HEK293T ，LS1034
，KM12，DLD1 ，HT115
，LS180，LS513 ，SW1417，HT55
，GP2D，RKO ，COLO678
，SW48，SW48和ASPC1细胞系 ，表征并控制了质量的特征
，并控制了质量 。使用标准组织培养技术维持细胞系
。将所有细胞系均在DMEM（HEK293T）或RPMI中培养，其热灭活胎牛血清 ，2 mM谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素。定期确保支原体消极 。 　　去除成年C57BL/6小鼠的结肠
，冲洗，纵向打开 ，用冷PBS洗涤以去除所有腔内物质
。将结肠切成冷PBS中的0.5–1 cm片
，涡旋，洗涤3次 ，并在37°C下以25 mL 2.5 mM的EDTA-PBS放入5分钟。然后除去上清液，并用PBS洗涤结肠片
，然后在37°C下在25 mL 5 mM EDTA-PBS中孵育15分钟 。在剧烈涡旋后，收集上清液并通过100μm过滤器过滤 ，以500克旋转5分钟
，用冷PBS洗涤，然后在Intsicult Media（Stemcell ，06005）和Matrigel（Corning
，356231）中重悬于1：1。每2-3天更换一次企业培养基，并每7-10天通过机械破坏来传递器官
。 　　为了产生AKPS器官 ，CRISPR – CAS9技术引入了APC
，KRASG12D TRP53和SMAD4中的突变。使用了以下基因特异性单引导RNA（SGRNA）：APC，CAGGACTGCATTCTCCTGAA ，AATGCAGTCCTGTCCCCCCATG
，TTCTTGGGAATGACCCCCATG；KRAS，CTGAATTAGCTGTATCGTCA ，G12D供体序列；trp53，ggagctcctgacactcggag;和smad4
，gatgtgtgtcatagacaaggtg 。使用ACCUTASE（Sigma-Aldrich）在37°C下将器官分离为单细胞悬浮液5分钟，然后使用P1缓冲液和CM137程序（LONZA）用2μLCAS9和3μLSGRNA进行电穿孔
。After electroporation cells were embedded in Matrigel and DMEM advanced media (GIBCO) supplemented with 10 mM Hepes (Sigma-Aldrich), 2 mM GlutaMAX (Life Technologies), 1× Penicillin/Streptomycin (Life Technologies), 1× N2 (GIBCO), 1× B27 (GIBCO), 1 mM N-acetysteine（Sigma-Aldrich） ，50 ng ML-1 EGF（Life Technologies）
，100 ng ML-1 Noggin（Peprotech）和R-Spondin-1（R＆D Systems）。Selection for mutated cells was performed using growth factor depletion from the culture medium: R-spondin depletion to select for Apc-deficient cells, EGF depletion to select for Kras+/G12D cells, presence of 10 μM Nutlin-3 (Sigma-Aldrich) to select for Trp53 mutants, and Noggin depletion with presence of TGF-β (Peprotech,10 ng ml -1）选择具有SMAD4缺乏症的细胞 。 　　正常结肠机可以从供体西部获得，并在Inticult Oranoid生长培养基中培养（Stemcell ，06010）
。患者来源的CRC类器官PDM95
，PDM96和PDM2674购自ATCC，HCM-CSHL-0142-C18 ，HCM-CSHL-0143-C20和HCM-CMSL-0382-C19。已建立的CRC类器官在ATCC Organoid介质＃1中培养 。Organoid Media＃1由高级DMEM：F12（Thermo Fisher
，12634028）组成，10 mm HEPES（GenEntech） ，2 mM--谷氨酰胺（ATCC
，30–2214），1×B27 ，1×B27（Thermo Fisher，17504-044）
，17504-044），100 ng ml-1 noggin（Bio-1 noggin（Bio-1 Ng） ，6057.0577777777,5777777.LEL
，60577.LNGML，LIO-techne ，6057777.LNGML
，LIO-techne，6057777.LNGMLLEL ，605777.LNGMLLEN
，6057.LNGMLLELEGF（Bio-Techne，236-EG） ，10 nm胃蛋白（Bio-Techne
，3006），10μmSB202190（Bio-Techne ，1264），500 nm A83-01（Bio-Techne
，2939，2939） ，10 mm Nicotinamide（10 mm Nicotinamide）（LKT LABS
，N333310）和1.25 MMM MM，和1.25 MMM
。（LKT Labs ，A0918）。 　　所有人类结肠类器官均在50％的矩阵塞（Corning
，56231）中生长 。在融合时，将培养基从井中吸出 ，并将器官塞重悬于PBS中
，并用移液器解离细胞外基质
。在PBS抽吸之前，将细胞在500G下在4°C下在4°C下离心5分钟 ，并在Tryple Express中重悬于细胞（Gibco
，12604013）中。通过在37°C下孵育3-5分钟，可以通过间歇性移液孵育3-5分钟以有助于解离 。酶促和机械解离后 ，将冷基底培养基添加到器官中，并在4°C下以500克离心5分钟。仔细抽吸培养基
