从巴西圣保罗的Quatá的甘蔗厂收集土壤样品，那里存储了20多年的残留甘蔗渣（图1A） 。机械地去除表面渣层后 ，从土壤表面和20 cm的深度收集样品
。这些样品称为甘蔗渣覆盖的土壤（SBS）。从附近的土壤中收集了对照样品
，而无需渣打 。将所有样品立即在液氮中冷冻，并在-80°C下储存直至进一步加工。 　　使用FastDNA自旋试剂盒（MP生物医学）从SB和大量对照土壤中提取微生物DNA
。用振荡的球磨粉（TE-350 ，TECNAL）将十克的土壤样品粉碎，并用于进行五个萃取批次
，每条2 g，导致五种单独的DNA提取物。然后将这些提取物转移到裂解基质E管中 ，将外部污染物用MT缓冲液溶解
，并添加磷酸钠缓冲液以进行细胞裂解 。使用FastPrep FP120仪器（MP生物医学）将样品匀浆
。将蛋白质沉淀溶液添加到上清液中，以使其与细胞碎屑分离 ，然后在14,000g下离心5分钟。然后将所得的上清液与结合基质混合
，将其孵育3分钟，然后转移到自旋滤镜中 。离心后（14,000g持续1分钟） ，用盐 - 乙醇溶液（SEWS-M）洗涤沉淀
，干燥并重悬于超纯水中
。使用PowerClean DNA清理套件（MO Bio Laboratories）进行进一步纯化。DNA质量通过0.8％（w/v）琼脂糖凝胶电泳评估 。 　　使用引物515F和806R，一式三份将16S rRNA基因的V4区域进行扩增
。使用Miseq Reporter软件在Brazilian Bioenewables国家实验室（LNBR）的高性能测序设施上使用Miseq Reporter软件在Illumina Miseq平台（V3套件 ，600个循环）上进行了配对端测序（2×300 bp）。Zymobiomics微生物群落DNA标准II是一个阳性对照 。为了进行分类分析
，配对末端读数通过FastQC V.0.12.0（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）进行质量检查，并使用Trimmomator44 V.0.36进行过滤 ，以删除适配器和低读数
。使用usearch v.10 package45（最小重叠为50 bp，最大误差为0.5）的FASTQ_MERGEPAIRS函数合并过滤波后的读取
，随后删除了引物和单胎序列。Uparse unoise3函数用于降解和ZOTU（零半径OTU）恢复 。使用SINTAX函数（截止0.8，RDP数据库v.16）进行分类学分配46。使用Rudio V.1.3.1093（https://bioconductor.org/packages/release/release/release/bioc/html/phyloseq.html）中的Thyloseq V.1.20包装进行进一步分析
。补充表15中描述了有关读数和多样性指数的详细信息。 　　使用Nextera库制剂套件（Illumina）构建宏基因组库 。使用定量PCR和KAPA库定量试剂盒（Roche）和Agilent Bioanalyzer 2100 System（Agilent Technologies）进行库的量化和质量控制
。使用HISEQ 2500控制软件在Illumina HISEQ 2500设备（2×250 bp）上进行测序。此外 ，使用Miniknow v.19.12.5软件在奴才设备（牛津纳米孔）上进行了长阅读测序 。对于长阅读测序
，使用SQK-LSK109和天然条形码套件制备SBS样品中1 µg的1 µg高分子质量DNA
。 　　原始的宏基因组序列通过FastQC V.0.12.0和Trimmomatic V.0.36进行了质量控制和修剪，然后使用Kaiju47 v.1.7.4进行分类分类。使用IDBA_UD v.1.1.1从头组装质量过滤的读数 ，并具有预校正和20-60的K-mer sizes48（补充表16） 。使用Metawrap V.1.349对所得组件进行了归纳
，从而生成具有Metabat2，Maxbin2和Concotct的初始垃圾箱集 ，然后进行改进和重新组装（最小完成为55％
，最大污染物最大污染15％​​）
。然后分类分类和使用模块分类和Annotate_BINS对垃圾箱进行分类和功能注释。此外，使用SSPace -Long -Reads v.1.1进行的牛津纳米孔技术测序的长期读取 ，带有参数：-k 5
，-a 0.7，-a 0.7 ，-x 1，-m 50
，-m 50，-o 20和-o 20和-n 1000 。最终的磁磁符合CheckM250 V.1.1.0.0.0.0.2和gtdb consectife数据库51版本214
。补充表2中总结了有关恢复的MAG的详细信息。使用Prokka52 v.1.11进行了基因预测和注释 。Cazyme和PUL注释遵循基于隐藏的Markov模型曲线和序列相似性的Cazy管道26。为了估计Cazyme基因丰度 ，使用Kallisto v.0.46.1绘制了具有QUANT函数53的Kallisto v.0.46.1的MAG基因集
，并且标准化的丰度表示为每百万（TPM）的转录本
。 　　使用UBCG54 v.3.0重建了回收MAG的系统发育特征，该V.3.0涉及标记基因鉴定 ，多个序列比对细化和串联以及使用MAFFT55 V.7.487和Raxmml56 V.8.2.12的系统发育。使用ITOL57 Web工具v.6.9.1可视化所得树 。使用GAPSEQ58 v.1.1和KEGG矫正注释重建回收的MAG中的代谢途径
。使用KOFAMSCAN59 v.1.3.0（E <1×10-5）分配酶委员会（EC）数字。蛋白质被注释为Cazymes
，但缺乏EC注释，其EC从使用Diamond60 v.2.0.14.152从CAZY数据库中回收的同一家族的特征性cazymes转移 。通过将宏基因组读取到Bowtie2（参考文献61）v.2.4.5并计算bin tpms（Samtools62 v.1.15.1）的binned序列来估计途径丰度
。将垃圾箱中预测的每条途径分配给其TPM ，总途径丰度是相关箱之间的总和。 　　来自木质纤维化液的蛋白质序列 。最初检索了滴虫巴西植物巴西属于最近发现的未表征和未表征的细菌门（GTDB数据库）
