如前所述 ，细胞在LB（1％胰蛋白
，0.5％酵母提取物，0.5％NaCl）或最小M9培养基中生长 ，并补充了0.2％casamino -nimed35和0.2％的葡萄糖 。使用了以下抗生素浓度：氯霉素
，25μgml -1；卡纳米霉素，25μgml -1;庆大霉素 ，30μgml -1（铜绿假单胞菌）或15μgml -1（大肠杆菌）；碳苯霉素
，200μgml -1（铜绿假单胞菌）或50μgml -1（大肠杆菌）
。在补充表2中列出了本研究中使用的质粒。在补充表3中列出了本研究中使用的细菌菌株 。报告的实验中使用的所有铜绿假单胞菌菌株都是PAO1的衍生物
。在补充表4中列出了本研究中使用的引物。除非另有说明，否则聚合酶链反应（PCR）是使用Q5聚合酶（NEB M0492L）进行克隆目的进行的 ，而GoTaq绿色DNA聚合酶（Promega M7123）进行了诊断 。分别使用纯质量微型剂试剂盒（CW Biosciences CW0500M）或DNA清洁套件（CW Biosciences CW2301M）纯化质粒DNA和PCR片段
。有关应变和质粒构建的详细信息可以在补充信息中找到。没有使用统计方法将用于实验的预先确定样本量，但样本量与现场标准相一致 。 　　如先前所述
，分离出过表达时有毒的Mura等位基因36，并进行了轻微的修饰。首先 ，使用引物对15/76在五个单独的反应中使用纯化的PKH37质粒从纯化的PKH37质粒中通过PCR用PCR（NEB M0267L）诱变
。然后
，使用Q5聚合酶（NEB M0492L）在50 µl反应中，分别将五个结果的Mura*池中的500 ng数量分别用作大键二聚体 ，以扩增50 ng的PKH37。2）95°C 50 s;3）60°C持续50 s；4）72°C持续10分钟；5）重复步骤2–4
，总共25个周期 。随后将二十个DPNI单位（NEB R0176L）添加到每个反应中，并使未膨胀DNA的消化在37°C下进行1.5 h
。使用0.025 µm混合纤维素酯膜（Millipore VSWP02500）在Milli-Q水上漂浮20分钟。然后将每种透析产物的12 µl体积分别转化为100 µL Neb-5-Alpha电代替大肠杆菌（NEB C2989K） ，并在SOC OutgreWth培养基（NEB B9020S）中回收
，并通过将其铺设到LB Agar Agar Admentepto congrowth培养基（NEB B9020S）中，并与LB Agar Admente condection confections contressionals conflowthe congrawth培养基 。分别合并了五个文库中每个文库中每个库的大约100万个菌落 ，并使用PurePlplasmid Miniprep套件（CW Biosciences CW0500M）纯化PKH37衍生物
。 　　PAO1在25 mL lb的37°C下生长
，在37°C下过夜，以12,000克离心5分钟 ，并重悬于相等的体积300毫米的蔗糖中。重复离心和重悬的步骤，总共进行四次洗涤 。在以12,000克为止的最后离心5分钟后
，将细胞颗粒重悬于原始体积的1/20中
。将1.2 µg量的PKH37衍生的文库分别转化为150 µL电位的PAO1。在37°C下在LB中回收转化反应1小时，并通过将生长镀到补充的LB琼脂上 ，选择转化子
，并补充了30 µg ML -1庆大霉素 。每个图书馆的殖民地大约有1200万个殖民地分别汇总
。 　　为了识别具有穆拉有毒等位基因的PKH37变体，每个PAO1×PKH37*库被稀释至600 nm（OD600nm）的光密度 ，在3 ml lb中的600 nm（OD600nm）的0.01的0.01
，并补充有30 µg ml -1 gressamycin，在37°C ，在37°C下在37°C下生长2 h 45 min。将IPTG添加到每种培养物中的最终浓度为1 mm
，并在37°C下再孵育2小时 。然后，使用DNA清理试剂盒（CW Biosciences cw2301m）将每种培养物在21,130g的21,130克离心5分钟 ，并从每个文库中释放出DNA。随后将纯化的DNA重新转换为如上所述制备的PAO1电竞争细胞