，随后用冷PBS洗涤器官，并在4°C下以500克离心5分钟
。仔细抽吸PBS ，并将类器官重悬于完整培养基和Matrigel的50:50混合物中。将器官在预热板上的3D圆顶中播种
，并在板反转前的37°C下在37°C下凝固5分钟，在添加培养基之前15分钟 。 　　使用RNASCOPE方法进行的杂交是根据制造商的协议（高级细胞诊断）使用RNASCOPE 2.5 HD Reagent Kit-RED（322350）进行的
。使用的探针是MMZRNF3（434201） ，MMRNF43（400371）。 　　对于免疫组织化学
，将样品固定并使用标准程序固定 。对于Ki67抗体染色，将抗原透明缓冲液（DAKO）压压15分钟 ，在无血清蛋白质块（DAKO）中阻塞
，并在抗-KI67（Sigma-Aldrich，1：400）中孵育过夜
。然后将切片在HRP偶联的抗兔抗体（Dako ，1：200）中孵育
，并用DAB反应检测（Dako）。使用N3 Elements软件使用Nikon A1R获取图片 。 　　使用Truseq RNA样品制备试剂盒（CA Illumina，CA）制备RNA测序（RNA-Seq）文库
。在Illumina HISEQ 2500序列上对库进行了测序 ，平均每样品获得3400万个50亿美元的单端读数。首先将RNA-seq读数与核糖体RNA序列对齐以去除核糖体读数 。使用GSNAP37版本2013-10-10对鼠标参考基因组（NCBI Build 38）进行对齐，每50键序列最多两次不匹配（参数：-m 2 -n 10 -b 2 -b 2 -i I 1 -n 1 -n 1 -w 200000 -w 200000 -e 1 -pairmax -rna = 200000 – Clip -clip -overlap）
。转录本注释基于REFSEQ数据库（NCBI注释版本104）。为了量化基因表达水平
，计算了映射到每个RefSEQ基因外显子的读数 。读数按库大小缩放，使用voom r软件包计算出刻分式的归一化和精度权重。随后 ，使用Limma R Package27对归一化计数数据进行差异表达分析
。另外
，如所述，以每千碱基基因模型的标准化读数的形式获得基因表达 ，如所述28。 　　对于定量PCR（QPCR）
，使用Rneasy Micro或Mini Kit（Qiagen，74004和74104）从样品中分离RNA 。根据制造商的说明 ，使用单步实时RT-PCR策划者（Life Technologies
，4392938）在10μL反应中对50 ng总RNA进行了QPCR
。Taqman探针AXIN2（MM00443610_M1），LGR5（MM00438890_M1） ，MKI67（MM01278617_M1）和LYZ1（MM00657323_M1）来自Life Technologies。在以下热循环条件下
，在7900HT快速实时PCR系统（ABI）上进行QPCR反应：在48°C下保持30分钟的步骤，然后在95°C下保持10分钟 ，在95°C下的40 s循环在95°C和60°C下的1分钟 。 　　野生型B57BL/6只小鼠（000664）和点头
。cg-prkdcscidil2rgtm1wjl/sZJ（NSG）（colony 005557）小鼠从杰克逊实验室购买。6至12周大的女性用于实验 。从查尔斯·河（Charles River）获得了雌性8至10周的Sprague Dawley大鼠
。雌性16周大的白兔子是从WORC（西俄勒冈兔）获得的。动物研究得到了Genentech的机构动物护理和使用委员会的批准，并遵守了NRC​​的照料和使用实验动物指南 。 　　大约将100万个SW48细胞重悬于PBS的基础培养基中
，并将50％Matrigel（Corning）混合到最终体积为200μl，并在NSG小鼠的左侧注射
。使用卡尺测量肿瘤尺寸 ，肿瘤体积计算为0.523×长度×宽度×宽度。根据以下标准对小鼠进行人工安乐死：持续的困扰或疼痛的临床迹象
，体重损失明显（> 20％），肿瘤大小超过2,500 mm3或肿瘤溃疡时 。机构动物护理和使用委员会（IACUC）允许的最大肿瘤大小为3,000 mm3 ，在实验中没有超过该限制。当肿瘤达到约400 mm3时
，将小鼠随机分配以接受对照抗体或Protab的单次腹膜内注射
。没有一个实验盲目。注射后48-72小时对所有小鼠进行安乐死，并收集肿瘤进行进一步加工 。先前已经描述了管腔植入程序15
。简而言之 ，通过异氟烷吸入将小鼠麻醉
，并在0.05至0.1 mg kg -1的情况下向丁丙诺啡腹膜内注射。将钝的止血器（微型骨化，13010-12 ，精细的科学工具）插入肛门1厘米 。止血器朝向粘膜倾斜
，并稍微打开，以使单个粘膜褶皱可以通过将止血器闭合到第一个缺口来锁定
。止血物从肛门缩回 ，暴露于外部的粘膜。直接将含有50,000个用50％基质（Corning）混合在PBS中的50,000个细胞的溶液直接注入结肠粘膜 。逆转脱垂后，止血物随后释放
。 　　通过用重组RNF43和/或ZnRF3免疫大鼠或兔子来鉴定抗体。In brief, Sprague Dawley rats (Charles River) were immunized with a priming dose of 100 µg human (RNF43 or ZNRF3) protein solubilized in detergent mixed with MPL + TDM adjuvant (Sigma-Aldrich), CFA (Sigma-Aldrich) or mixed with a combination of TLR agonists: 50 μg MPL (Sigma-Aldrich),20μgR848（Invivogen）
，10μgpoly（I：C）（Invivogen）和10μgCpG（Invivogen）在多个位点之间分配 。新西兰白兔子还用与CFA混合（Sigma-Aldrich）混合在洗涤剂中的相同蛋白质的混合物进行免疫
