件（Ephys Alignment Tool（https://github.com/int-brain-brain-lab/iblabps/tree/master/master/atlaselectrectrophysiolyology）相关联） 。从具有平均波形的绝对峰值最大的通道位置估算单位位置
。对于所有分析
，我们将大脑区域所有细分的单位组合在一起（大脑区域的所有细分（脑皮质，背侧和腹侧层层）作为ACAD和ACAV ，在某些情况下在功能上相似的大脑区域
，请参见补充表1和2）。 　　仅分析了至少40个单位的大脑区域 。TF响应单元的特定分析仅针对≥10个此类单位的大脑区域进行
。未进行进一步的样本量计算。单位质量和稳定性的手动策划是在没有记录的大脑区域的情况下完成的 。随后的分析管道以相同的方式应用于所有适用的大脑区域的数据，但是分析的自定义性质阻止了研究人员对脑区域或数据集类型的身份（训练有素的小鼠与天真小鼠）保持视而不见
。 　　模型。我们将50毫秒垃圾箱的神经活动（与每个TF脉冲的持续时间相匹配）与试验开始 。然后 ，我们拟合了Poisson广义线性模型
，以预测试验到试验的神经活动，这是一组试验中存在的时间展开的与任务相关的预测指标的函数
。每个预测变量均在时间上扩展和/或在50毫米离散的步骤（与神经活动binning匹配）中发布预测变量的时机 ，并在预测变量周围估计每个时间步长的独立权重。我们使用19个与任务相关的预测指标预测神经活动： 　　（1）基线期间的TF波动（内核长度：0–1.5 s）;（2）试验开始（0-1 s）;（3）自基线启动以来（从试验开始到变化开始的1 s）；（4-9）六个变化的发作（每个变化大小（0-2 s）的单独预测指标）;（10）舔制剂（舔之前-1.25-0 s）；（11）舔执行（0-0.5 s后舔）;（12）空气泵（0-0.25 s）;（13）奖励（0-0.4）;（14）流产（-1.25–0.25）;（15）向上漂移的光栅阶段（从0–360°）;（16）向下漂移的光栅阶段（从0–360°）;（17）视频运动能量（-0.05-0.8 s）;（18）跑步车轮运动（-0.05-0.8 s）;（19）瞳孔直径（-0.75–0.75 s） 。 　　我们将模型与L2（Ridge）正则化拟合
，该模型用GLMNET71（α= 0）实现的周期性坐标下降进行了优化。我们在90％的数据上训练了每个神经元的模型，并在10％的数据上进行了交叉验证 ，并在十倍的交叉验证中迭代了预测
。在训练数据集中
，我们使用十倍的交叉验证调整了L2正则化项。 　　识别编码TF，Lick预备活动和/或LICK执行活动的单位 。To identify which cells significantly responded to a predictor of interest (that is TF fluctuations during baseline, lick preparation epoch, or lick execution epoch), we first re-fitted reduced models similar to the full model on 90% of the data, with 10-fold cross-validation, except we removed a predictor(s) of interest: (1) For identification of TF-responsive units, we estimated a model where we removed the predictor估计基线期间对TF波动的响应
。（2）为了鉴定具有舔舔动作活性的单位 ，我们估计了一个模型，其中删除了预测变量
，以估计导致舔的活性。（3）为了识别响应舔舔执行的单位，我们估计了一个模型 ，在该模型中
，我们删除了舔舔过程中的预测变量估计活动，预测指标通过视频捕获的运动能量估计活动调制以及通过运行车轮运动估算活动调制的预测变量 。 　　For each 10% test set, for each neuron we then calculated the mean actual peri-event time histogram (PETH) as well as the mean predicted PETH of both the full model and the reduced model for the following types of events: (1) −0.15 to 0.75 s around fast and slow TF pulses (that is, TF values 0.5 s.d. from the mean TF during baseline);（2）在早期舔进场之前-1.5至0 s；（3）0至0.4 s后发作
。 　　如果满足两个标准 ，则认为一个单元在基线周期内显着编码TF脉冲：（1）平均Pearson的平均Pearson相关性预测（跨K-折）（跨K-折）的合并平均均值快速和慢的TF脉冲响应（即
，平均快速的TF TF脉冲和平均快速的TF TF脉冲和平均慢速TF脉冲响应彼此减去）> 0.2> 0.2;（2）如果减去降低模型的预测TF响应后，没有TF波动预测指标（即残余预测） ，对TF响应进行了交叉验证预测