。使用HHPRED63 v.3.3进一步分析缺乏CAZE注释的序列
，并选择了与参与碳水化合物分解的蛋白质远程同源性（10-25％序列相似性）的序列，并选择了用于异源表达和生物化学测定的蛋白质（补充表3）。 　　八个选定的序列是针对大肠杆菌表达优化的密码子 ，并用N端6×His-TAG合成 。接下来
，将大肠杆菌BL21（DE3）细胞用PET-28a（+）表达载体中的靶基因转化
。在Luria -Bertani（LB）培养基（0.5％（w/v）酵母提取物，1％（w/v）类酮和1％（w/v）氯化钠）中生长转化体 ，在600 nm（od600 nm）下，在37°C下在37°C下生长。用0.4 mM异丙基β-1-甲状腺乳乙酰糖苷（IPTG）（Sigma aldrich）在18°C诱导蛋白质表达16小时 。通过离心（13,000g
，15分钟，4°C）收集细胞 ，并恢复在裂解缓冲液中（20 mM磷酸钠
，pH 7.4 、300 mM NaCl，5 mM咪唑 ，5 mM咪唑
，1 mM苯基甲基甲基硫基磺酰基氟化物（PMSF），25 U ml -1 turboease ，1.1 lysso – 1.1 mg ml -MgMl -MGML -MGML -MGML -gl -MGML -gl -MGM g m g M g m g M g m。ML – 1脱氧胆酸）
。然后将裂解样品以21,000g离心40分钟（4°C）。将可溶性蛋白裂解液加载到5-mL HITRAP螯合HP柱（GE Healthcare）上
，并使用咪唑梯度（最高0.5 m）洗脱6×His-TAG靶蛋白 。通过在HiloAD 16/600 SuperDex 75/200 PG色谱柱（Cytiva）上以20 mM磷酸钠（pH 7.4）和150 mm NaCl平衡的HiloAD 16/600 SuperDex 75/200 PG色谱柱（Cytiva），实现了进一步的纯化
。通过SDS -PAGE评估蛋白质纯度 ，并使用计算出的灭绝系数（ε280nm）在280 nm处测量吸光度来评估蛋白质浓度。 　　筛选重组蛋白（补充表3）的活性
，以针对一系列底物，包括多糖 ，寡糖和合成p-硝基苯酚衍生物（补充表7） 。通过将纯化的蛋白与底物孵育（多糖和合成底物的0.5％（w/v）或1 mm的底物在40°C下40°C的50 mM乙酸钠缓冲液（pH 5.0）中孵育1 mm
。通过使用3,5-二硝基水杨酸（DNS）方法来评估酶促活性对多糖的酶促活性64。对于合成底物，通过监测405 nm的硝基苯酚的释放来确定活性 。酶测定至少由三个独立实验组成
。 　　为了评估纯化蛋白质的潜力
，以提高T. Reesei Br_trr03纤维素酶鸡蛋的糖化效率27,28，我们使用蒸汽探索的甘蔗渣bagasse进行了糖含量实验 ，如“ lignocellosic biomass Pretepreatment ”部分。在筛查阶段
，对5％（w/v）的总固体和1 mg G – 1的酶鸡尾酒剂量进行了反应 。使用Combi-D24杂交孵化器（FinePCR），将40°C的反应在40°C的50 mM乙酸钠缓冲液（pH 5.0）中孵育24小时
。通过确定DNS方法释放的总还原糖来评估增强效果。糖化测定至少由三个独立实验组成 。 　　在Bioflo/Celligen 115系统（Eppendorf）中培养了T. reesei BR_TRR03菌株 ，以生产用于糖精促进筛选中使用的酶鸡尾酒28。培养培养基中含有20 g L – 1（NH4）2SO4
、1.0 ml L – 1 J647抗染料剂（Struktol）
，20 g L – 1全酵母细胞（干质量）和50 g L – 1总还原糖（TRS）
。用1.0 L培养基初始化生物反应器，包括用真菌孢子制备的10％（v/v）接种物。培养过程的控制如下：使用2 M磷酸和10％（w/v）氢氧化铵将pH保持在4.5±0.5；温度保持在28.0°C；以每分钟0.7标准升（SLPM）压缩空气提供充气；并使用搅动级联反应（400-1,000 rpm）来确保溶解的氧气保持在20％以上 。从25小时起 ，甘蔗糖蜜溶液（约350 g kg – 1 tr）具有1.0 ml L – 1的抗fifoaming剂
，以1.3 g TRS kg – 1 h – 1（基于速溶生物反应器质量）在收集前1小时，直到收集前1小时 ，从而产生非线性喂养曲线
。每24小时收集样品
，离心，上清液存储在-20°C下。最终的发酵肉汤用于糖化实验 ，蛋白质定量（Lowry方法，BSA标准）65和酶活性分析 。 　　使用SUPR 2G反应器（AdvanceBio Systems）在LNBR Pilot工厂预处理甘蔗渣和桉树残留物
。使用0.5％（v/v）在140°C下进行15分钟
，然后进行离心（1,610g，20分钟）以分离C5流。首先将桉树残留物在70°C下用0.4％（w/w）NaOH进行碱性脱乙酰化60分钟 ，然后在190°C下用0.25％（V/V）硫酸爆炸3分钟
，持续3分钟，并分离C5流 。所得预处理的甘蔗渣含53.4％的纤维素 ，33.3％的木质素和5.8％的半纤维素
，而预处理的桉树残基由61.5％的纤维素，33.8％的木质素和3.3％的半纤维素组成
。 　　使用逆PCR生成了Celoce变体（celoce（δ2-5）和celoce（F33A））。设计引物的互补序列长于15个核苷酸 ，TM为50°C（有关引物序列
，请参见补充表17） 。使用吉布森组装66对PCR扩增子进行循环
。将所得的质粒转化为大肠杆菌BL21（DE3）细胞，并按照与野生型酶相同的方案表达和纯化变体蛋白。通过Sanger测序证实了所有突变 。 　　CELOCE及其变体使用PET-28A（+）表达矢量没有6倍His-Tag ，在大肠杆菌BL21（DE3）中过表达。遵循与“基因合成
”
，异源表达和纯化部分所述的相同表达方案，可溶性蛋白质裂解物在5-ml HITRAP Q-FFF柱（Cytiva）上进行离子交换色谱法（Cytiva）
