人的眼睛是通过快速尸检计划或犹他州默里的狮子眼库从马萨诸塞州综合医院的死亡中位数中位数获得的 。犹他大学机构审查委员会（协议IRB_00010201）或哈佛大学的人类研究主题委员会（Dana Farber/Harverd Cancer Center第13-416号）批准了验收和使用人类组织样本，并批准了人类人类人类基因组研究所政策 。所有捐助者均被证实没有眼部疾病或眼内手术的史证据。根据IRB协议 ，获得了所有捐助者的知情同意 。猪 ，牛和绵羊的眼睛平均在马萨诸塞州西格罗顿的一辆屠宰场死后1小时获得 。其他动物眼睛是从加州大学（Ferret），加利福尼亚理工学院（Tree Shrew） ，哈佛大学（Peromyscus） ，MIT（Marmoset），NIH（Squirrel） ，英国曼彻斯特大学（rhabdomys）（rhabdomys） ，乔治亚大学（Lizard）和加州大学Los los los los ancoss（Lose）（langey and lomprey losy losy losy losy noce）的动物殖民地获得的。在可能的情况下包括两性动物 。在美国进行的动物实验得到了每个位置的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准 。根据《动物》，1986年的《科学程序法》（英国）收集了横腹组织 ，并由曼彻斯特大学伦理审查委员会批准。
在扩展数据图中 ，每个物种都指示使用的动物数量，测序的生物学重复和高质量的细胞或核的数量 。1和3–6 。补充表1中指示了每个物种中每个类别中恢复的细胞或核的数量。另请参见“统计和可重复性”。
为了分离细胞核，将冷冻的视网膜组织在1 ml裂解缓冲液中均质均质 ，该缓冲液在含有10 mM Tris ，1 mm CaCl2，8 mM MGCL2的溶液中由0.1％NP-40组成0.02UμL -1 DNase（D4527 ，Sigma Aldrich） 。均质组织通过40 µm细胞过滤器 。将过滤的核以500 rcf颗粒固定5分钟 ，重悬于染色缓冲液中（Tris碱基缓冲液中的0.02％和2％BSA），并用抗Neun染色（1：300 ，Sigma fcmab317pe或Mab377a5）和vcmab317pe或abb377a5）和抗chx10（1：600：1：600 ，Santasanta，SantatantAna ，SantatantAntAtot）AF647）在4°C下持续12分钟。
染色后 ，将核离心，重悬于排序缓冲液中（Tris碱基缓冲液中的2％BSA） ，并用DAPI对抗（1：1,000） 。使用BD FACSDIVA v8.02（扩展数据图2A – C）将Neun+和CHX10+核分为单独的管 ，在500 rcf中再次沉淀5分钟，重悬于0.04％的非乙酰基BSA/PBS溶液中，并调整为1,000核的浓度 。在将核膜的完整性和非核材料的存在下进行 ，然后在光场显微镜（扩展数据图2d ，e）下进行评估，然后将其载入10倍铬单细胞芯片（10倍基因组学） ，其目标恢复为每个通道8,000个核。
按照制造商的协议 ，使用Chromium 3'V3或V3.1平台（10倍基因组学）生成单核库 。简而言之，将单个核分割成凝胶珠乳胶中 ，其中将进行核裂解和条形码的RNA逆转录以产生cDNA 。接下来是放大 ，酶促碎片和5'衔接子和样品指数附着，以产生最终文库。图书馆在哈佛大学的鲍尔核心设施的Illumina Novaseq上进行了测序 。测序数据通过细胞Ranger软件（版本4.0.0 ，10x Genomics）对排列并对齐 。
将全眼固定在4％多聚甲醛（以PBS）中固定1-2小时 ，然后转移到PBS中。将整个视网膜或8毫米的中央视网膜打孔液并在4°C的PBS中在PBS中沉入30％的蔗糖中，然后将其嵌入组织冷冻培养基中 ，并在低温恒温器中以20μm的冠状动脉裂开 。将切片安装到涂层幻灯片上 。将载玻片与室温下5％的驴血清（有0.1％Triton X-100）一起孵育1小时 ，然后与原始抗体过夜（1：500 rbpms（磷溶液1832-rbpms）; 1：400 CHX10（Novus Biologicals NBP1-84476）; 1:50 at and for 2 for 2 for for 400PBS在室温下的二级抗体。图像是在带有405、488 、568和647 nm激光器的Zeiss LSM 900共聚焦显微镜上获取的，并使用Zeiss Zen Software Suites进行处理。