。为了增加蛋白质的促进，大鼠和兔子接受了在PBS中稀释的启动剂量蛋白的一半。每两周给大鼠和兔子服用一次 。ELISA纯化这些大鼠和兔子的多克隆抗血清与人RNF43和ZnRF3结合。对于大鼠 ，在最后一次免疫后三天收集了多个淋巴结
，该淋巴结显示出对人RNF43或ZnRF3的可检测到FACS反应性
。使用磁分离（Miltenyi Biotec）从整个淋巴细胞中纯化来自这些大鼠的IgM阴性B细胞，并用抗RAT IGM抗体（Jackson Immunoresearch） ，抗RAT CD45RA（Biolegend）（Biolegend）染色633由Lightning-Link Alexa 633抗体标签套件（Novus）。分类显示与人RNF43或ZnRF3蛋白结合时显示最小的大鼠IgM表达的大鼠B细胞
，并将其沉积在96孔板中，其中含有带有馈物细胞的培养基 ，并使用FACS ARIA IIIII Sorter（BD）补充了细胞因子 。对于兔子
，在最后一次免疫后三天收集了血液，该免疫显示了对人RNF43和ZnRF3的可检测到FACS的反应性
。使用磁分离（Miltenyi Biotec）从整体上纯化这些兔子的IgG阳性B细胞 ，并用抗兔IgG抗体染色 （Southern Biotech）并标记为人类RNF43-Alexa 633或Lightning-Link Alexa 633抗体标签套件（NOVUS）的人类Znrf3-Alexa 633。分类与人RNF43或ZnRF3蛋白结合时显示最大兔IgG表达的兔B细胞进行排序
，并沉积在含有饲料细胞的培养基的96孔板中，并使用FACS ARIA IIIII Sorter（BD）补充细胞因子 。分类后七天 ，通过ELISA对人类RNF43或Znrf3筛选上清液
。通过FACS测试了证明人RNF43或ZnRF3结合的上清液与在GD-RNF43表达细胞表面表达的人RNF43或ZnRF3的结合，或与在GD-ZNRF3表达细胞表面表达的人ZnRF3结合。从B细胞中提取RNA
，该B细胞显示RNF43或ZnRF3 FACS结合以分子克隆和重组表达 。通过FACS测试重组抗体与在GD-RNF43表达细胞表面表达的人RNF43的结合，或与在GD-ZNRF3表达细胞表面表达的人ZnRF3结合
。 　　编码抗体重和轻链可变结构域的DNA是通过基因合成产生的。将合成的基因片段插入包含相应重或光常数域的哺乳动物表达载体中 。物种和同种型包括人IgG1和鼠IgG2a
。编辑了一些可变域序列以去除明显未配对的半胱氨酸残基和NX [S/T] N-糖基化基序。重组抗体是通过用哺乳动物表达载体的瞬时转染的瞬时转染编码抗体重链和轻链的 。重链和轻链在单独的载体上编码 ，并使用重链表达载体与光链表达载体的1：1比率进行转染。通过亲和色谱从细胞培养上清液中纯化抗体
。在某些情况下
，抗体根据SEC进行了额外的纯化步骤。使用旋钮孔技术19使用人IgG1或鼠IgG2A主链生成双特异性抗体，通常包括降低效应函数的突变（L234A ，L235A和P329G） 。如前所述
，将含有旋钮或孔的抗体表达并纯化为双特异性格式
。在某些情况下，引入突变以在单个细胞中启用双特异性表达 ，包括适当的轻链配对。 　　如前所述
，使用轻链配对突变来生成Fab-iGG ARM，然后如上所述 ，使用轻链配对突变来设计复合形式2+1靶抗体
，并表示为半抗体 。单臂FV – IGG被设计为VH或VL的融合，分别在重链（HC）或轻链（LC）上
。如上所述 ，使用旋钮孔技术来驱动合适的HC配对，HC
，LC和仅FC的臂均被共表达。 　　使用BIACORE 8K仪器（GE Life Sciences）筛选抗体与重组人RNF43和ZnRF3 ECD的结合 。简而言之，使用10 µL min -1和60 s的接触时间的流速 ，在传感器芯片蛋白A（GE Life Sciences）上捕获了在1×HBSP缓冲液中稀释至1 µg mL -1的抗体
。重组人RNF43和ZnRF3 ECD与捕获的抗体的结合使用单周动力学方法在25°C下进行分析
，流速为30 µl min-1，接触时间为180 s ，离解时间为600 s。单周期动力学中重组人RNF43和ZnRF3 ECD的浓度为0 、0.16
、0.80、4 、20和100 nm 。在循环之间
，使用10 mM甘氨酸HCl pH 1.5在30 µl min -1时注射30 s的芯片
。使用BIACORE 8K评估软件（GE Life Sciences）评估数据。使用1：1结合模型获得了动力学常数，该模型将参数RI设置为零 。 　　将动物免疫产生的抗体重新格式化为HIGG1骨架 ，并使用CFM2/MX96表面等离子体共振（SPR）系统（Wasatch Microfluidics
，现为Carterra）进行固定，配备了DA V6.19.3 ，IBIS Suit
，Sprintx和Carterx和Carterra Epepope Softect。使用10 mM乙酸钠pH 4.5固定缓冲液，将10 µg mL -1处的抗体固定在200 m（XANTEC Bioanalytics）上200 m（XANTEC Bioanalytics）
。使用CFM2仪器进行固定化 ，然后将传感器棱镜转移到IBIS MX96仪器中以进行基于SPR的竞争分析。使用HBS-EP运行缓冲液（10 mM HEPES，150 mM NaCl
，NaCl，0.05％TWEEN 20 ，pH 7.4
，1 mm eDTA），首先将固定化抗体暴露于100 nm重组人RNF43或ZnRF3 ECD ，然后在溶液中的10 µg ml-1抗体 。10 mM甘氨酸/HCl pH 1.7用作再生缓冲液
。 　　如先前所述
，使用改良的间接chizzonite方法与碘-125（125i）间接放射性标记为29。简而言之，在0.1 N氢氧化钠（Perkin Elmer）中以碘化钠的形式获得125i 。1 MCI（〜3 µL）的125i用于在〜10 µCi µg -1的特异性活性下随机标记酪氨酸残基 ，在125i用碘化管（Pierce Chemical）激活后
。 　　通过使用针对IGF1R（Cixutumumab）或ZnRF3（ZnRF3-55）的放射性标记抗体（ZnRF3-55）进行饱和结合实验来确定细胞表面IGF1R和ZnRF3的拷贝数。为了进行饱和实验