，则是显着的（P< 0.01 (t-test), n = 10 independent cross-validations). A unit was considered significantly encoding lick preparation if (1) the mean Pearson’s correlation prediction of the full model (across k-folds) of the mean activity leading up to a lick (−1.25 to 0 s) was >0.2;（2）如果减去降低模型的预测平均活性的跨验证预测，而没有舔液的核（即残余预测）是显着的（P< 0.01 (t-test), n = 10 independent cross-validations). Finally, a unit was considered significantly encoding lick execution if (1) the mean Pearson’s correlation prediction of the full model (across k-folds) of the mean activity following a lick (0 to 0.25 s) was >0.2;（2）如果减去降低模型的预测平均活性的跨验证预测 ，而没有舔液的核（即残余预测）是显着的（P< 0.01 (t-test), n = 10 independent cross-validations). 　　Focality index. To assess how distributed TF encoding was across brain areas, before and after learning, we computed a focality index (F) (similar to Steinmetz et al.3) of the TF encoding: 　　where pa is the proportion of neurons in an area that is encoding stimulus TF during the baseline period. If all TF encoding neurons were confined to a single area, this measure would take on the value of 1. If encoding was perfectly distributed across all areas recorded this measure would take on the value 1/Nareas. In order to compare between untrained and trained mice, we identified the common areas which had more than 40 units recorded in both trained and untrained mice. This left N = 24 areas from which to estimate the focality index. We estimated 95% confidence intervals and P values by bootstrapping the neurons included in the estimation 10,000 times with replacement. 　　Peak time and width of GLM estimated TF kernels for TF-responsive neurons. To investigate the peak time and width of the GLM estimated TF kernel for assessing how sustained responses to TF fluctuations were based on GLM weights, we first identified the absolute peak value of the TF kernel; because the GLM was based on 50 ms binning of spike counts, peak times for the GLM TF kernel was in 50 ms resolution. In cases where the absolute peak position within 1 s was a negative weight, we flipped the kernel in order to calculate the width. We then estimated the full width at half maximum (FWHM) of each TF kernel around its peak using findpeaks in MATLAB. For each area, we calculated the median peak time and median FWHM across all TF-responsive units. 　　