。用高达0.5 m的盐梯度洗脱CELOCE ，然后使用HILOAD 16/600 SuperDex 75 PG色谱柱（Cytiva）用20 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.4）平衡的尺寸 - 排斥色谱法（Cytiva），其中包含150 mm NaCl。为了去除多余的盐并防止沉淀
，使用HITRAP脱盐5 mL色谱柱（Cytiva）将蛋白质交换 。然后将CELOCE用亚矛式CUSO4掺杂以增强稳定性，然后使用Vivaspin Turbo浓缩剂（10 kDa分子量截止（MWCO） ，Sartorius）去除多余的铜
。为了排除污染的干扰
，包括三个独立的酶制剂，每种酶制剂从新鲜转换开始 ，包括以前未使用的纯化柱（补充图28）。在所有三种制剂中
，通过检测律酸（补充图29）验证了Avicel pH-101（Sigma Aldrich）的活性 。 　　进行了多角度光散射（SEC-MALS）实验的大小排列色谱法，以确定CELOCE及其变体的分子质量和寡聚状态
。简而言之 ，将100 µL纯化的蛋白质样品注入了与高性能液相色谱（HPLC）1260 Infinity II系统（Agilent）连接的SuperDex 200（10/300）分析尺寸 - 排斥柱（Cytiva）。用20 mM HEPES缓冲液（pH 7.4）对色谱柱进行平衡
，其中含有150 mm NaCl 。使用Dawn8八角静态光散射检测器和Optilab折射率监视器（Wyatt Technology）监测洗脱
。使用Astra v.8.1.2软件（Wyatt Technologn）对CELOCE及其变体进行数据采集和分子质量计算。 　　枯草芽孢杆菌Bacilysin生物合成蛋白（BACB，PDB：3H7J）序列是针对大肠杆菌表达的密码子进行了优化的 ，该序列用N端6×His-TAG合成
，并将其亚克隆到PET-28A（+）载体中 。接下来，将含有质粒的大肠杆菌BL21（DE3）细胞在37°C的LB培养基中生长至约0.8的OD600 ，然后在18°C下用0.4 mM IPTG诱导16小时
。通过离心（13,000g，15分钟
，4°C）收集细胞，如“基因合成 ，异源表达和纯化”部分中所述进行裂解和离心。使用“基因合成
，异源表达和纯化 ”部分中概述的相同方案和条件，使用镍亲和力和尺寸排斥色谱法纯化重组BACB 。 　　耶尔森氏菌小肠结肠菌亚种。Enterocolitica 8081 uronate代谢蛋白（KDGF ，PDB：5FPX）序列是针对大肠杆菌表达优化的密码子
，并用N端6×His-TAG合成
。该基因被亚克隆到PET-28a（+）表达载体中。KDGF的表达和纯化遵循“基因合成，异源表达和纯化”部分中概述的相同方案 。 　　如先前所述 ，生产枯草芽孢杆菌内to-β-1,4-葡聚糖酶（CEL5A
，GH5_2）
。简而言之，用0.5 mM IPTG诱导诱导后 ，在37°C的LB培养基中在LB培养基中的BL21（DE3）Slyd细胞中表达CEL5A。将收集的细胞重悬于裂解缓冲液（50 mM磷酸钠
，pH 7.4、100 mM NaCl，1 mM PMSF ，5 mM苯甲酰胺）中，然后用溶菌酶（80μgml -1
，30分钟，30分钟 ，冰）裂解 。将裂解液离心（10,000g
，30分钟），并将上清液加载到1 ml – 1 – 1的5 mL HITRAP螯合柱（GE Healthcare）上
。用0–500 mm咪唑梯度洗脱蛋白质。使用5 mL HITRAP SP HP柱（Cytiva） ，在1 mL min – 1的0-1 m NaCl梯度中实现了进一步的纯化 。在用50 mm磷酸钠
，pH 7.4，150 mm NaCl平衡的SuperDex 75 16/60色谱柱（Cytiva）上进行尺寸 - 排斥色谱法
。 　　与N末端6×His-TAG合成 ，将热甲甲维氏甲状腺terrestris terrestris terrestris terrestris terrestris terrestis terrestris terrestris terrestrisβ-1,4-葡萄糖酶（CEL45A
，GH45_1）40合成，并亚克隆到PET-28A（+）载体中。将含有质粒的大肠杆菌BL21（DE3）洗牌细胞在37°C的LB培养基中生长至0.8的OD600 。然后在18°C和180 rpm的16小时用0.4 mM IPTG诱导CEL45A表达
。通过在含有脱氧胆酸钠（60 mg L – 1的培养物） ，溶菌酶（20 mg l – 1的培养物）
，1 mM PMSF和DNase和DNase（20 µg ML – 1）中的溶解缓冲液中裂解收集的细胞，在缓冲液中的1 mM PMSF和DNase（20 µg ML – 1）中（20 mM磷酸盐 ，磷酸盐，pH 7.4
，pH 7.4，300 mmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmMMMMMMMMMMM。在冰上温和搅拌下孵育1小时后 ，将裂解液离心（21,000克
，45分钟） 。将上清液在5 mL hitrap螯合柱（Cytiva）上进行镍亲和力色谱法，以0-500 mM咪唑梯度洗脱6×His-Tag蛋白。最终纯化是通过用20 mM磷酸钠（pH 7.4）和150 mM NaCl平衡的HiloAD 16/600 SuperDex 200柱（Cytiva）上的HiloAD 16/600 SuperDex 200柱（Cytiva）实现了最终纯化
。 　　如先前所述 ，从真菌分泌组中纯化了来自T. resei（Cel7a
，GH7）的核植物水解酶。T. Reesei BR_TRR03分泌组件是在“用于筛查测定法的Trichoderma酶鸡尾酒生产
”部分中概述的 。使用0.45-μmPES膜通过Miracloth（EMD Biosciences）真空过滤该分泌溶液，并通过切向超滤（10 kDa MWCO）浓缩
。用20毫米Bis-Tris（pH 6.5）进行缓冲液交换以去除低分子质污染物 ，然后再进行另一个过滤步骤。将滤液调节至1.5 m（NH4）2SO4