，将细胞与结合缓冲液（Optimem，2％FBS ，50 mM HEPES和0.1％硫唑钠）中的125i标记抗体浓度孵育12小时
，在室温下在温和的搅拌下 。非特异性结合是通过在添加125i标记抗体之前用过量的未标记抗体的预孵育细胞来确定的
。将细胞和抗体转移到Millipore Multiscreen滤清器上，用结合缓冲液洗涤四次 ，并允许干燥。将干滤液打成5 mL聚苯乙烯管（康宁），并使用Wallac Wizard 2470 Gamma Counter（Perkin Elmer）测量以每分钟计数（CPM）的放射性（CPM）
，持续1分钟，计数为0.8计数效率 。数据拟合到GraphPad Prism 8中的一个位点特异性结合曲线
。 　　在处理前24小时 ，在96孔板中以每孔2500个细胞的密度为2500个细胞。用各种抗体的剂量滴定处理细胞 。经过6天的治疗后
，使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定法（Promega，G7570）测量细胞活力 ，并在制造商的方案后测量。试剂和板平衡至室温
。 　　HEK293细胞用Topbrite Firefly Luciferase Wnt Reporter稳定转染
，PRL-SV40 Renilla Luciferase（Promega，E2231）在RPMI 1640培养基中均维持 ，并补充了10％的胎儿牛血清。对于荧光素酶测定
，用CHIR99021（Stemcell Technologies，72052） ，重组小鼠WNT3A蛋白（R＆D Systems
，1324-WN-002/CF）和RSPO3（10.5 pm，genentech ，genentech）或各种protabs刺激细胞 。治疗16小时后，根据制造商的说明
，使用Promega Dual-Glo系统（Promega，E2920）检测到荧光素酶活性
。数据被分析为萤火虫/肾荧光素酶活性的比率。 　　HT29细胞中的CRISPR-CAS9系统将HIBIT标签引入了IGF1R的N端 。选择了具有最高纳米荧光素酶发光读数的单个克隆 ，并通过Sanger测序进行验证
。将细胞以每孔的100,000个细胞为100,000个细胞将96孔平透明的底部白色聚苯乙烯组织培养的微孔板铺在各种浓度的抗体的情况下
，并在ATCC-启用培养基中孵育。24小时（或指定的时间段）后，将细胞用100 µL PBS洗涤一次 ，然后用100 µL新鲜培养基补充 。通过以1：100的比率稀释LGBIT蛋白
，并以1:50的比例稀释LGBIT蛋白来制备检测试剂，以缩放为1:50的底物 ，以在检测试剂盒中提供的所需检测缓冲液中
。然后将100 µL检测试剂添加到100 µL新鲜培养基中的细胞中。对于检测IGF1R表面水平的纳米 - 基因hibit细胞外检测系统
，在室温下10分钟孵育时，使用板振动器轻轻混合进行检测 。使用基于以下方程的相对光单元（RLU）读数计算IGF1R清除率（％）：百分比清除率=（未处理样品RLU-处理过的样品RLU）/（未处理样品RLU×100％）
。在该细胞系中评估了RNF43和ZNRF3双特异性和多特异性Protab。在两次单独的运行中运行一个抗体的子集 ，在这种情况下包括两个结果 。 　　将HT29或ASPC1多西环素诱导的GD – Ligase-Flag细胞以96孔板的每孔的密度为80,000–100,000个细胞接种24小时
，并用强力霉素治疗24小时，持续24小时 ，然后用抗体进行抗体。在处理后的各个时间点，用PBS（每孔100 µL）洗涤细胞
，通过在37°C下添加Accutase（Millipore，每孔100 µL）10分钟 ，从井表面脱离
，并重悬于单个细胞中
。通过添加与青霉素，链霉菌蛋白和谷氨酰胺的热灭活胎牛血清的同等含量 + 10％的RPMI + 10％的RPMI + 10％的ACCUTASE活性。在1200 rpm离心4分钟后 ，将上清液丢弃 。将细胞重悬于150μlFACS缓冲液（PBS
，0.5％BSA，0.05％叠氮化钠）中10分钟 ，在冰上离心
，并丢弃上清液
。将细胞与40μl荧光标记的染色抗体（2-5 µg ml-1终浓度）一起孵育45分钟。染色抗体包括XIGF1R MIGG1-APC（1H7，EBISOSCIENCE 17-8849-42） ，XRNF43 HSC37.17-APC（内部产生的试剂
，使用WO2015164392A2衍生而成，使用Alexa Fluor 647抗体647抗体抗体fistereling kit ，a thermo fisher，A A a a a apc 。XFZD5 HigG1（内部试剂
，5 µg ml-1使用）用作冰上45分钟的主要染色抗体（5 µg ml-1终浓度），然后在FACS缓冲液中进行两次洗涤（150 µL） ，二次固定抗体抗体抗体抗体抗体抗体抗体抗体抗体Invig（Human InviT14444444）1：1,000）在冰上持续45分钟
。背景或同种型控制染色抗体包括Nistmab HigG1-APC和Xragweed MigG1-APC（均为内部生成的试剂）。与染色抗体一起添加了生存力染料780（Ebioscience
，65-0865-14，1：1,000） 。染色后 ，将细胞在FACS缓冲液（150 µL）中洗涤两次
，并重悬于40 µL FACS缓冲液中进行分析
。 　　使用高通量模式的高通量采样器在BD FACSCELESTA流式细胞仪上进行流式细胞仪。将样品重悬于两次，然后通过细胞图仪（10 µL样品体积 ，180 µL min -1流速）进行分析
，测量了SSC，FSC和APC信号 。在每个样品之​​间 ，将系统用400 µL缓冲液洗涤
。使用FlowJo FACS分析软件