，并通过在补充了庆大霉素的LB琼脂上选择转化子
。然后将所得的菌落贴在含有和不含1 mM IPTG的庆大霉素的LB琼脂板上，并在37°C下过夜。由IPTG敏感分离株编码的MURA等位基因通过使用引物对15/76来确定Sanger测序 。 　　通过将其通过大肠杆菌XL1-RED传播 ，将PKH100诱变
。PKH100转化为XL1-RED，接种了五种独立的培养物
，每种培养物使用四种独特的转化体。一整夜传播后，使用PurePlapsId MiniPrep试剂盒（CW Biosciences CW0500M）纯化质粒 ，以创建五个PKH100*库 。PAO1在25 mL lb的37°C下生长
，在37°C下过夜，以12,000克离心5分钟 ，并重悬于相等的体积300毫米的蔗糖中
。重复离心和重悬的步骤
，总共进行四次洗涤。在以12,000克为止的最后离心5分钟后，将细胞颗粒重悬于原始体积的1/20中 。每个PKH100*的1.2 µg量分别转化为150 µl电位的PAO1
。在37°C的LB中回收了转化反应1小时 ，并通过将生长镀到补充庆大霉素的LB琼脂上
，选择转化子。每个文库的大约1-100万个菌落分别合并，并在-80°C下存储在LB + 10％二甲基硫氧化物（DMSO）中 。 　　将PAO1×PKH100*库放在补充30 µg ML-1庆大霉素和1 mM IPTG的LB琼脂上 ，该培养基仅允许生长占所有群体形成单元的大约0.3-1％
。每个池的总共17或18个抗IPTG抗性菌落被纯化
，并且来自每个分离物的F – Mura（C117S）*的表达水平和分子量通过LB生长后的Western Blot分析确定，并在中型期间诱导1 h。只有那些具有表达水平和与F – Mura（C117s）一致的分子量的分离株进行了Sanger测序 ，并用引物为15和76进行Sanger测序 。在分析的五个库中的三个中，F – Murawt回收了。F – Murac117s/g58d和F – Murac117s/e406k均在五个库之一中回收
。 　　有关蛋白质纯化的详细信息可以在补充信息中找到。 　　将在30°C或37°C下生长的过夜培养物以12,000克离心2分钟
，并重悬于LB中的OD600Nm 。将重悬在LB中连续稀释至10-6，并将每个稀释度的5 µL发现在补充有适当诱导剂和抗生素的LB琼脂上
。将板在37°C孵育过夜 ，并使用配备尼康AF-S微型Nikkor 40毫米镜头的Nikon D3400摄像头进行成像。 　　将隔夜培养物稀释至3毫升磅的OD600Nm
，在37°C下生长4小时，并将2 mL在12,000克下离心3分钟 。在必要时 ，将IPTG添加到1 mM或阿拉伯糖中添加到0.1％1小时之前
，然后收集培养物
。将细胞沉淀重悬于1×SDS样品缓冲液中的20 nm（50 mM Tris pH 6.8，10％甘油 ，2％SDS
，0.2％Bromophenol Blue，1％β-氯乙醇）中 ，并在100°C煮沸10分钟。随后使用QSONICA Q800R3超声器对裂解液进行超声处理
，其30个周期为1 s，幅度为25％的1秒钟 。使用非互干蛋白测定试剂盒定量蛋白质浓度（G-Biosciences 786-005）
。将10 µg的蛋白质加载到10％聚丙烯酰胺-SDS凝胶上 ，并在150 V处进行70分钟的电泳。使用混合分子量量方案将蛋白质转移到PVDF膜上，在Bio-Rad Trans-blot涡轮转移系统上
，将膜在TBST（20 mm Tris pH 8.0，200 mm NaCl ，0.05％Tween-20）中阻塞
，在室温下用5％牛奶在室温下进行1 h 。然后用抗HIS（Genscript A00186-100），抗FLAG（Sigma F7425）或抗RPOA（Biolegend 663104）探测膜 ，分别在TBST + 5％牛奶中
，分别稀释1：3,000，1：3,000 ，1：3,000
