其他实验细节在补充方法中 。没有使用统计方法来预先确定样本量。实验不是随机的，研究人员在实验和结果评估过程中并未对分配视而不见
。 　　这项工作中进行的所有实验均由斯坦福大学医学学院机构审查委员会批准 ，并根据协议编号进行。28908 。所有在组织采购之前对这项研究做出贡献的患者的书面知识同意，并遵守了相关的指南和法规
。从叶切除术中丢弃的外科手术组织获得内脏胸膜1 cm内的外周肺组织。对于怀疑肺癌的患者
，延迟了临床T4（美国联合癌症委员会第6版）疾病（例如，支气管侵袭或实质卫星结节/转移酶）的疾病 。在肺切除术的情况下 ，从最远端的肺边缘去除正常组织
，从最远端的远端切除到明显明确的病变，或者从未涉及的叶中取出
。推迟了具有含有不确定边缘的肿瘤的样品。将组织新鲜处理 ，或在4°C下储存过夜
，并在第二天早晨进行处理 。 　　To isolate distal airway cells, lung parenchyma from 1 cm from the visceral pleura was mechanically dissociated with Castro scissors, washed and incubated with 5 units per ml porcine elastase (Worthington), 100 Kunitz units per ml DNase I (Worthington), and Normocin (InvivoGen), and resuspended in two tissue volumes of lung organoid medium,由添加了10 mM烟酰胺，N-乙酰基半胱氨酸的晚期DMEM/F12（Invitrogen） ，1×B27补充减去维生素A
，重组人Noggin（100 ng mL-1，R＆D系统）NM ，Tocris）
。除扩展数据中所示的肺类器官介质用于所有实验。然后将组织在37°C下搅拌1小时
，并通过100–40μm细胞过滤器过滤所得的细胞悬浮液，并经受氯化铵红细胞细胞裂解 。然后将细胞沉淀洗涤并重悬于10体积的生长因子基底膜提取物II（Trevigen）中
。然后将基质中的细胞铺在50μl液滴中的24孔板中 ，并在每3-4天在室温下固化10分钟后添加温暖的培养基，并通过与Tryple解离每3-4周一次传递每3-4周。传代基于ECM耐用性和完整性和估计的器官汇合
，以估计的ECM液滴体积估计的器官量来判断 。远端肺类器官可以通过最初每2周的6-7倍的基底器官传递约6个月。肺泡类器官每2周的初始速率每两倍的初始速率延伸得更慢，但几个月后占主导地位
。根据初始细胞分裂速率计算得出的基础和肺泡膨胀的上限分别为219（524,288倍）和216（65,536倍）。为了排除恶性细胞污染 ， 由董事会认证的病理学家系统地评估了长期培养物的发育不良或癌 。此外
，五个长期的器官培养物（2-6个月）进行了针对的下一代测序，以排除病原核苷酸变体（见下文）
。补充方法中提供了完整的详细信息。 　　如上所述解离肺部 ，并在冰上进行所有孵化步骤 。我们将107个细胞与FC块（Biolegend 422301）孵育
，并在FACS缓冲液（2 mM EDTA和0.2％的胎牛血清1×PBS，pH 7.4）中稀释它们1：100 ，持续10分钟
。然后将细胞与FACS缓冲液中的1μgml-1的APC偶联抗CD45抗体混合30分钟
，洗涤，并根据制造商的协议（Miltenyi：Antii-Human Interman fibrobleblast 130-050-550-601 ，Anti-cdipi-cd351
，antim Miltenyi）进行两轮耗竭。130-090-855，LS列130-042-401） 。然后将未标记的细胞在300G下离心 ，并用1μgml-1的PERCP-CY5.5抗EPCAM抗体和僵尸含水型生存能力染色（Biolegend 423101）标记为1：400的Face Buffer in Face BufferS中的浓度为1：400
。 　　为了进行冷冻保存和恢复，ECM液滴通过在三卷PBS中用5 mM EDTA的PBS解离
，然后在冰上孵育1小时。将细胞以300克颗粒5分钟，然后重悬于冷冻培养基（胎牛血清（Gibco） ，10％V/V DMSO）中