，使用SSC和FSC配置文件获得了单细胞门控。平均APC中位荧光强度（MFI）用作细胞表面靶表表达的度量，并计算出百分比的表面清除率为（1-（处理过的MFI-背景）/（未处理的MFI-MFI-TAKCKENT））×100 。 　　使用IGF1R的化学诱导RNF43或ZnRF3的化学诱导二聚化的效果是使用The The The The Timerize System（Takarabio）评估的。简而言之 ，用PBIND质粒将HEK293T细胞反向转染，以诱导RNF43-DMRA – HA和IGF1R-DMRC-FLAG或ZnRF3 – DMRA – DMRA – DMRA – HA和IGF1R – HA和IGF1R – DMRC – FLAG的构型共表达
。18–20小时后
，将细胞未经处理或用不同浓度的A/C杂二聚体（Takarabio，635057）处理 ，以诱导连接酶 - 靶标二聚化
，并将细胞孵育24小时。然后将细胞裂解在冰冷的GST裂解缓冲液中（25mm Tris•HCl，pH 7.2
、150 mM NaCl ，5 mM MGCL2、1％NP-40和5％甘油
，1％停止蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡蛋鸡肉） 。通过将裂解物与25μlPierce HA表位抗体琼脂糖结合物（2-2.2.14）（Thermo Fisher，26182）在4°C下孵育3小时 ，将清除的裂解物进行HA免疫沉淀
。对于输入样品
，在孵育前从制备的免疫沉淀样品中使用20μL。孵育后洗涤珠子，并制备用于蛋白质印迹分析 。 　　将HEK293T父母或强力霉素诱导的GD – ZNRF3-FLAG细胞以每15 cm的500万细胞密度铺板
。电镀后24小时和48小时 ，对细胞进行培养基交换。然后将细胞在冰冷的GST裂解缓冲液中裂解 。通过将裂解物与50μlFLAGM2亲和凝胶（Sigma-Aldrich
，A2220）在4°C下孵育150分钟，将清除的裂解物进行了FLAG免疫沉淀
。对于输入样品 ，在孵育之前，使用制备的免疫沉淀样品中使用60μL。孵育后洗涤珠
，然后直接制备用于蛋白质印迹分析或进行洗脱 。为了洗脱与珠子结合的蛋白质，使用凝胶载荷尖端吸出上清液 ，以避免珠子损失
，并恢复在400μlFlag弹性缓冲液中，以在GST裂解的30分钟内 ，通过稀释5 mg ML-1 3×FLAG肽储备溶液（Sigma-Aldrich
，f4799，f4799） ，并置于GST裂解的浓度中
。在孵育后
，将样品转移到Microspin柱（GE Healthcare，27356501）中 ，以将洗脱器与珠子分开
，并以6,000克旋转30 s。用3K MWCO（Millipore，UFC500396）将洗脱液转移到Amicon滤清器单元中 ，并在室温下以14,000克向下旋转30分钟 。然后将过滤器倒入新的试管中，并在室温下以1,000克向下旋转2分钟
，并准备浓缩样品进行蛋白质印迹分析。 　　在HT29和DLD1细胞中评估了抗体处理后的IGF1R泛素化
。简而言之，将4000万个细胞铺在15厘米菜肴中 ，并孵育72小时。将细胞进行培养基交换
，并伴有二价或双特异性抗体处理（1μgml -1） 。将细胞在37°C下孵育2小时和15分钟
。孵育后，将细胞刮在800μl冰冷的PBS + 10毫米NEM ，1 mM PMSF
，1％停止蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒和细胞沉淀中，并在400μL定性缓冲液中恢复活力和磷酸酶抑制剂鸡尾酒） ，并在95°C下3分钟孵育之前通过涡旋混合。通过添加800μlNP-40免疫沉淀缓冲液（50 mM Tris•HCl
，pH 7.5，0.5％ ，0.5％igepal
，150 mM NaCl，10 mM NaCl ，10 mM NEM，1 mM PMSF
，1％下半年蛋白酶蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒），通过添加800μLNP-40免疫沉淀缓冲液（10 mM Tris•hCl ，pH 7.5
，0.5％，pH 7.5 ，0.5％
，pH 7.5，0.5％ ，1％）
，通过煮沸样品重新育而生 。在冰上30％放大器，将样品超声处理32 s ，开/关脉冲间隔为2 s
。将样品在4°C下以16,100 g离心15分钟。将清除的裂解物与25μl每样品预洗的Dynabeads蛋白G（Thermo Fisher
，10004D）与IGF1受体（D23H3）XP兔单克隆抗体（细胞信号; 9750; 9750; 9750）偶联，以1.87μg下的IGF1R抗侵蚀 。在4°C下孵育裂解型珠混合物24小时
。对于输入样品 ，在孵育之前，使用制备的免疫沉淀样品中使用60μL。孵育后洗涤珠子
，并制备用于蛋白质印迹分析 。 　　将各种细胞系铺在6孔板中（康宁，3516） ，密度为每孔0.5-10万个细胞
，并固夜粘附
。在指定浓度和持续时间内用抗体处理细胞。如果适用，则将细胞与强力霉素（0.5-1μgml-1） ，E1抑制剂（MLN72431μM）
，MG132（Sigma-Aldrich，M7449 ，10μm）和Bafilomycin A1（Sigma-Aldrich
，Sigma-Aldrich，Smldrich ，Sml16661
，100 nM）进行预先治疗 。孵育后，将细胞在GST裂解缓冲液或RIPA缓冲液中裂解 ，并补充了1％停止蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒（Thermo Fisher，78442）
，在冰上进行20分钟。使用Nupage LDS样品缓冲液（4×）（Invitrogen，np0007）和Nupage LDS样品还原剂（10×）（Invitrogen ，NP0009）准备溶解裂解物并进行蛋白质印迹分析
。使用螺栓或Nupage MOPS SDS在90–100 V时以4–12％BIS-Tris凝胶（Invitrogen
，WG1403）进行样品进行样品，持续约2-3小时。对于分子量 ，测定样品与Amersham ECL彩虹标记
，全范围（Cytiva，RPN800E）或等效标记一起运行 。使用IBLOT2硝酸纤维素常规堆栈（Invitrogen ，IB23001）
，使用IBLOT2系统将凝胶转移到硝酸纤维素膜中，并使用协议P0（在20 V ，4分钟为23 V