，1：3,000或1：100,000
。将膜在TBST中每次洗涤3次，持续5分钟 ，并用过氧化物酶偶联的山羊 - 抗小鼠（Rockland 610-1302）或兔TrueBlot探测：抗兔IgG HRP（Rockland 18-8816-33）在TBST + 5％牛奶中稀释1：3,000
，在室温下为1小时。将膜在TBST中每次洗涤3次，持续5分钟 ，并用SuperSignal West Pico Plus化学发光底物（Thermo 34580）开发，并使用Azure Biosystems C600 Imager成像 。 　　为了以公正的方式识别PALPXC的体内相互作用伴侣
，在复制样本中使用了两个共亲密纯化方案。具体而言，在条件1中 ，使用150 mm NaCl用于裂解和洗涤缓冲液
，但在裂解和洗涤缓冲液中使用了2，300 mm NaCl
。夜间铜绿假单胞菌培养物在500 mL lb中稀释至OD600Nm = 0.01 ，并在37°C生长至早期对数期。在PA1009的情况下
，收集前1小时以0.5％的阿拉伯糖诱导培养物 。The entire culture was subjected to centrifugation at 13,000g for 10 min and the pellets were resuspended in 4 ml of lysis buffer (50 mM Tris pH 7.5, 2% glycerol, 5 mM imidazole, 1% Triton X-100, and 150 mM or 300 mM NaCl) and cells were lysed by sonication with a Q125 Qsonica sonicator.通过在4°C下以21,130克离心15分钟，将细胞碎屑与Ni-NTA树脂（QIAGEN 30230）混合在4°C下旋转1.5 h
。用6毫升洗涤缓冲液（50 mM Tris pH 7.5 、2％甘油 ，25 mM咪唑
，1％Triton X-100和150 mm或300 mM NACL洗涤树脂四次。在洗脱缓冲液中从树脂中洗脱蛋白质（50 mM Tris pH 7.5
、2％甘油，250 mM咪唑 ，0.1％Triton X-100和150 mM NaCl） 。将洗脱酸与2×SDS样品缓冲液（100 mM Tris pH 6.8、20％甘油
，4％SD，0.4％SD ，0.4％溴酚蓝蓝色）混合在一起，将40 µL加载到4–20％的聚丙烯酰胺迷你Prototean TGX凝胶上（Bio-Rad 4568094）和80分钟的Electolosis
，并分25分钟
。随后将凝胶用Coomassie R-250染色，并切除整个车道进行质谱分析。 　　切开的车道切成大约1毫米3件 。然后将凝胶片进行经过修饰的凝胶胰蛋白酶消化过程37
。将凝胶片洗涤并用乙腈脱水10分钟 ，然后去除乙腈。然后将碎片完全干燥在速度空中 。将凝胶片用50 mM碳酸氢铵溶液补充水化
，其中含有12.5 ng µl-1修饰的测序级胰蛋白酶（Promega），在4°C下
。45分钟后 ，除去多余的胰蛋白酶溶液并用50毫米碳酸氢铵溶液代替
，以覆盖凝胶片。然后将样品放在37°C的房间中过夜 。随后通过去除碳酸氢铵溶液提取肽，然后用含有50％乙腈和1％甲酸的溶液进行一次洗涤。然后将提取物在速度VAC（约1小时）中干燥
。然后将样品存储在4°C直至分析。 　　在分析当天 ，将样品在5-10 µL高性能液相色谱（HPLC）溶剂A（2.5％乙腈
，0.1％甲酸）中重组 。通过将2.6 µm C18球形硅珠包装到融合二氧化硅毛细管中（内径为100 µm×约30 cm长）中，创建了一个纳米级反向HPLC毛细管柱 ，并用火焰吸引尖端38
。平衡列后
，将每个样品使用FAMOS自动采样器（LC包装）加载到列上。形成梯度，并用浓度增加的溶剂B（97.5％乙腈 ，0.1％甲酸）洗脱肽 。 　　当肽洗脱时，它们进行了电喷雾电离
，然后进入LTQ Orbitrap Velos Pro离子陷阱质谱仪（Thermo Fisher Scientific）