我们使用CellRanger（V7.0，10X基因组学）按照制造商的说明来对齐SCRNA-SEQ和SNRNA-SEQ数据集 。对于每个物种 ，将测序读取被解复为不同的样本 ，并且将与每个样品相对应的fastq.gz文件对齐以参考转录组，以获得二进制对齐图（.bam）文件 。补充表5中列出了所使用的参考转录组。在每个样品的基因表达中都包括外显子和内含子读数 ，无论细胞或核的起源如何 ，我们都将速度为61应用于相应的bam.bam文件 。这为每个样品生成了两个单独的基因表达矩阵（GEMS）（GEMS）（基因×细胞），对应于“剪接 ”和“未填充 ”读取 。通过元素将这两个宝石求和 ，以获取每个样品的“总”宝石。对于每个物种 ，将来自不同样品的宝石组合在一起（列的串联）以产生一个物种的宝石 。
Analysis of the GEMs was performed in R. Our workflow was based on Seurat v4.3.0 for single-cell analysis developed and maintained by the Satija laboratory29,62 (https://satijalab.org/seurat/) and includes several packages used for statistical calculations and data visualizations including MASS v7.3.60, pvclust v2.2.0, reshape2 v1.4.4, stats v4.3.0,GGPLOT2 V3.4.2，Dendextend V1.17.1和GGDENDRO V0.1.23我们在此处描述了分析步骤 。我们还通过Zenodo（https://zenodo.org/record/8067826）和我们的github页面（https://github.com/shekharlab/retinaevolution）提供了分析脚本。
通过聚类程序分别分析了来自每个物种的数据 ，以鉴定高质量的细胞 ，并隔离主要细胞类（光感受器，双极细胞 ，水平细胞 ，无分细胞细胞，RGC和Müller神经胶质） 。简而言之，将来自不同重复的宝石组合在一起 ，并将每个单元格中的成绩单计数归一化为10,000的总库大小 ，并将对数转换（x→log（x+1）） 。我们确定了前2,000个高度可变的基因和应用主成分分析，以分解与这些高度可变基因相对应的子序列。使用对应于前20个主体组件的子空间 ，我们在数据上构建了一个k-near的邻居图 ，然后使用Seurat的FindClusters函数以0.5的分辨率参数聚类 。使用统一的歧管近似值63，使用相同的主成分将细胞嵌入2D可视化中 。2D嵌入仅用于可视化聚类结构和基因表达模式。
Each cluster was assigned to one of the six major retinal cell classes based on expression of orthologues of canonical markers characterized in mice25: photoreceptors (Arr3, Rho and Crx), horizontal cells (Calb1, Onecut1, Onecut2 and Lhx1), bipolar cells (Vsx1, Otx2 and Grik1), amacrine cells (Gad1, Gad2, Tfap2a,TFAP2B和TFAP2C） ，RGC（RBPMS ，NEFL，NEFM和SLC17A6）和MüllerGlia（Glul ，ApoE和RLPB1）。不进一步考虑映射到较低频率（例如内皮细胞或小胶质细胞）或含有低质量细胞的其他细胞类型的簇 。补充表1中指示了每个物种中每个类别的细胞数量 。我们注意到 ，由于许多实验旨在丰富某些类（RGC或双极细胞），因此相对频率不反映内源性值。