，并加载到26/10苯基sepharose快速流柱上 。将未结合的材料用20 mM bis-Tris pH 6.5的80％洗净，其中包含2 m（NH4）2SO4 ，然后在八列体积上用下降梯度（80％至0％）洗脱
。使用PNP-乳糖活性测定法（2 mM PNPL
，50 mm乙酸盐pH 5.0 、30分钟，45°C）鉴定活性级分。使用SuperDex 25 Hiprep柱将这些馏分合并 ，浓缩并脱盐成20 mM Bis-Tris（pH 6.5） 。然后将脱盐蛋白加载到源15Q 10/100阴离子 - 交换柱上，并以20 mm Bis-Tris pH 6.5含有1 M NaCl的0–50％梯度在30柱体积上洗脱
。通过PNP乳糖活性鉴定活性级分。最终的纯化步骤涉及使用20 mm乙酸盐缓冲液（pH 5.0）的SuperDex 75 16/60色谱柱上的尺寸 - 排斥色谱法 。 　　来自Thermophelyces Thermophilus的LPMOS TTAA9J
，L
。Similis的LSAA9A，PaAA9E ，PaAA9E
，来自Podospora anserina和Neurospora Crassa的NCAA9C，在KomagataellappiCZαVAFFIIX-33中使用PPICZαVector和他们的天然信号替代品表达了Neurospora crassa。在30°C和200 rpm的YPD培养基中培养细胞（1％（w/v）酵母提取物 ，2％（w/v）蛋白酶
，2％（w/v）葡萄糖），直到葡萄糖耗竭 。通过每24小时加入1％（v/v）甲醇72 h来诱导蛋白质表达。在离心后（13,000g ，15分钟）获得的上清液浓缩并使用10 kDa MWCO空心纤维盒与切向流量过滤系统（GE Healthcare）耦合到20 mM Tris-HCl（pH 7.0）中
。将浓缩物应用于Deae-Sepharose XK 16/100柱（Cytiva）
，并用0-1 M NaCl梯度洗脱，除NCAA9C外 ，该梯度被应用于CM-Sepharose XK 16/100柱（Cytiva）
，并用0-1 M NACL渐变洗脱。将含LPMO的馏分合并，浓缩并与CUSO4（3：1摩尔比）在冰上孵育1小时 。离心（20,000g ，10分钟）后，将样品在HiloAD 16/600 Superdex 75 PG柱（Cytiva）上进一步纯化
，用20 mM Tris-HCl（pH 7.0）和150 mm NaCl平衡
。将最终的LPMO分数合并，浓缩并在4°C下储存。 　　通过SDS -PAGE（10％ ，w/v）评估蛋白质纯度
，然后用帝国蛋白质染色（Thermo Fisher Scientific）染色 。使用Pageruler Prested蛋白阶梯（Thermo Fisher Scientific）估算了在变性条件下的分子质量
。通过Bradford分析（Bio-Rad）或测量280 nm的吸光度，并使用计算出的灭绝系数（ε280）来确定蛋白质浓度。 　　如先前所述 ，对CELOCE的纤维素结合能力进行了定性评估 。67
。简而言之
，将80 µg的CELOCE与5％（w/v）的Avicel在50 mm乙酸钠缓冲液（pH 5.2）中孵育24 h，在4°C下温和搅拌。最终反应体积为200 µL ，在存在或不存在1 mM ASC的情况下进行孵育 。孵育后
，通过13,000克离心2分钟，将不溶性纤维素固定
。仔细去除包含未结合蛋白的上清液。通过在缓冲液中重悬和离心两次洗涤两次 。然后将洗涤的沉淀重悬于200 µL SDS载荷缓冲液（无染料）中 ，并在95°C加热10分钟。使用4–20％的梯度凝胶通过SDS -PAGE分析可溶性（上清液）和不溶性级分
。 　　如先前所述
，对CELOCE的结合，具有或不具有还原剂（ASC） ，与微晶（Avicel）和无定形（PASC）纤维素的结合。简而言之，将含5％（w/v）的avicel或0.2％（w/v）PASC中的50 mM乙酸钠缓冲液（pH 5.0）中的反应与0.1-1.5 mg ml – 1 celoce孵育
，最终体积为500 µl 。BSA充当相同浓度范围内的阴性对照
。使用左轮手枪旋转器（LabNet International）在4°C下在4°C下孵育16小时。通过在20,000克离心3分钟以离心去除带有结合的CELOCE的不溶性底物 。在280 nm的分光光度法测定上清液中游离酶（生物单位）的浓度
。对于含有1 mM ASC的反应，还加入了240 mM磷酸 ，并在290 nm处进行吸光度测量（参考文献29）。在290 nm处获得1 mM ASC的CELOCE和BSA的标准曲线 。使用Langmuir – Freundlich Model68拟合了实验数据
。数据是平均值±S.D.三个独立实验。 　　对于BSA阻断测定
，将含5％（w/v）avicel的反应与50 mM乙酸钠缓冲液（pH 5.0）中的反应与0.2 mg ML – 1 celoce和/或0.2 mg ml – 1 BSA一起孵育 。在不存在或存在还原剂（1 mM ASC）形式的情况下测试了CELOCE
。最终反应体积为500 µL。使用左右旋转器（Labnet International）在4°C下在4°C下进行孵育，为2、8
、16和24 h 。通过20,000g离心3分钟 ，将带有结合蛋白的不溶性底物去除。使用Bradford Method69测量上清液中游离酶的浓度
。数据是平均值±S.D.来自三个独立实验。 　　为了进一步研究CELOCE和微晶纤维素或漂白的纤维素纤维（从甘蔗渣甘蔗中提取）之间的相互作用
，在20 mM磷酸钠缓冲液（pH 5.4）中制备了纤维素分散剂（0.4％w/v），其中包含150 mm NACL并浸泡过夜 。然后添加酶和还原剂（ASC） ，以达到最终浓度分别为1 mm和480 mg G -1纤维素
。将反应混合物在40°C下孵育72小时
，并用轨道振动孵育。评估了两种不同的洗涤程序 。首先，通过以13,000克离心15分钟收集纤维素颗粒 ，然后用去离子水进行多个清洗和离心
，直到洗涤溶液的电导率接近纯水的电导率