。检测到肽，分离和碎片 ，为每种肽的特定片段离子产生串联质谱。肽序列（以及因此蛋白质身份）是通过将蛋白质数据库与软件程序序列V28（Rev 。13; Thermo Fisher Scientific）匹配的蛋白质数据库来确定的
。39。所有数据库均包含所有序列的反向版本
，并且将数据滤波为肽误差率为1-2％ 。仅报道了显示以下标准的蛋白质：在两个PA1018样品中检测到的至少五个独特的肽；与相应的PAO1和PA1009样品相比，两个PA1018样品中至少富集了三倍
。 　　铜绿假单胞菌菌株的过夜培养物编码H – PALPXC ，F – Pamura（WT）和F – Pamura（C117S）的组合组合
，在50 mL lb中稀释至OD600Nm = 0.01，并在37°C下生长2.5 h。将IPTG添加到每种培养物中的最终浓度1 mM中 ，并在37°C下再培养30分钟
，然后将DMSO添加至0.1％，Chir-090至0.5 µg ml-1（指示） 。将培养物在37°C下孵育一个小时 ，并通过12,000克离心10分钟。将细胞在1 mL lb中洗涤
，并通过12,000g离心2分钟
。将细胞重悬于1 ml裂解缓冲液中（25 mM Tris pH 8.0，150 mM NaCl ，2％甘油，0.1％Triton X-100
，5 mm咪唑，0.1％DMSO ，有或没有0.5 µg ML-1 CHIR-090的不带有或没有指示的0.5 µg Ml-1 CHIR-090
，并在40％上裂开了15 s CATE，并在40％上裂开。通过在4°C下以21,130g的两个连续离心步骤阐明提取物5分钟 ，并用非交换蛋白质测定试剂盒（G-Biososciences 786-005）确定蛋白质浓度 。将上清液稀释至500 µL裂解缓冲液中的3.5 mg ML-1蛋白
，并与25 µl填充的Ni-NTA树脂混合（Qiagen 30230）
。将混合物在4°C下孵育3 h旋转的末端。用500 µL洗涤缓冲液（25 mM Tris pH 8.0，150 mM NaCl ，2％甘油
，0.1％Triton X-100，25 mM咪唑 ，0.1％DMSO
，有或没有0.5 µg ML-1 CHIR-090），将珠洗涤3次 。将蛋白质在40 µL洗脱缓冲液中洗脱（25 mM Tris pH 8.0 ，150 mm NaCl，2％甘油
，0.1％Triton X-100，500 mm咪唑）
。 　　通过SDS -PAGE在10％聚丙烯酰胺凝胶中分辨出每个输入样品和10 µL洗脱样品的10 µg蛋白质。使用混合分子量质量方案将蛋白质转移到PVDF膜上 ，并在Bio-Rad Trans-blot涡轮转移系统上转移到PVDF膜上
，并在室温下在TBST + 5％牛奶中阻断膜，持续1小时 。然后用抗HIS（Genscript A00186-100）或抗flag（Sigma-Aldrich F7425）探测膜 ，在室温下在TBST + 5％牛奶中稀释1：3,000
，持续1小时
。将膜在TBST中每次洗涤3次，持续5分钟 ，并用过氧化物酶偶联的山羊 - 抗小鼠（Rockland 610-1302）或兔TrueBlot探测：抗兔IgG HRP（Rockland 18-8816-33）在TBST + 5％牛奶中稀释1：3,000
，在室温下为1小时。将膜在TBST中每次洗涤3次，持续5分钟 ，并用SuperSignal West Pico Plus化学发光底物（Thermo 34580）开发
，并使用Azure Biosystems C600 Imager成像 。 　　将纯化的F – PALPXC和H-MURA变体在共纯化缓冲液中均稀释至2.5 µm（25 mM Tris pH 8.0，150 mm NaCl ，10％甘油，1 mM Dithiothreitol（dtt）
，0.5％DMSO），最终体积为100 µl
。当指示时 ，将CHIR-090添加到5.7 µm。将混合物在冰上孵育30分钟