Ramping differences in GLM change kernels. To test how neurons accumulated evidence when they were presented with a rewarding sustained change in stimulus speed, we tested how the slope of the visual evoked ramping activity following a change onset was dependent on the amount of evidence (change size) being presented. To isolate the visual component of the activity following change onset, we used the GLM kernel which fits the activity following change onset until change offset, while linearly taking into account other variables which may contribute to activity such as pupil size, preparatory activity and movement-related activity (see Model). 　　We estimated the mean change kernel for each change size for TF-responsive and non-TF-responsive units separately for each area. In cases where responses to fast TF pulses were negative, we flipped the change kernel so every unit had responses aligned to positive fast TF pulses—this allowed the mean to capture the visual evidence activity ramp irrespective of sign. We then identified the time point for each change size where the change kernel reached 50% of its maximum weight (To control for noise fluctuations in kernel weights, we approximated the 50th percentile crossing by taking the mean time point of the 33.33rd percentile, 50th percentile and 66.66th percentile crossing). We then calculated the degree to which activity ramping time scaled with change size, by regressing the 50th percentile crossing against change size. We estimated the non-parametric 95% confidence intervals and P values of the relationship between change size and 50th percentile crossing (that is, ramping time/change size) by bootstrapping with replacement (10,000 times) the neurons went into the mean change kernels, and then estimating the slope of the regression for each bootstrapped mean change kernels. 　　Identification of TF pulse outlier events. Fast TF pulse was defined as TF fluctuations larger than 1 s.d. of baseline TF fluctuations (in log2 scale) above the mean TF value (TF >1.19 Hz）。同样
，慢速TF脉冲被定义为低于0.84 Hz的TF波动 。 　　为了计算对TF异常值事件的平均响应，我们仅考虑满足以下标准的TF异常值事件： 　　这些标准的目的是排除基线发作 ，运动或准备活动对TF脉冲反应的影响
。 　　TF脉冲诱发活性的峰值时间和宽度的估计。对于通过上述GLM分析定义为TF响应的每个单元，我们使用基线期间发生的异常事件计算了对快速脉冲的平均响应
，并满足了上面概述的标准 。此外，我们计算了[-0.5 ，0.5] S.D.内的TF脉冲的平均响应
。基线TF波动的。该过程的目的是捕获某些单位表现出的连续活动坡道
，并排除了它们对TF脉冲响应形式的影响 。除非明确说明，否则我们将此基线响应的减法用于所有TF脉冲响应分析。 　　接下来 ，对于基线对快速TF脉冲的平均响应
，我们计算了其峰值时间，这是距离脉冲开始1 s内的最大绝对变化速率的时间 ，以及相应的半峰宽度
。 　　多个TF脉冲的整合。因为TF波动中的噪声是随机的
，所以有两个快速脉冲发生，以一定的延迟隔开 。为了研究TF脉冲的整合 ，我们发现事件的实例
，其中两个快速脉冲发生在第一次延迟和第二次发作之间的给定延迟下，还满足了上面概述的排除标准
。与此类事件排列的平均响应被认为是对两个快速脉冲序列的响应。 　　为了计算大脑区域内所有TF响应单元的平均响应 ，为了避免在不同符号的响应之间平均，我们将单个单位的响应符号翻转为单个快速脉冲后显示活性下降的响应符号 。用于计算响应的Z分数
，平均值和S.D.从第一个脉冲开始之前的0.5 s估计