，23 V，25 V时2分钟）转移凝胶
。或者 ，使用免疫印刷PVDF/滤纸三明治（Bio-Rad，1620239）在100 V中转移凝胶100分钟。在室温下
，将印迹用PBST/TBST中的5％牛奶阻塞1小时 。将印迹转移到PBST/TBST中的5％牛奶中，其中包含抗体截面中概述的抗体 ，并在室温下孵育1小时或在4°C下过夜
。将印迹洗涤3–4次
，每次用PBST/TBST洗涤5分钟，然后再在含有IRDYE二抗的5％牛奶中孵育 ，在室温下持续1小时。将印迹洗涤4次
，每次5分钟，并使用Li-Cor系统开发 。用膜开发的印迹与原代抗体一起孵育 在含有抗兔或抗小鼠HRP二抗二抗的5％牛奶中孵育之前 ，用PBST/TBST洗涤4次
，每次用PBST/TBST洗涤5分钟，在室温下孵育1小时
。将印迹每次洗涤4次 ，并使用薄膜和印迹底物（Thermo Fisher
，34075，1:10使用）或Amersham ECL选择Western印迹检测试剂（Cytiva ，RPN2235，用作提供或1:10和1:20））。 　　Akt（PAN）（40d4）小鼠单克隆抗体
，细胞信号2920S批次8，稀释1：1,000；抗HA高亲和力（3F10） ，Roche Diagnostics 11867423001批次45715900
，稀释1：1,000；抗小鼠IgG，HRP连接抗体 ，细胞信号传导
，7076S批次36，稀释1：5,000；抗兔IgG ，HRP连接抗体
，细胞信号7074S批次30，稀释1：5,000；抗大鼠IgG ，HRP连接抗体
，细胞信号7077S批次14，稀释1：5,000；GAPDH（14C10）兔单克隆抗体（HRP结合物） ，细胞信号3683批次4，稀释1：1,000；山羊抗人IgG（H+L）二抗
，Alexa Fluor 647，Invitrogen A21445批次2339821 ，稀释1：1,000；山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗
，HRP，Invitrogen 32430 Lot VD301382 ，稀释1：5,000；山羊抗兔IgG（H+L）二抗
，HRP，Invitrogen 32460 Lot VE30198 ，稀释1：5,000；HER2/ERBB2（D8F12）XP兔单克隆抗体
，细胞信号4290S批次6，稀释1：1,000；IGF-I受体β（D23H3）XP兔单克隆抗体 ，细胞信号9750S批次5-7
，稀释1：1,000；IGF1R（1H7），APC ，Ebioscience 17-8849-42批次2330467，稀释1：20;IRDYE 800CW驴抗小鼠IgG二级抗体
，LI-COR 926–32212批次D10414-15和D00930-09，稀释1：5,000；IRDYE 800CW山羊抗兔IgG二级抗体 ，Li-Cor 926–32211批次D10629-12和D01110-10
，稀释1：5,000；LC3B抗体，Novus生物学NB100–2220批次EU/EU-3 ，稀释1：1,000；活/死固定的紫罗兰死细胞污渍套件
，用于405 nm激发，Thermo Fisher L34964 Lot 2208471 ，稀释1：1,000；LRP6（C5C7）兔单克隆抗体
，细胞信号2560S批次11，稀释1：1,000；在小鼠 ，Sigma-Aldrich F3165 Lot SLCG2330和SLBT6752中产生的单克隆抗FLAG M2抗体
，稀释1：1,000；小鼠中产生的单克隆抗α-微管蛋白抗体，Sigma-Aldrich T9026批次099m4773v ，稀释1：10,000；PD-L1（E1L3N）XP兔单克隆抗体，细胞信号13684S批次18
，稀释1：1,000；磷酸化（Ser473）抗体， 细胞信号9271S批次15 ，稀释1：1,000；磷酸-IGF-I受体β（Tyr1135/1136）/胰岛素受体β（Tyr1150/1151）（19H7）兔单克隆抗体
，细胞信号3024S批次11，稀释1：1,000；磷酸-S6核糖体蛋白（Ser235/236）抗体 ，细胞信号2211S批次23
，稀释1：1,000；多克隆兔抗人C-ERBB-2 CNCOPOROTIN，AGILENT（DAKO）A0485 LOT 20083958 ，稀释1：1,000；S6核糖体蛋白（5G10）兔单克隆抗体
，细胞信号2217S批次10，稀释1：1,000；泛素单克隆抗体（P4G7-H11） ，Enzo ADI-SPA-203-F批次04062139
，稀释1：1,000；超叶纯化的人IgG1同种型对照重组抗体，Biolegend 403502批次B322065 ，稀释10μgml-1;Vinculin抗体，细胞信号4650S批次5
，稀释1：1,000；β-微管蛋白（9F3）兔单克隆抗体，细胞信号2128L批次11 ，稀释1：1,000 。 　　将SW48细胞以每15 cm盘以4000万细胞铺板24小时
。用特定的抗体处理24小时后
，将细胞冲洗一次，并在冰冷的PBS中冲洗一次 ，并通过在1 ml冰冷的PBS中刮擦。通过离心收集颗粒
，并以两个独立组的形式进行处理 。将颗粒裂解在9M尿素裂解缓冲液中（9m尿素，1 mM正叉烷酸钠 ，2.5 mM焦磷酸钠
，1 mMβ-甘油磷酸盐，20 mM HEPES ，pH 8.0）。使用Microtip在20 W输出5 s的3次爆发中对含有颗粒的裂解缓冲液进行超声处理
，然后在室温下以16,000g离心10分钟
。收集上清液，并使用BCA测定法进行蛋白质定量（Pierce ，23225）。每个样品使用大约500μg总蛋白质量进行还原，烷基化和消化 。第一个样品集是通过用100 mM 3- [4-（2-羟基乙基）-1-吡喃吡嗪基]丙烷基磺酸（EPPS）稀释至2 m的2 m来处理第一个样品
。用赖氨酸内肽酶（Lysc
，Wako Chemicals）以1:25在25°C下在25°C下消化约3毫克的蛋白质/样品；蛋白质：蛋白质比。LYSC消化后，用100 mM EPPS pH 8.0将2 m鸟宁中的肽稀释至0.5 m鸟嘌呤 。在37°C下用胰蛋白酶在1:50的37°C下用胰蛋白酶消化8小时；蛋白质：蛋白质比