，然后将85 µL的每种混合物添加到相等体积的抗FLAG M2磁珠（Sigma-Aldrich M8823）中，并在4°C下孵育1 h旋转终端 。用磁架收集珠 ，并用300 µL的共纯化缓冲液和200 µL共纯化缓冲液洗涤两次。指示时
，将5.7 µm Chir-090保持在洗涤缓冲液中
。用85 µL洗脱缓冲液（25 mM Tris pH 8.0，150 mM NaCl ，10％甘油
，1毫米DTT，100 µg µl-1 FLAG肽（Millipore Sigma Sigma F3290））洗脱蛋白质 ，并通过在室温下孵育30分钟的旋转式旋转式旋转端端。通过在4–20％聚丙烯酰胺迷你蛋白酶TGX凝胶（Bio-Rad 4561095）中分辨出输入样品（5 µL）和洗脱样品（15 µL）
，并在Coomassie染色中检测到蛋白质 。 　　在500 µL的SEC缓冲液1（10％甘油，0.33％DMSO ，1 mM DTT，1 mm DTT
，25 mm Tris pH 8.0和150 mm Nacl）中，将F – PALPXC和H -PAMURA（WT）单独或组合分别稀释至7.5 µm
。指示时 ，将CHIR-090添加到37.5 µm中。随后
，使用配备了SUPERDEX 200 10/300 GL柱的ATAPURE系统对混合物进行SEC进行，该系统用SEC缓冲液2（10％甘油 ，1 mM DTT
，25 mM TRIS pH 8.0和150 mm NaCl）进行平衡，每0.35 mL收集 。For F–PaLpxC and H–PaMurA(WT) mixtures, three fractions corresponding to the shifted peak (14.1–15.2 ml with no CHIR-090, 13.8–14.8 ml for with CHIR-090) were pooled and concentrated by centrifugation at 4 °C using centrifugal filters with a molecular weight cutoff of 10-kDa (AmiconUFC801024）
。如上所述 ，将浓缩蛋白重新提交为SEC在SuperDex 200 10/300 GL柱上。在4–20％聚丙烯酰胺迷你蛋白酶TGX凝胶（Bio-Rad 4568094）上解析了15 µL相关的馏分
，并用COOMASSIE染色检测到蛋白质 。 　　在30°C下生长过夜的培养物在12,000克固定2分钟，并重悬于新鲜LB中
。将培养物在200 µl lb中的96孔微晶板中稀释至OD600nm。在37°C下 ，在Tecan无限的M-Plex读板​​读取器中生长培养物
，并在每个时间点以1毫米轨道摇动每4分钟监测OD600Nm 。 　　将隔夜培养物稀释至25 ml lb培养物中的OD600Nm为0.01，并在37°C下生长4小时
。对于在诱导剂存在下生长的穆拉和脑袋止动菌株 ，在整个产物中存在1 mM IPTG。对于MURA和LPXC过表达菌株，在生长3小时后
，增加了1 mM IPTG或0.1％阿拉伯糖，并继续孵育一个小时 。将每种培养物的20毫升体积以12,000克离心5分钟 ，然后将沉淀在1 ml lb中洗涤
，然后以12,000克离心2分钟。将颗粒重悬于LDS样品缓冲液（Invitrogen np0008） + 4％β-马c-甲醇中的OD600Nm，并在100°C煮沸10分钟
。用Q125 Qsonica超声量以25％的幅度对样品进行超声处理1 s ，为30个周期的1 s关闭
，并使用非交流蛋白质测定试剂盒确定蛋白质浓度（G-Biososciences 786-005）。如上所述，将5 µg的蛋白质加载到15％聚丙烯酰胺-SDS凝胶上 ，并在150 V处进行70分钟的电泳
，然后在RPOA的蛋白质印迹分析中如上所述 。对于LPS凝胶，将50 µL的每个样品与1.25 µL蛋白酶K（NEB P8107S）混合 ，并在55°C下孵育1小时
，然后在95°C下孵育10分钟