。 　　第二个快速脉冲的促进。首先，我们测量了大脑区域内TF响应单元群体中的Z得分响应的平均水平 ，以进行单个快速的TF脉冲 。然后
，我们计算了该响应（R1Fast）的峰值和相应的峰时间
。为了找到对两个快速脉冲（R2FAST）序列的响应的大小，我们发现了一个时间点 ，从第二快速脉冲开始时
，与单个快速脉冲的响应的峰值时间相同，并在该时间点围绕该时间点的100毫秒内找到了响应的峰值。对快速脉冲序列的相对促进定义为 。 　　为了确定该分析结果的置信区间 ，我们在TF响应神经元中以替换（2,000次）进行了置换
，并重复了上述每个神经元样本的分析
。阴影区域表示所得分布的2.5和97.5％。 　　为了研究变更对准（图3）或击中舔舔活动（图5）活性，我们为每个单元计算了平均Peth的z得分 。使用平均值和S.D进行了Z得分。从变化开始前2 s期间的活动估计
。 　　对于图5所示的分析 ，对于每个大脑区域
，通过在每个时间点计算一个单位的一部分，具有大于显着性阈值的绝对值（与P 2.576的显着性阈值（对应于P相对应） ，可以测量一组内显着活跃单元的比例（即TF响应性）。< 0.01). Additionally, we subtracted the ‘baseline’ level of activity calculated within [−2, −1.8] s before hit-lick onset, which for a few brain regions was larger than chance level likely due to non-normal distribution of firing rates or a small number of events used for estimation of the mean and s.d. The confidence intervals were estimated by bootstrapping with replacement (5,000 times) across TF-responsive (or TF non-responsive) neurons and repeating the estimation of fraction of significantly active neurons for each sample of neurons. 　　The latency of activation of TF-responsive or TF non-responsive populations was defined as the earliest time point following which within a 100-ms window for at least 80 ms: (1) the lower 95% confidence interval of fraction of active units was above zero; and (2) the mean fraction of active units was above 0.1. 　　The latency of significant difference in activation between TF-responsive and TF non-responsive populations was estimated as the first time point where within a 100-ms window for at least 80 ms the confidence intervals of the difference in activation were above zero. 　　The latency of significant difference in activation across all units in each brain region (Extended Data Fig. 9a) was estimated as the first time point where within a 100-ms window: (1) the lower 95% confidence interval of fraction of active units was above zero; and (2) the mean fraction of active units was above 0.05. 　　We binned the neural activity into 50-ms bins (same binning was used in ref. 23). We then calculated the temporal autocorrelation (20 lags = 1 s) of spike counts using Pearson’s correlation in the inter-trial intervals between −2.5 s to −0.5 s prior to trial onset for each neuron (in this period mice were seeing a grey screen, and trained mice had to remain stationary for at least 3 s for the trial to begin). 　　