。第二个程序涉及在40°C下用30-40 ml水溶液SDS溶液洗涤纤维素颗粒（200 mg）10次，然后用水冲洗以去除残留的SDS。纤维素样品的表面元素组成是使用k-alpha仪器（Thermo Fisher Scientific）获得的 ，其能量分辨率约为1 eV，并且Avantage v.5.9931软件 。使用FT-IR光谱仪（Perkinelmer）和Spectrum V.10控制软件进行样品的化学表征
。以4 cm -1的分辨率收集光谱
，范围为4,000至700 cm -1，总共128张扫描。使用OriginPro V.2023B软件（OriginLAB）分析数据 。 　　单糖 ，细胞冷糖（DP的程度（DP）程度（DP）
，多糖及其相应的醛酸形成是由Avicel，Pasc ，Pasc
，甘蔗，甘蔗甘蔗甘蔗 ，桉树
，桉树，念珠菌 ，念珠菌
，曼南，木兰 ，Xylan，xyloglucan
，lichobinobinoxylucan，lichenagin ，lichenagan
，lich c的使用Dionex ICS6000系统（Thermo Fisher Scientific）和Chromeleon v.7.3软件通过高性能HPAEC-PAD分析果胶和果胶
。在37°C下，在37°C中孵育了含有不同多糖的0.1％（w/v） ，含有0.1％（w/v）
，50 mM乙酸钠（pH 5.0），1 µM测试酶（CELOCE ，KDGF或BACB）和1 mM还原性。所有样品通过涡旋均质化
，通过0.22 µm注射器过滤器过滤 。然后，在配备2×50 mm Carbopac PA1防护柱和2×250 mM Carbopac PA1分析柱（Thermo Fisher Scientific）的HPAEC – PAD系统上分析了5 µL每个反应。分析以0.1 mL min – 1的流速进行
。The column was equilibrated with 0.1 M NaOH (eluent A) and bound oligosaccharides were eluted using a gradient of 1 M sodium acetate (eluent B) as follows: 0–10% B (linear) over 10 min, 10–30% B (linear) over 25 min, 30–100% B (exponential) over 5 min, 100–0% B (linear) over 1 min and 0% B for 9 min for重新平衡。电化学检测使用金工作电极和AG/AGCL pH参考电极进行 。使用可溶性细胞凝集糖（DP 2-6 ，Megazyme）作为标准
。通过用T. Therophilus（TTCDH
，XM003644495）的非氧化细胞含糖处理非氧化的细胞含糖，从而产生相应的C1氧化标准（DP 2-6）。为了从所有反应中量化核酸 ，使用不同浓度的棒球酸标准生成校准曲线 。每个测定法包括至少三个独立实验
。使用OriginPro V.2023B软件（OriginLAB）分析数据。 　　使用与质谱法（LC -MS）偶联的液相色谱法（LC -MS）鉴定出ASC存在于ASC的情况下，由CELOCE活性产生的律核酸 。使用与突触XS质谱仪（Waters）相连的Aceriity Premier Ultra性能液相色谱（UPLC）进行了分析
。将酶反应用去离子水和乙腈的1：1（v/v）混合物稀释20倍。然后
，将1 µL稀释的样品注入Z-硅柱（1.7 µm，95Å孔 ，2.1 mm×150 mm
，水域） 。移动相包括30％（v/v）乙腈（a）和95％（v/v）乙腈（b），均包含0.1％氢氧化铵
。洗脱梯度如下：初始 ，85％B持续5分钟；线性梯度
，85％B至45％B；等值，45％B持续5分钟；返回初始 ，45％B至85％B和重新平衡
，85％B持续5分钟。在整个分析过程中，流速保持在0.2 mL min -1 。质谱仪在负离子模式下以以下设置进行操作：毛细管电压：2 kV ，圆锥电压：25 V
，m/z范围：100–1,500，扫描周期：0.5 s和碰撞能量：4 V.使用肽标准的Leucine Leucine Leucine-enkephalin用100 pg life量使用每30 s每30 s ，用100 pg µ1（0）a a A a a A a a a a A a A a a n da da da da da n daers; 　　如前所述，对于LPMOS38
，在50 mM乙酸钠缓冲液（pH 5.0）中，AVicel pH-101（Sigma Aldrich）的1 G L – 1悬浮液在反应玻璃瓶中制备 ，并在磁搅拌下用氮气用氮气冲洗5分钟
，并通过冲洗5分钟。使用Schlenk系（3个10分钟真空真空和2分钟N2）将50 mM ASC，10 mM氢过氧化氢和50 µm Celoce的溶液以及水的溶液进行脱氧
。然后将所有溶液放在Whitley DG250厌氧工作站中16小时 ，以确保完全去除氧气。为了启动反应
，将1 µM Celoce添加到厌氧和有氧艾维塞尔悬浮液中 。孵育20分钟后，将100 µM过氧化氢添加到一半的厌氧反应中 ，而其余的厌氧反应和所有有氧反应都接受了相当于水的水
。然后
，通过添加1 mM ASC（最终反应体积：600 µL，在2 mL管中）在所有反应混合物中触发CELOCE活性。时间依赖性反应在0、1 、2
、3、4 、8和16小时进行 。有氧反应是阳性对照 ，以验证库存溶液的处理不会损害反应物完整性
。反应通过煮沸终止
，然后在21,000克离心15分钟。通过HPAEC – PAD分析所得的上清液 。每个测定法包括至少三个独立实验
。 　　使用最初针对LPMO设计的先前研究的测定法对过氧化氢的产生进行了评估。为了在没有多糖底物的情况下测量过氧化氢的产生速率，将1 µm CELOCE与50 µM amplex红色试剂（Invitrogen）和5 U ML – 1 ML – 1 ML – 1辣根过氧化物酶II型（HRP ，Sigma Aldrich），在50 mM磷酸盐ph 6.0中