。在100 V时在100 V时在4–12％标准XT Bis-Tris凝胶（Bio-Rad 3450124）上分辨出10 µg蛋白质的等效体积，持续1 H 45分钟 ，如先前所述，银色染色检测到LPS。简而言之
，凝胶是通过在200 ml的40％乙醇中孵育固定的，过夜5％乙酸 。将周期酸加入0.7％ ，并允许孵育5分钟
。随后在2小时内用200 ml超纯水的3个变化的3个变化洗涤凝胶。将凝胶用150 mL新鲜制成的染色溶液（0.018 N NaOH
，0.4％NH4OH和0.667％硝酸银）浸渍10分钟，随后在2小时内用200 ml超纯水进行了三种变化 。凝胶是用200 mL新鲜准备的开发人员解决方案开发的 （0.26毫米柠檬酸pH 3.0 ，0.014％甲醛）
，发育停在100 mL的1％乙酸中
。凝胶是在Bio-Rad Chemidoc MP成像系统中成像的。 　　隔夜培养物被稀释至3 mL lb的OD600nm，适用于1 mM IPTG 。将培养物在37°C下生长2.5 h ，并在适当的情况下添加到以下浓度：0.5 µg mL-1 CHIR-090
，64 µg ml-1 fosfycomin或0.5 µg ML-1 CHIR-1 CHIR-090 + 16 µg ML-1 FOSFOSSFOMEFOMYCIN
。将培养物在37°C下生长1.5 h，并在12,000克固定1毫升培养物2分钟。将细胞颗粒重悬于LB中的OD600Nm为10 ，在LB + 1.5％琼脂垫上发现
，并在配备有100倍物镜和光图COOLSNAP HQ2摄像头的Nikon Eclipse 50i显微镜上成像 。使用斐济图像分析平台版本2.3.0/1.53Q41对图像进行统一编辑。使用以下设置使用ImageJ的Microbej插件（版本5.13i）对细胞宽度进行定量：面积：250 – MAX，长度：3–100 ，宽度：5–25，宽度变化：0-0.25
，宽度对称性：0-1，循环 ，圆形
，圆形，0.01-1
。D'Agostino和Pearson测试以及Prism（GraphPad Software ，LLC）进行的D'Agostino和Pearson测试以及Anderson -Darling测试都缺乏每个人群的正态性。统计显着性由Prism（GraphPad Software
，LLC）进行的Kruskal – Wallis测试确定 。显微镜源图像可在https://doi.org/10.5281/zenodo.7455522（参考文献42）获得
。 　　将过夜培养物稀释至200 mL lb的OD600Nm，在37°C下生长3小时 ，并将IPTG添加到最终浓度为1 mm。在37°C孵育一个小时后
，通过以12,000克离心5分钟收集细胞 。在LB中重悬后，通过12,000g离心2分钟 ，将细胞重新固定
。然后将沉淀重悬于400 µL HPLC级H2O中。随后
，将250 µL氯仿和500 µL甲醇添加到混合物中 。将样品剧烈涡旋，将其放在冰上10分钟 ，然后在4°C下以21,000克旋转
。收集500 µL水溶液的体积，并在30°C下在旋转蒸发器中干燥过夜。将干材料重悬于100 µL超纯H2O中
，并通过液相色谱 - tandem质谱法（LC – MS/MS）检测到PALPXC产物和底物，如下所述 。 　　在结合缓冲液（25 mM Tris pH 8.0 ，150 mM NaCl
，6％甘油中）中，将纯化的F – PALPXC和H -MURA变体稀释至200 nm ，以最终体积为15 µL
，并使混合物平衡至30°C，持续10分钟
。反应是通过添加15 µL的底物混合物（25 mM Tris pH 8.0 ，150 mM NaCl
，4％DMSO，200 µM UDP-3-O-（R-3-羟基二烷酰基）-GlCNAC（carbosynth MU75071） ，在5或10分钟的反应中
，在5或10分钟的反应中，该次数是在30分钟的范围。45 µl 2％乙酸 。将停止反应冷冻在干冰上 ，冻干，并将冻干材料重悬于60 µL H2O中。如下所述
，LC -MS检测到PALPXC产品和底物