。然后将1/10体积的45毫米二硫代硫醇（DTT）添加到清除的细胞裂解物中 ，并在第二组样品中在60°C下进行还原反应20分钟。在烷基化反应之前
，将反应在冰上冷却10-15分钟 。用110 mM IAA的1/10体积进行碘乙酰胺（IAA）的烷基化反应，并在室温下在黑暗中孵育15分钟
。用20 mM HEPES pH 8.0将9 M尿素缓冲液中的蛋白质稀释至2 m。用胰蛋白酶（Promega ，v5113）以1:50在37°C下在37°C下消化约500μg的蛋白质/样品 。 蛋白质：蛋白质比
。SEP-PAK VAC 1 CC（50 mg）TC18墨盒（WAT054960）用于清理消化的样品。将胰蛋白酶消化的裂解液用1/20的20％三氟乙酸（TFA）酸化
，并以16,000g离心15分钟，然后在SEP-PAK柱上应用 。用1 ml的100％乙腈预润湿SEP-PAK柱 ，并用2 mL的0.1％TFA溶液洗涤两次。将澄清的肽溶液加载到洗涤的柱上
。在用1 ml洗脱缓冲液洗脱两次（在0.1％TFA洗脱缓冲液中
，用1 ml洗脱缓冲液洗脱肽之前，将柱用3 mL的0.1％TFA洗涤一次。在使用Speed-VAC将样品干燥过夜之前 ，用肽分析（Pierce
，23275）对每个样品的肽量进行定量 。通过在3：1的比例中添加1 M EPP，pH 8.0（肽体积：1 M epps体积； 250 mM EPP最终） ，通过添加1 M EPP，pH 8.0调整了体积
。将每个样品中的50μg肽用200μg的TMTPRO试剂标记为5μL
，100％乙腈。将肽与TMTPRO试剂在25°C下孵育3小时 。将TMTPRO标记的肽用羟胺（最终0.5％）淬灭，并用三氟乙酸酸（最终2％）
。将样品组合在一起 ，用真空干燥的50 mg TC18 sep-paks脱盐。 　　对于Set-2
，在每样品中对100μg肽进行TMT标记 。将干肽重悬于100μl200 mM HEPES，pH 8.0缓冲液中
。将TMT试剂溶解在20μl无水乙腈中 ，并与肽溶液混合。在标签检查实验中
，TMT标记效率达到> 98％后，将样品合并在一起 。汇总样品用SEP-PAK C18色谱柱脱盐 ，并在速度VAC中干燥
。 　　将SET-1的干肽重悬于0.1％TFA中。将大约120μg的肽混合物在3x150 mm的柱上进行正交碱性pH反相分级分级
，并用1.9μmPoroshellC18材料（Agilent，Santa Clara ，CA）与缓冲液平衡的材料（Agilent
，Santa Clara，CA） ，用缓冲液A（5％乙腈在10 mmmmmonmmonmmonmmonmmonmmonmmonmmon bicarbonate，pH 8）中均衡 。利用45分钟的线性梯度从12％到45％缓冲液B（10 mM碳酸氢苯铵中的90％乙腈
，pH 8），以0.8 mL/分钟的速度分割肽。将96个分数合并为24个样品并真空干燥
。将样品重悬于stagetips上的0.1％TFA中 ，并真空干燥。将肽在5％甲酸 + 5％乙腈中重构进行LC-MS3分析 。从凝固的pH逆转液相色谱分解为96个级分
，并将其连接为24个馏分，从SET-2混合物中的干燥标记的肽进行分级
。用于分割肽的实验方法是从先前发表的Work30中采用的。用C18自旋尖端（Pierce ，84850）清理串联的级分
，并在LC-MS分析之前在Speed-VAC中干燥 。 　　在Dionex Ultimate 3000 RSLCNANO系统（Thermo Fisher）和Orbitrap Eclipse Tribrid MS（Thermo Fisher）（Thermo Fisher）上，将干燥的肽在LC缓冲液A（2％乙腈/ 0.1％甲酸）中重组
。在25 cm的长度和直径为75μm的Aurora串联柱上进行肽分离 ，并用1.6μmC18材料填充孔径为120Å（离子Opticks
，IO2575011997）。在400 nl min -1的流速下，缓冲液A（2％乙腈/0.1％甲酸）中的线性LC梯度为90分钟 ，缓冲液A（2％乙腈/0.1％甲酸）中的线性LC梯度为2％至30％缓冲液B（98％乙腈/0.1％甲酸） 。使用多键MS3-TMT方法和数据依赖模式进行样本分析
。扫描序列始于FTMS1光谱（分辨率= 120,000；质量范围（m/z）= 350–1,350;最大注射时间= 50 ms；归一化的AGC目标（％）= 250；动态排除= 35 s
，具有±10 ppm质量宽度窗口）。在数据依赖性扫描中，主扫描之间的时间为1 s ，为2-6作为电荷状态过滤器 。通过碰撞诱导的解离（CID）在离子陷阱中（CID碰撞能（％）= 35；最大注射时间= 100 ms;隔离窗口= 0.5 DA；归一化的AGC目标（％）= 150），通过碰撞诱导的解离（CID）分裂
。在ITM2采集之后
，进行了实时搜索（RTS）以评分肽，并仅选择高分肽以触发同步 - 前体选择（SPS）MS3定量。我们还使用线性判别方法来协助RTS步骤 。对于RT ，我们在半胱氨酸（57.0215 DA）和TMTPRO16PLEX（304.2071 DA）上使用氨基甲米甲基作为静态修饰。在可变修饰中
，选择了蛋氨酸（15.9949 DA）和TMTPRO16PLEX上酪氨酸（304.2071 DA）上的氧化
。附加的RTS参数为：最大差异裂解= 1;最大变量mod/肽= 1;启用FDR Filtring = true;前体中性损失（m/z）= 0.0;启用蛋白质关闭= true;每蛋白的最大肽= 3; 最大搜索时间= 35 ms。通过OrbitRap分析（HCD碰撞能量（％）= 40；分辨率= 50,000；最大入射时间= 350 ms；归一化AGC目标（％）= 250;隔离窗口= 1.2 DA），将进一步分离出多达8个SPS前体（HCD碰撞能量（％）= 40;分辨率= 50,000；分辨率= 50,000；分辨率= 50,000；分辨率= 50,000；分辨率= 350 ms；分辨率= 1.2 da） 。 　　使用COMET31搜索数据 ，以针对包括Uniprot Homo Sapiens蛋白质序列