，并在50 mM ph rate Incrub in 96-wellation in 96-well per Incrub in in in in in 96-well°C in 96-well 。分光光度计
。2分钟后，添加1 mM ASC（Sigma Aldrich）以启动反应。每5分钟每5分钟测量563 nm处的吸光度 ，总计30分钟 。为了在存在浓度浓度的多糖酶（野生型CELOCE
，CELOCE（δ2-5）或TTAA9J）的情况下，过氧化氢产生的变化与50 mM磷酸钠缓冲液PH 6.0和0-100 g – 1 avicel混合。然后 ，添加1 mM ASC以启动反应（最终体积为200 µl
，在2 ml管中）
。在37°C和850 rpm的Thermoxer C（Eppendorf）中进行孵育16小时（野生型和突变体celoce酶）或2 h（TTAA9J）。孵育后，将反应管以20,000克离心10分钟 ，以分离底物 。然后
，将50 µL的上清液添加到50 µL的混合物中，这些混合物含有杂质红 ，HRP和磷酸钠缓冲液pH 6.0
，并如先前的测定中测量
。使用标准曲线定量反应过程中产生的过氧化氢。每个测定法包括至少三个独立实验 。 　　根据先前描述的方案72测量过氧化物酶活性
。简而言之，将1 mm的2,6-二甲基氧运动与100 µm的过氧化氢和2-4 µm的AA9混合在50 mm柠檬酸钠的缓冲液pH 5.0中。将反应在50°C和850 rpm的热电器C中孵育10
、20和30分钟 ，以确保活性的线性相 。立即将样品转移到96孔板上，并使用I-Control V.1.10.4.0软件在分光光度计（Infinite M200 Pro
，Tecan）中以469 nm的形式测量吸光度
。仅考虑线性相来计算每个AA9的特定活性。使用凝血素的灭绝系数进行定量（ɛ469nm = 53,200 m -1 cm -1） 。对于热稳定性测量，将每种AA9酶的40 µm的储备溶液在50°C下在50°C的Thermomixer C中在50 mm柠檬酸钠pH 5.0中孵育6、12 、24
、48和72 h
。在30°C下在50 mm Tris-HCl pH 7.5中测量过氧化物酶活性 ，在分光光度计（无限M200 Pro
，Tecan）中孵育15分钟。 　　进行了糖化实验，以评估CELOCE提高T. Reesei BR_TRR03酶鸡蛋鸡尾酒的效率的能力 。27,28。Avicel ，Pasc和蒸汽爆炸的甘蔗蔗渣被用作底物
。使用总固体含量为0.1至5％（w/v）
，在最终体积的2 mL微管中进行反应。每个反应含有50 mM乙酸钠缓冲液（pH 5.0），2 µg酶鸡尾酒和50 µg Celoce 。而ASC（1毫米）被包括在用于Avicel和PASC反应的情况下 ，但它被排除在使用甘蔗渣的人之外
。遵循用于酶鸡尾酒的相同的糖清测定方案
，将反应在40°C下在40°C的组合杂交孵化器（FinePCR）中孵育24-72小时。使用Avicel和PASC作为底物评估CELOCE与单个纯化的内部和外酶的合作效应 。还包括缺乏酶，还原剂（ASC）或两者的控制反应
。将这些反应在37°C和850 rpm的热电器舒适度（Eppendorf）中孵育过夜。通过在95°C下煮沸10分钟 ，将所有反应终止
，然后以20,000克离心15分钟 。通过HPAEC – PAD分析上清液，并通过使用DNS Method64测量释放的TRS来确定CELOCE的增强作用
。互补测定法包括至少三个独立实验。 　　对于标准反应 ，将0.1％（w/v）的avicel与1 µm CELOCE和1 mm ASC孵育在37°C的50 mm乙酸钠缓冲液（pH 5.0）中，为0、1 、2
、2、3 、4、8和16 h 。如先前所述
，根据1至4小时的时间框架，基于棒酸浓度（µM）和时间（H）之间的线性相关性计算明显的周转率 ，如前所述37
。 　　将20 mM HEPES缓冲液pH 7.4（对照）中的CELOCE与1 mM CUSO4或1 mM NISO4（4 h）孵育
，然后添加1 mM CUSO4过夜。将1.4 mm Celoce的最终浓度加载到微毛细管（Mitegen）中进行测量 。XRF和XAS实验是在使用涡流-ME4检测器（Hitachi）的巴西同步灯实验室（LNLS/CNPEM）的极端条件分析方法（EMA）光束线进行的。使用EMA控制软件进行数据收集，并包括0.5 keV的能量步骤 ，每次扫描的获取时间为1 s
。使用发射线和铜箔的第一个拐点对梁线的能量进行校准
，而电离室则监测入射光束强度。箔是在样品的上游定位，并在与Celoce相同的条件下测量 ，第一个拐点设置为9.074 KEV 。使用Athena73软件v.0.9.26对所有数据集的光谱进行了校准
，标准化和合并
。 　　在20毫米HEPES缓冲液（pH 6.5）中制备CELOCE样品（0.5 mm）。EPR光谱记录在Bruker Elexsys E580光谱仪（BRUKER）上，在100 K（BVT 3000数字温度控制器）下在X频段（9.14 GHz）运行 ，具有以下采集参数：调制频率：100 kHz；调节幅度为5 g;转换时间
，90毫秒；清扫时间，92.1 s；和微波功率 ，20兆瓦 。使用XEPR V.2.6B.119软件进行数据采集
。EPR旋转 - 汉密尔顿参数使用一组计算工具分为两个步骤，如下所示。初始参数估计：G和A张量使用Python（Scipy/Numpy）中的实验室开发脚本估算74 。通过分析频谱的低场边缘（260–310吨）附近的奇异性来推断G和A值
。在高田边缘（310–330 mt）附近
，无法解析超精细分裂A，因此使用最强烈的峰和肩膀之间的平均距离来估计超精细耦合。G值是从这些峰之间的中心位置确定的（补充表9） 。仿真和优化：使用这些初始猜测 ，使用easyspin 6.0.0 Toolbox75的胡椒模块进行仿真
，在MATLAB SOFTWORE76中运行（Mathworks，V.9.13.0 ，R2022B）
。在拟合过程中