To determine the intrinsic timescale for each area, we fit an exponential decay function to the mean autocorrelation function of all the units recorded in the area. For single-neuron analysis of relationship between intrinsic timescales and TF width, we estimated the autocorrelation for each TF-responsive neuron separately. For areas or neurons with autocorrelation functions with non-monotonic decay, we fit the exponential decay from the part of the autocorrelation where monotonic decay was happening (in a subset of areas this would mean offsetting the fit 1–3 time bins). Finally, we calculated the τ (that is, the intrinsic timescale value) of the exponential decay (accounting for offset where necessary). 　　We assessed the similarity of TF responses and lick preparation activity across TF-responsive populations in each area by estimating the Pearson’s correlation of mean firing rates (within a 50-ms window around the mean activity peak time across neurons within the each area) following fast TF pulses (that is, >1 S.D.TF值）及其在早期舔之前的平均活性[-0.3至0 s]（通过从TF响应和LICK准备活动中减去基线射击率来归一化射击率后） 。我们通过替换（10,000次）神经元进入相关性来估计非参数95％置信区间和P值
。 　　对于位于给定大脑区域内但没有必要记录的所有单元，我们首先计算了给定试验类型的平均神经反应（对于图6B – H：弱TF变化（1.25和1.35 Hz）（1.25和1.35 Hz）的命中试验（1.25和1.25和1.35 Hz）
，[−2，1.5] s时窗口）。仅使用更大或0.4 s的命中发作时间的试验 。该分析中排除了少于10次试验的课程的神经元
。发射速率计算为在10毫秒中平均的尖峰计数 ，并通过30 ms s.d的双面高斯卷积平滑。将平均神经反应合并为具有神经元×时间尺寸的触发速率矩阵（但也请参见交叉验证部分） 。 　　神经数据是按照以下方式进行的：首先
，为了限制高射击单元的主要影响，我们对每个神经元的发射率应用了软性正常化 ，因此具有强烈反应的神经元接近统一响应范围的神经元
。常数7被选为所有单元的点火率范围的大约20个百分位数。其次
，通过在每个时间点减去每个神经元活性的平均值以及在所有神经元中的平均活性中的平均值，以平均为中心 。 　　我们首先使用了参考文献中使用的方法
。33。在那里 ，作者正式化了一种方法
，可以在PMD/M1中的活性低维表示与定义运动子空间的肌肉EMG数据之间进行线性映射 。相对于该子空间的零空间形成了一组正交的维度集，可以在不直接影响运动执行的情况下占据活动。为了扩展对我们数据的分析 ，我们使用了Orofacial Motor和前核（V
，IRN，SPVI和SPVO）的综合记录 ，作为涉及舔舔的肌肉肌肉活动的代理
。尽管GRN的记录也可以包括在该组中，但我们将其分开以允许将人口分析应用于该地区
，因为（1）我们仅记录了大量从该地区记录的单位；（2）它是髓质中唯一的核心，具有高于TF响应单元数量的次数 ，需要单独的分析。 　　我们认为可能在每个大脑区域的运动子空间上进行映射 。我们的理由是：存在几种平行的神经途径
，可以驱动从原发性运动皮层，基底神经节 ，小脑或中脑输出区域驱动口面核神经元的活性56,57,72
。因此
，这些区域内将映射到运动子空间的活动模式可能在舔脚的执行中具有因果作用。但是，通常 ，这些信号也可能是由于全球播放的运动传动力引起的3,5,9（图1K
，L） 。仅仅将这两种可能性与我们的数据区分开来，因此将活动映射到运动子空间上并不一定意味着大脑区域与舔舔的执行有关
。话虽如此 ，我们在大多数早期的视觉区域
，嗅觉区域和海马输入区域（扩展数据图10A）中没有发现良好的映射到运动子空间上，这表明在所有大脑区域都不可能使用映射到运动子空间。 　　在运动子空间上的映射定义为： 　　在某些情况下 ，分别在Orofacial Nuclei组和目标脑区域内的活动的活动（对主要成分的投影（通过SVD MATLAB函数）的投影（通过SVD MATLAB函数）分别为何处，W是线性映射操作员到运动子空间 。 　　在找到线性映射之前
，我们还通过从舔发发作中[-2，-1.5] s内的平均值中减去主组件上的跨投影的初始状态
。此步骤避免了在线性拟合中使用截距的需求 ，并简化了对主组件和运动/运动无效尺寸的投影的可视化。仅使用围绕舔发作周围的口面核[-0.1
，1.5] S的时间周期映射 。这样，我们就不会从线性拟合本身的定义上排除运动维度上的准备活动的存在