，污染物和反向蛋白质序列的目标诱饵数据库搜索（版本2017/08）
。搜索参数为：肽质量公差= 25 ppm;酶特异性=完全消化；允许错过的切割= 2;可变修饰=蛋氨酸（15.9949 DA），TMTPRO（酪氨酸）= 304.2071 DA的氧化；片段离子公差= 0.4;静态修饰=半胱氨酸（57.0215 DA）和TMTPRO16PLEX（304.2071 DA）上的氨基甲基甲基在N末端和赖氨酸残基上。在先前发表的算法32,33之后 ，肽和蛋白水平数据分别通过2％FDR 。使用Mojave算法的搜索数据集进一步处理了基于TMT报告基于离子强度的定量
，其隔离宽度为0.7
。 　　如果PSM来自诱饵蛋白，则将其过滤掉；长度小于5的肽。隔离特异性小于50％；记者离子强度小于28噪声估计；来自多种蛋白质共有的肽；总结记者离子强度（在所有16个通道中）低于30,000 。在冗余PSM的情况下（即 ，一个MS运行中的多个PSM对应于同一肽离子）
，仅保留具有最小缺失值或最高隔离特异性或最高最大报告基因离子强度的单个PSM，以进行后续分析
。定量和统计分析由MSSTATSTMT v2.2.7（一种开源R/Bioconductor package35）进行。将来自同一TMT混合物的多个分数组合在MSSTATSTMT中 。特别是 ，如果在多个分数中鉴定出相同的肽离子，则仅保留具有记者离子强度最大求和的单个部分
。MSSTATSTMT从处理后的PSM报告中在蛋白质水平的所有样品中生成了归一化的定量报告。全球中位数归一化均衡了所有通道和TMT混合物中记者离子强度的中值
，以减少通道之间的系统偏差 。将映射到蛋白质映射到蛋白质的所有肽离子的归一化报告基因强度总结为每个通道和TMT混合物中的单个蛋白水平强度。对于SET-1，进行了汇总的蛋白质强度上的其他局部归一化 ，以减少两种TMT混合物之间的系统偏差
。对于局部归一化
，我们通过在每个蛋白质和TMT混合物的所有通道上平均创建了一个人工制品参考通道。然后，MSSTATSTMT将两种TMT混合物的参考通道中的蛋白质强度均衡到TMT混合物之间的参考通道的平均值 。然后 ， 它将相应的移位应用于每个TMT混合物的其余通道中的蛋白质强度
。MSSTATSTMT对归一化蛋白强度进行了差异丰度分析。MSSTATSTMT估计的Log2（折叠变化）和每种蛋白质的线性混合效应模型的标准误差 。通过应用经验贝叶斯收缩来调整推理过程
。为了测试没有变化的两侧无效假设
，将基于模型的测试统计数据与学生t检验分布与适合每个蛋白质和每个数据集的自由度进行了比较。调整了所得的P值以通过Benjamini -Hochberg的方法来控制FDR 。 　　鉴于RNF43和ZnRF3定位于质膜并暴露了ECD，评估了它们的结构域结构 ，揭示了与膜整合以及跨膜结构域相关的N末端信号肽的存在
。因此
，使用UniProtkB，SignalP软件和DeepLo​​c软件评估了已知的E3泛素连接酶的列表 ，以识别基于具有信号肽
，跨膜结构域以及是否已显示或预测到植物膜膜膜膜的推定细胞表面E3泛素连接酶。在确定的蛋白质中，我们评估了以下11个泛素连接酶：RNF13 ，RNF43，RNF128
，RNF130，RNF130 ，RNF133
，RNF148，RNF148 ，RNF149
，RNF150，RNF150 ，RNF150
，RNF167，RNF167 ，ZNRF3
，ZNRF3，和ZNRF4 。构建并用于生成稳定的HT29 ，SW48和ASPC1细胞系，用IRES-EGFP编码11个连接酶和C-末端标记标签的每一个中的每一个
，具有N端GD标签和C-末端标记标签
。使用流式细胞仪评估每个连接酶的细胞表面表现。简而言之，在96孔圆形的底板中 ，将父母和强力霉素诱导的GD – Ligase-Flag HT29细胞以每孔250,000个细胞铺板 。24小时后用1μgml -1强力霉素处理24小时以诱导连接酶表达。然后
，通过在5 mM EDTA中脱离，在FACS缓冲液中脱离并使用超叶纯化的人IgG1同种型对照重组抗体或在10μgml-1的抗GD原代抗体在冰上进行1 h染色1 h ，从而制备细胞进行FACS分析
，并使用超叶纯化的人IgG1同种型对照重组抗体进行染色
。然后用活/死的紫罗兰死细胞染色套件染色样品，以405 nm的激发在1：1,000时在冰上1：1,000 ，并使用Image-It固定溶液（4％甲醛
，无甲醇）（Thermo Fisher，R37814）进行固定（R37814） 在室温下15分钟。将板储存在4°C ，直到进一步的流式细胞仪分析 。为了评估强力霉素诱导
，检查了IRES-EGFP信号
。从三个独立的实验中量化了647 MFI和GD + 647个阳性细胞的百分比。作为测定对照，还评估了亲本细胞 。此外 ，并行处理未染色的样品并用于门控策略
。 　　与流式细胞仪分析并行，使用HT29和SW48强力霉素诱导的GD – Ligase-Flag细胞来评估每个假定的细胞表面结扎酶的降解潜力。24 h强力霉素诱导后
，用1-2μgml-1 gd*igf1r，gd*her2或gd*pd*pd*pd-l1双特异性蛋白酶或相应的NIST对照组对细胞进行处理24-48 h 。然后将细胞裂解并制备进行蛋白质印迹分析 ，以检查双特异性抗体处理后每个靶标的总水平
。 　　数据表示为平均值±S.E.M.除非另有说明。除非另有说明
，否则所有实验至少复制两次 。这些实验均未蒙蔽，也没有使用统计方法来预先确定体内实验
。每个实验使用的动物数量在相关的数字和传说中指定 ，并根据每个模型观察到的肿瘤服用率和生长的变化进行估计。关于随机化
，对于皮下移植，当肿瘤达到平均体积约为200-400 mm3时 ，将小鼠分布在治疗组之间 。使用Prism版本8.0和9.0（GraphPad软件）。 　　除了hibit-lgbit纳米 - 荧光素酶技术和小鼠示意图外
，所有的漫画和原理图都是由Adobe Illustrator为此手稿生成的
。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。