。如上所述，单独使用纯化的F – palpxc确定反应的线性范围 ，并在1 、2
、5、10 、15或20分钟后停止反应（扩展数据图5B）。单独的H -Pamura（WT）和H -Pamura（C117S）表现出LPXC活性的背景水平
，证实观察到的LPXC活性并不是由于蛋白质制备中的污染或Pamura的替代性酶活性（扩展数据图6E） 。 　　如上所述，对肺炎乳杆菌和大肠杆菌LPXC – Mura对进行了活性测定 ，除了最终反应混合物中H – Mura变体的浓度为200 nm
。10分钟后
，肺炎乳杆菌反应停止，并在1分钟后停止大肠杆菌反应。 　　为了量化LPXC在体外的活性 ，通过LC-MS在Agilent Technologies 1200系列HPLC系统上检测到PALPXC产物和底物
，与具有电喷雾电离电离 - 质量质量光谱仪在负模式下运行的Agilent 6520 Q-TOF质谱仪一致 。Samples were separated on a Waters Symmetry C18 column (5 µm; 3.9 mm × 150 mm) with a matching column guard using the following method: flow rate = 0.5 ml min−1, 95% solvent A (H2O, 10 mM ammonium formate) and 5% solvent B (acetonitrile) for 5 min followed by a linear gradient of solvent B from 5–80% over 20 min.Agilent Masshunter工作站定性分析软件版本B.06.00用于分析MS数据
。通过监测776.21 m/z的丰度来量化PALPXC底物（UDP-3-O-（R-3-羟基二烷酰基）-N-乙酰葡萄糖胺），并将其分析为单个峰 ，从而集成以推断底物浓度。通过监测734.1944 m/z的丰度来量化PALPXC产品（UDP-3-O-（R-3-Hydroxydecanoyl） - 葡萄糖胺） - 葡萄糖胺）经常以前报道的峰值为多个峰
，并经常被解析为多个峰 。 　　通过LC-MS/MS分析与上述适应性的LC-MS分析相同的设置，通过LC-MS/MS分析了甲醇 - 氯仿的全细胞裂解物的PALPXC底物和产物
。M/Z为776.1986（对应于PALPXC底物）的母离子和M/z为734.1872（对应于PALPXC产物）的MS/M/Z ，分析了MS/MS，碰撞能量为40。碰撞能量为40 。片段离子在50至850 m/z之间
。通过整合分别为776.1986 m/z和734.1872 m/z的峰来量化PALPXC底物和产物的相对丰度。RAW LC – MS/MS数据可在https://doi.org/10.5281/zenodo.7455522（参考文献42）中找到 。 　　将纯化的MURA变体稀释至200 nm（对于Pamura（WT）
，Pamura（G58D）和Pamura（E406K））或2 µM（对于Mura反应缓冲液中的PAMURA*变体）（25 mm Tris pH 7.75，6％甘油）到最终的25 µL和允许25 µL的允许量和允许的温度等于25 mm pH 7.75 ，6％甘油
，以实施25 mm的温度。该反应是通过添加25 µL Mura底物混合物（25 mM Tris pH 7.75，2 mM UDP-N-乙酰葡萄糖胺（Sigma-Aldrich U4375）和1 mM磷酸烯醇丙酮酸（Sigma-Aldrich 10108294001）和30分钟的反应
。通过添加800 µL Lanzetta试剂（0.033％的孔雀石绿 ，1％moleybdate
，1 N HCl，0.2％Triton X-100）44添加了反应 ，并在室温下孵育1.25 min
，然后再添加100 µl 34％Citrate。在室温下再孵育30分钟后，确定了每个样品的600 nm（A660Nm）的吸光度 。用在超纯水中稀释的NAH2PO4制成的标准曲线用于量化反应释放的游离PI的量