，允许G和A张量的对角线成分在指定的范围内独立变化。首先使用遗传算法（25代）进行全局优化，然后使用Nelder -Mead -Mead -Mead Downhill Simplex算法进行局部优化 。最终的汉密尔顿参数是通过二阶扰动和最终模拟的精确对角线获得的。 　　使用Microcal Peaq-ITC自动化系统（MALVERTALTICT）和PEEQ-ITC控制V.1.50软件进行ITC实验
。将CELOCE样品（100 µM）放在20 mM MES缓冲液（pH 6.5）中 ，用CHELEX（Sigma-Aldrich）处理以去除痕量金属
，将其放置在反应细胞中（200 µL体积）中。将1.0 mM CUCL2或1 mM纤维二糖加载到ITC注射器中 。通过以150 s的间隔将2 µL等分试样以500 rpm的速度向反应细胞中注射2 µL等分试样进行滴定，总共注射19次
。使用Microcal Peaq-ITC自动控制软件自动收集ITC数据 ，并通过将配体单独滴入缓冲液中减去产生的热量来校正稀释热。使用Microcal Peaq-ITC自动分析软件提供的非线性最小二乘算法将单位结合模型拟合到数据中 。拟合产生了反应的化学计量学（N）
，解离常数（KD）和焓变（ΔH）
。ΔH，KD和Gibbs自由能变化（ΔG）中的误差计算为S.D.至少三个独立的实验。通过误差传播确定熵变化（ΔS）的误差 。 　　通过蒸气扩散在包含：20％（w/v）聚乙烯乙二醇（PEG）8000
、3％（v/v）2-甲基-2,4-戊二醇和0.1 M咪唑 ，pH 6.5（结构1）的溶液中获得：20％（w/v）聚乙烯乙二醇（PEG）8000，3％（v/v）8000
，3％（v/v）2-甲基-2,4-戊二醇和0.1 M1.4 M柠檬酸三钠和0.1 M HEPES缓冲液pH 7.5（结构2）;或20％PEG 6000、0.1 M柠檬酸pH 3.0和5％甘油（结构3）
。将第二晶体（结构2）在含有25％（v/v）甘油的溶液中冷冻保护，以收集数据。收集所有晶体 ，然后在液氮中闪烁 。使用PILATUS 2 M检测器（Dectris）和Fine ϕ切片方法77
，在Manaca梁线（LNLS-SIRIUS/CNPEM）上收集X射线衍射数据
。使用MXCUBE78 V.2程序获得衍射数据。收集了三个数据集，每个数据集收集了3,600张图像 ，旋转时间为0.1°
，曝光时间为0.1 s 。使用XDS79（2023年6月30日，Build 20230630）进行数据处理。通过使用Rosettafold（V.1）生成的Model81作为搜索模型 ，用phaser80 v.2.7.0的分子替换求解结构
。使用Phenix.Refine82 v.1.8.3精制了初始模型
，并在COOT83 V.0.8.9中手动调整。最终模型和金属配位分别使用Molprobity84,85 v.4.5和CheckMymetal86 v.2.1验证 。使用PDBEPISA87 V.1.52评估二聚体稳定性和界面分析
。 　　KVFinder88 V.1.1.1软件用于识别与Celoce活动位点相对应的腔。使用Autodock Vina72 v.1.1.2，将从PDB进入3WDY获得的大理石糖（C4）分子停靠在Celoce结构中 。在10×10×10Å3盒中进行对接试验 ，该盒子以Celoce单体的铜区为中心
。为了完善活性位点的配体位置
，考虑到CELOCE的功能二聚体，对接结构进一步放松。在此设置中 ，一个杂种与大提琴糖对接，而另一个则不含配体 。残留质子化状态根据pH为5.5分配
，H5和H85在Nε下进行质子化，H44 ，H46
，H83和H84在两个原始物中均在Nδ处质子化
。用TIP3P水分子溶解该系统，用两个钠离子中和 ，并最小化以消除空间冲突。随后
，将系统以四个1-NS步骤加热到NVT集合下的300 K，然后在NPT集合下进行10-NS平衡（T = 300 K ，P = 1 Bar） 。在最小的最小化和加热步骤中
，将位置限制物应用于蛋白质，配体和铜原子
。距离限制与H44 ，H46和H84的N原子保持八原子的配位
，Q50的O原子以及第二（-1）（-1）和第三（+1）非配体的o2和O3原子在整个剩余的模拟步骤中分别使用。使用Amber20包装进行了模拟，并使用视觉分子动力学（VMD）进行结构和轨迹分析73 。用Pymol V.2.3（Pymol分子图形系统）生成蛋白质结构图像。 　　使用定制的CRISPR – CAS9方法（如我们以前的工作27中所述） ，使用定制的CRISPR – CAS9方法来表达Celoce和LSAA9A（来自L. similis的AA9 LPMO）的T. reesei菌株BR_TRR03
。编码CELOCE和LSAA9A的基因已针对Trichoderma中的密码子使用进行了优化，并分别集成到XYN4和XYN5基因座中。20-核苷酸原生动物剂旨在针对Xyn4（gccaaacatacagactgagt）和Xyn5（gcctgctctctctctgtctcggc）靶向t. reesei
，侧翼（5'-end-end）Hammerhead（hh）和（3' - 端）hepatiS sequincors ribized ribizection ribizectectBSP1407I消化的Ptrcas9grna1质粒，该质粒进一步用于原生质体转化 。酿酒酵母在体内组装了无标记的供体盒 ，其中包含与上游区域和1-kb的侧翼序列同源于下游靶向基因组区域的1-kb侧翼序列
。盒式从质粒放大了盒子
，以产生线性DNA片段，然后将其用于真菌转化。在使用转换测定之前 ，将获得的PCR产物纯化并浓缩在SpeedVac浓缩器中 。所使用的寡核苷酸在补充表18中列出
。然后
，T。Reesei通过原生质体介导的转化进行了转化27,89 。在每个转换事件中，使用了5μg的CRISPR -CAS9载体和5μg的线性DNA片段进行基因组整合
。通过PCR使用靶向基因组区域的退化（上游或下游）或在每个集成盒中内部退化（补充表18） ，通过PCR证实了对T. reesei菌株BR_TRR03的基因组的遗传修饰（上游或下游）。 　　在250毫升的Erlenmeyer瓶中生长了工程的T. resei菌株