。使用MATLAB函数LSQNONLIN的线性回归发现了对运动尺寸的线性映射。 　　相应地 ，Wnull是W的空空间
，并使用MATLAB函数无效 。我们使用了两个顶部核活性的主要主要成分（捕获了总交叉验证方差的61％；扩展数据图10a，b）和4个目标大脑区域中活性的最高主要成分 ，以找到W和WNULL操作员（参见扩展数据的扩展数据图10b – d）。这种选择导致运动和运动空间是二维的
。我们还确保这些操作员的规范是平等的
，以便使运动和运动无子空间之间的比较公平。 　　由于运动无子空间中特定维度的定义是任意程度，因此我们通过在移动无效子空间内找到旋转来定义第一个运动无效维度 ，从而最大程度地提高了该维度在Lick发作之前由该维度捕获的方差量 。然后
，第二个移动空的维度仅与运动无子空间中的第一维正交
。这主要用于简化可视化，使用每个子空间中的两个维度进行了所有与子空间相关的分析。 　　选择了运动尺寸的正方向 ，以使lick发作[-2，0.5] S内的口面核活性的投影的平均值为正 。选择了运动无尺寸的正方向
，使得在舔舔发作的[-2，0] s内活动的平均值值为正
。 　　t时刻t的相对子空间占用率定义为 　　其中enull（t）和EM（t）是移动空和运动子空间内的欧几里得距离 ，在当前时间t的神经状态与初始时间点（舔发作前2和1.5 s之间的平均值）之间测量。接近零的值表示子空间之间的同等占用率
，正值表明运动无效子空间的优先占用率 。峰值差异占用率（扩展数据图11a，b）被定义为 　　我们将对主要主要组件的预测分解为TF响应和TF非反应单元的贡献之和
。为此 ，我们将每个单元的身份知识作为TF响应或TF非反应性
，并写下了主要成分u（来自触发速率矩阵n = usvt的单数值分解（SVD））的总和为： 　　其中UI是ITH单元的负载。 　　因此，对主要组件的预测可以写为： 　　将方程式（3）替换为等式（1） ，将投影在运动维度上为： 　　而且
，相应地，关于运动无尺寸的预测写为： 　　然后 ，在运动和运动中t的运动无子空间中TF响应单元的相对贡献如下： 　　如果第二个乘法项可确保贡献的符号相对于每个子空间内的尺寸定义的正方向（见上文） 。 　　为了测试TF响应单元的贡献是否比全体人口的统一贡献所期望的要大
，我们反复选择（2,000次）（2,000次）单位数量与整个人群中的TF响应量相同，并计算出其对运动和移动效果的贡献 ，如上所述
。 　　除了上述分析外，我们还检查了TF响应单元的上述贡献是我们使用的归一化方法
，还是反映了其活性与运动无效子空间内活动模式的更好对应的结果。为此，我们研究了沿着第一个运动无效尺寸的负载分布 - 这些尺寸捕获了那里的大多数准备活动 。我们发现 ，TF响应单元对预备活动的贡献高于该维度的绝对值比其他人群具有更大的载荷绝对值（扩展数据图11d
，e）。 　　由于我们的分析集中在表征平均神经反应上，因此我们使用的交叉验证程序旨在测试平均神经反应的稳定性及其在试验中相应的低维度
。为此 ，我们将试验分为两个随机分配和同等大小的组（拟合和测试试验）
，并计算了每组试验的平均神经反应。接下来，我们将来自同一大脑区域的神经元的发射速率（但不一定同时记录）为关节基质 。在应用上面概述的预处理步骤后 ，我们有两个来自FIT和测试试验的点火率矩阵
。 　　对于交叉验证的PCA（扩展数据图10A）
，我们在第一个（fit）矩阵上应用了SVD，并测量了从第一个矩阵中发现的SVD组件的重建来预测其余（测试）矩阵的效果。同样 ，使用测试数据进行了主要主要组件上的活动投影（扩展数据图13）
，并投影到从拟合数据中发现的主组件上 。 　　为了进一步分析运动和运动无子空间，我们在每个矩阵上分别应用了SVD ，并在前四个主要主要组件上发现了它们的投影
。然后，我们使用拟合试验数据的低维表示
，将线性映射W和Wnull在运动和矩空子空间上找到。最后，我们应用了从拟合数据发现的W和Wnull到测试数据的低维表示 。该过程重复了2,000次 ，图6中所示的95％置信区间说明了测试数据预测的2.5和97.5％
。由于投影的迹象是任意定义的
，因此我们还基于每个抽签的特征向量的符号的电势，这是基于哪个方向更好地与从完整的触发速率矩阵计算的特征向量对准的 ，而没有分解为拟合和测试试验。 　　对于每个大脑区域
，我们构建了对快速TF脉冲的所有单元响应的触发速率矩阵（或每个单元对不同类型的TF脉冲的时间响应在图6i，k-M中显示的分析） ，并使用了如上所述的相同的预处理步骤 。使用上述命中活动的分析（使用命中率响应的完整射击速率矩阵
，而没有分解为拟合和测试试验的全部触发率矩阵，就可以完成对运动和运动无效尺寸的投影
。预测一致性的交叉验证是通过随机选择TF异常值事件的一半 ，计算每个单元的这些事件的平均点火率
，应用上述步骤以查找投影并重复此过程2,000次。对于将不同大脑区域组合成一个共同组的分析，将这些大脑区域的所有单元合并为连接的点火速率矩阵 ，并应用了上述步骤 。 　　将快速TF脉冲响应与运动或运动无动作子空间中给定维度的比对作为在目标维度的投影与TF脉冲响应的4维矢量（2个运动和2个运动无效维度）之间的余弦计算，该余量是在最大欧几里得距离范围内的最大euclidean距离的最大距离范围内的0.75 s pulses of pulses of pulses of pulses of pulses of pulses ofer pulses的最大距离。同样
，为了计算沿第一个运动无效尺寸的对不同TF脉冲的响应的缩放，我们发现了从第一个TF脉冲开始的0.75 s窗口内的初始状态的最大欧几里得距离的尺寸
。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。