我们将每个物种内的光感受器 ，水平细胞 ，双极细胞和RGC分离，并使用以下步骤独立聚集它们 。按类子来亚设置后，具有异常高（>平均+2×s.d.）或低的细胞（90％的时间 。由于原型是集成数据聚类的结果 ，因此原型的数量取决于分辨率参数。我们改变了聚类的分辨率 ，并跟踪了聚类的原型数量，调整后的兰德指数（ARI）以及物种特异性的原型的数量 。双极细胞的原型在各种分辨率（0.4-1.5）中具有鲁棒性 ，如稳定数量的原型（16-21） ，ARI高值（0.88-0.96）（0.88-0.96）（如果任何物种特异性的原型）所示 。RGC原型在同一范围内对分辨率参数表现出更高的敏感性，簇的数量为26-46。对于超过1的分辨率值 ，在试验中始终观察到超过5个物种特异性的原型 。但是 ，在测试的值中，ARI值相当高（0.625-0.849） 。主文本中介绍的结果是分辨率为0.5。
我们使用三种替代整合方法重复了双极细胞的原型分析：Harmony67 ，Liger68和SCVI69 。这三种方法都产生了与Seurat的结果一致的结果 ，但是它们产生了几种其他物种特异性的原型，并且还不能解决双极细胞类型之间的一些已知区别 。因此 ，我们使用seurat获得了文本中提出的结果。
FLDA寻求来自具有多个分类属性的细胞的高维基因表达数据的低维分解 ，以使低维空间的每个轴捕获沿一个属性的变异，同时最大程度地减少与其他属性的共同变化。FLDA的基础数学推导在上一篇论文55中进行了描述，并在补充注释2中进行了总结 。在这项研究中 ，我们应用FLDA来分解携带三个分类属性的RGC的转录组数据：携带三个响应极性：响应极性（在VS OFF） ，响应动力学（Transient vs vs Sudceed）和物种（鼠标VS）（鼠标VS）（鼠标VS Pratimate） 。使用A，B和C表示这些属性 ，总基因表达协方差矩阵可以表示为：
总协方差矩阵在哪里 ，并且是由属性A，B和C分别解释的。是这些属性未解释的残余方差 。
FLDA识别单元的3D嵌入（U ，V ，W），使u最大化属性的方差a最小化属性b和c的差异 ，V最大化属性B的差异最大化属性b的方差 ，同时最小化属性c和a的差异，并最大程度地减少属性C的最大化 。通用特征值问题的解决方案。
这种方法的目的与FLDA相似 ，因为目标是识别捕获数据结构的基因表达空间中的轴 ，并且这些轴的选择是由通过笛卡尔对细胞类型的笛卡尔分类所施加的结构来指导的（例如，在vs Off或Primate vs vs小鼠上） 。主要区别在于，FLDA还试图捕获类型内部单元格之间的方差 ，这会影响复合轴U ，V和W的选择 。相比之下，GAGE仅寻求模拟所考虑的细胞类型的基因表达质心形成的形状。因此 ，对于四重奏的灵长类动物细胞类型（MGC OFF ，MGC ON，PGC OFF和PGC ON） ，在基因表达空间中形成某种形状 ，此方法询问是否存在形成相同形状的小鼠细胞类型的四重奏类型 。补充说明3中列出了该方法的数学和实施细节 。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。
本文来自作者[admin]投稿，不代表东辰文化立场，如若转载，请注明出处：http://www.mzwhys.cn/zlan/202506-2892.html
评论列表（4条）
我是东辰文化的签约作者“admin”！
希望本篇文章《脊椎动物视网膜中神经元细胞类别和类型的演变》能对你有所帮助！
本站[东辰文化]内容主要涵盖：生活百科,小常识,生活小窍门,知识分享
本文概览： 人的眼睛是通过快速尸检计划或犹他州默里的狮子眼库从马萨诸塞州综合医院的死亡中位数中位数获得的。犹他大学机构审查委员会（协议IRB_00010201）或哈佛大学的人类研究主题...