，其中包含50 mL培养基，其中包含20.0 G L – 1（NH4）2SO4 、20.0 g L – 1 G L – 1全酵母细胞（干质量） ，50 g L – 1的TRS
，来自糖酶糖菌和pH调节至4.8 。如前所述生成整个酵母细胞27
。将甘蔗糖蜜（MellaçodeCana）用水稀释至大约350 g kg – 1的TR浓度，并在添加到灭菌的碱培养基之前分别稀释高压灭菌。每个烧瓶用0.3 ml的每毫升107孢子接种 ，并在28°C的振动箱中以200 rpm的速度进行5天 。在此期间，收集样品
，在4°C下以14,000克离心10分钟，并将上清液存储在-20°C下直至分析。 　　使用BioFlo/Celligen 115系统（Eppendorf）进行生物反应器实验 ，并用水夹克的3.0 L血管工作体积为1.0-1.7 l（参考文献28）
。中介质的组成与Shake-Flask实验中使用的组成相同
，添加了1.0 mL L – 1的J647抗FIFOAMING剂（Struktol）。生物反应器中的初始体积为1.0升，包括10％（v/v）接种物 。接种物是通过在烧瓶中的真菌孢子在28°C和200 rpm时摇动四天的四天来获得的
。使用2 M磷酸和10％（v/v）氢氧化铵的溶液将pH值保持在4.5±0.5。温度和曝气分别保持在28.0°C和0.7 SLPM压缩空气 。使用搅动级联（400-1,000 rpm）来确保溶解的氧气保持在20％以上
。甘蔗糖蜜溶液（大约350 g kg – 1的TR）含有1.0 ml L – 1的抗染料剂 ，从25 h培养到实验结束前的1小时
，以1.3 GTRS kg – 1 h – 1的饲料结束前，与非元素的即时量相关 ，生成非元素的饲料。在培养过程中
，定期收集样品（24小时），在4°C下以14,000g离心10分钟 ，并在-20°C下储存的上清液以进行后续分析 。获得最终的发酵样品进行水解实验
，蛋白质定量和酶活性分析
。 　　在65-L（Bioflo 610，Eppendorf）和300-L（Bioflo Pro 300 L ，Eppendorf）驾驶生物反应器中培养了表达CELOCE的毛霉素菌株。基于糖蜜的培养基的组成以及培养和喂养条件与台式实验中使用的培养基和喂养条件相同 。对于65-L生物反应器，将充气设置为13-18.5 SLPM
，溶解氧20％，压力为5-10 psi和搅动150-427 rpm
。在300-L生物反应器中 ，充气为84-120 SLPM
，溶解氧20％，压力为5-10 psi和搅动100-450 rpm。在两个生物反应器中 ，接种量占总工作量的10％ 。 　　用丙酮从工程T. resei菌株的分泌组中的蛋白质（200 µg）重悬于500 µL的25 mm碳酸氢铵缓冲液（pH 7.8）中
，其中含有50 mM dithiothreitol和5％（w/v）脱氧乙酸硫酸钠。在60°C下孵育30分钟后，将样品转移到30 kDa MWCO AMICON滤波器（Merck Millipore）并离心（14,000g ，20分钟
，20°C）
。丢弃流动，并添加450 µL含有8 m尿素的缓冲液 ，重复此步骤两次。最终离心后
，在缓冲液中加入450 µL 20毫米碘乙酰胺进行烷基化（45分钟，在室温下在黑暗中） ，然后进行离心和5次用缓冲液进行脱水 。在37°C下添加胰蛋白酶（1:30 w/w比）进行过夜消化
。离心后，将肽收集在流通液中
，用去离子水洗涤两次并干燥。加入了内标（消化的酵母醇脱氢酶，P00330） ，并注入25 FMOL的肽混合物
，以进行LC -MS/MS分析，以与Ackity Premier UPLC结合使用 。使用Masslynx v.4.2程序进行数据采集
。使用4–55％的梯度在25 µl min – 1时使用4–55％的梯度超过103分钟 ，在肽CSH柱（1 mm×100 mm
，1.7 µm，130Å）上进行分离。数据采集​​处于高清数据独立的采集模式（50-2,000 m/z ，0.5 s扫描周期）
，在6 eV时低碰撞能量，较低的碰撞能量从15到40 eV ，以提高碰撞能量 。用100 pg µL – 1的肽标准亮氨酸 - 源石校正的锁定质量校正每30秒钟
，质量为0.5 da
。数据处理以1％的错误发现率，20 ppm ms1误差耐受性和自动MS2误差调整 ，在祖发4.2中进行。将半胱氨酸的氨基甲基化设置为固定的修饰，将蛋氨酸氧化作为可变
，并允许一种丢失的胰蛋白酶裂解 。T. Reesei BR_TRR03基因组（NCBI：PRJNA1031947）， 包括Celoce和LSAA9A序列 ，作为参考
。使用前三个肽方法来定量蛋白质丰度90。 　　如先前所述27和滤纸活性（FPase）
，如先前所述，确定了酶促活性（β-葡萄糖苷酶 ，β-木糖酶
，β-Xylosidase，Endo-β-1,4- Xylanase和cmcase） 。使用Combi-D24杂交孵化器（FinePCR）在50°C下以最大旋转（9级）在50 mL Nalgene Oak Ridge离心机中进行糖化反应。使用5 M NaOH将生物量pH调节至5.0
。每个反应均包含20.0 g的总质量 ，其中15％（w/w）的最终固体在乙酸100 mm的缓冲液中加载（pH 5.0）。添加两个不锈钢球（直径3.5毫米
，每个1 g）以确保均匀性 。蒸馏水代替了空白反应中的酶
。采样和分析遵循建立的协议27。进行三个独立的实验，每24小时收集样品 。用折射率检测器的HPLC（安捷伦1260 Infinity）对释放的糖进行定量
。带有事后Tukey诚实的显着差异测试的单向方差分析用于比较酶活性 ，蛋白质和糖浓度的平均值。 　　所有符合自然投资组合期刊的作者标准的研究人员都列入了作者列表中 。他们的贡献对于研究的设计
，执行和解释至关重要
。在研究之前，明确定义和相互同意 ，每个合作者的角色和责任是在研究之前的。这项研究在研究人员的情况下没有受到严格的限制或禁令，并且以避免对任何当事方造成污名化
，罪名，歧视或个人风险的方式进行 。我们支持包容性 ，多样化和公平的研究行为
。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。