。 　　使用Alphafold19的默认参数预测了LPXC -Mura复合物的结构。铜绿假单胞菌PAO1 LPXC和MURA序列或大肠杆菌MG1655 LPXC和Mura序列通过包含15个重复的Gly-Gly-Gly-ser的接头分离 ，该连接器未显示为澄清 。使用Chimerax版本1.1.1（参考文献45）可视化结构
。 　　我们试图使用进化协变量来预测LPXC – Mura相互作用所具有或不存在的生物。我们使用EVCOMPLEX运行使用EVCOUPLINGS V0.0.5（参考文献18）
，由Alphafold模型告知，根据复合物的推断成对相互作用项来定义相互作用得分 ，并验证了我们提出的复杂结构 。 　　我们首先使用Jackhammer v3.1b2（参考文献46）生成了LPXC和MURA的多个序列对齐，并在2021年2月在Uniref100 DataSet47上进行了五次迭代
。作为初始序列。在每种情况下
，对齐构建的比对构建的序列评分阈值范围从0.1到0.8位，这并不能有意义地更改物种或蛋白质的序列 。从这两种物种开始时 ，收集了相同的序列
。对于所有分析
，我们首先以54,940 Mura和23,634 LPXC序列的比对开始，该序列是由0.8的相对比特孔产生的 ，然后为每个物种的串联Mura和LPXC序列串联
，通过在每个物种中选择与原始P.eruginosa Homologue最接近的每个物种中的序列相结合的歧义，从而解决了歧义。最终的串联比对包含11,834个序列 。从该串联的多个序列比对 ，使用伪样最大化48确定进化耦合。 　　我们更仔细地分析了直接耦合分析模型的前五位排名间耦合（JIJ）
，该模型对应于Alphafold2模型中的结构接触中的氨基酸位置对，定义为具有9Å以内的Cα原子
。可以根据模型的适当项在Mura位置I和LPXC位置J之间的耦合上对每对序列进行评分。总结每个物种的这五个分数 ，我们观察到了双峰分布（扩展数据图9C） 。我们仅选择了一对序列
，在五个分数中的总和超过0.1，总计1,689个序列对（扩展数据图9C） ，并从串联比对的这些序列上训练了一个新的EVCOMPERX模型
。在此模型中，前六个分子间耦合中的五个对应于Alphafold2结构中的预测触点（扩展数据图9D）。我们根据该精制模型的前20个耦合项定义了最终的“交互分数”
，并将其再次在串联对齐中为所有11,834对序列进行评分 。序列分析文件可在https://doi.org/10.5281/zenodo.7455522（参考文献42）中获得
。前20个术语是任意选择的，但是这种确切的选择并没有有意义地影响下游分析 ，并且对于五到五百之间的顶级耦合的选择
，有关相对相互作用得分的所有结论仍然是正确的。 　　为了估算每个进化枝中相互作用序列的百分比，我们使用Sklearn V1.0.2（参考文献49）（参考文献49）为所有序列对的相互作用评分拟合了两个组分的高斯混合模型 ，并计算了从上部分布中得出的每个序列的后验概率 。我们使用ETE3 v1.3.2（参考文献50）将每个序列对的分类标识符映射到国家生物技术信息分类数据库中的类别
，并鉴定2,459个alphaproteobacteria和2,781个gammaproteobacteria
。然后，我们估计每个进化枝中相互作用序列的预期分数是该进化枝中每个序列的相互作用概率的平均值。 　　为了可视化这些序列的系统发育结构 ，我们从串联的多个序列对齐2.1.11版本中构建了MURA和LPXC的最大样本系统发育（参考文献51） 。相互作用评分在Python v3.8.8中映射到树上
，并用生命的互动树（itol）V5（参考文献52）进行可视化
。可以在https://github.com/samberry19/evcomplex-interaction-scoring或https://doi.org/10.5281/zenodo.7471436上找到本研究中使用的自定义代码。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。