，放入Cryovials中，然后放入Frosty先生（Thermo Fisher）容器中 ，并存储在–80°C过夜
，然后夜间转移到液态氮气中的长期存储 。通过在37°C的水浴中快速融化，然后在类器官培养基中洗涤 ，并用类器官培养基加10μm岩石抑制剂Y-27632（Tocris）在ECM中恢复了器官
。 　　分离远端气道细胞并如上所述
，以下例外：在肺组织的弹性酶消化过程中，使用晚期DMEM/F12代替器官培养基 ，然后将细胞连续稀释并通过40μm细胞滤网过滤并用血细胞计数计数。每5μlmatrigel液滴每孔将每μLECM的每千个生存的上皮细胞（通过锥形蓝色排除
，尺寸和形态）被铺板 。碱培养基由缺乏A83-01，EGF ，Noggin，WNT3A或RSPO1的器官培养基组成。EGF (final 50 ng ml−1, R&D), NOGGIN (final 100 ng ml−1, R&D), WNT3A (final 100 ng ml−1, R&D), RSPO1 (final 500 ng ml−1, Peprotech) or the PORCUPINE inhibitor C59 (final 1 μM, Biogems) were added singly or in combination to base medium.在原发板上用倒光显微镜以5倍放大倍数获得图像
。将每个条件铺板四倍体
，并使用ImageJ中的分析粒子（阈值，4902像素）插件来定量器官形成（请参阅补充方法）。 　　根据制造商的规程 ，一级板后4周分离了来自单独个体的肺器官培养物
，并用10倍基因组学单细胞3'平台与5-核苷酸UMI进行基于液滴的SCRNA-SEQ 。如先前所述37进行细胞捕获，库制备和测序
。对于图1K中的SCRNA-SEQ分析 ，进行了修改的Kruskal – Wallis秩和测试
，以确定差异标记基因表达对AT2（SFTPC），基础（KRT5）和Club（SCGB1A1）细胞的显着性 ，所有P <0.001均为<0.001。主成分分析
，T-SNE，无监督的基于图的聚类 ，统计测试和所有SCRNA-SEQ分析的伪轨迹轨迹在补充方法和补充数据中描述 。 　　从未分流的类器官中纯化的lyotracker+ AT2细胞38纯化
，并用一段经过培养两个月
。根据制造商的协议，将它们解离并与10倍基因组铬单细胞3'平台V2进行基于液滴的SCRNA-SEQ。使用成对末端测序（26 bp读取1和98 bp读取2）对库进行测序 ，并在Illumina NextSeq 500上使用单个样品指数（8 bp）进行测序 。数据预处理和主组件分析是使用CellRanger V1.2进行的
。随后的分析在补充方法和补充数据1中描述。 　　在0.1 M cacodylate缓冲液（pH 7.4）中，在ECM中固定器官培养物
，将2.5％的戊二醛固定在ECM中，脱水 ，嵌入环氧树脂中
，并用JEOL（JEEM1400）透射电子显微镜与LAB6 Emitter（120 kV）可视化 。 　　如前所述37，用2％多聚甲醛在4°C下用2％多聚甲醛固定器官（10-20μm）
。将切片脱蜡并用H＆E染色 ，以进行组织学分析。在标准染色方案之后用于免疫细胞化学染色的抗体39中列出了补充方法
，并在Leica-SP8共聚焦显微镜上获取图像 。 　　如所述40进行了原位杂交，并在补充方法中提供了探针序列。 　　Intact, uninfected organoids were fixed in 2% paraformaldehyde in 100 mM phosphate buffer (pH 7.4) (4% paraformaldehyde for infected organoids) for 1 h at room temperature, washed with PBS with 100 mM glycine, permeabilized in 0.5% Triton X-100 in PBS for 1 h, then incubated in staining buffer (4% BSA, 0.05%Tween-20在PBS pH 7.4 ，10％山羊/驴血清中）额外持续一个小时
，然后在室温下在染色缓冲液中与一抗24小时孵育24小时
。然后将整个坐骑用PBS-T洗涤，并用荧光二抗伪胶体和DAPI在室温下在染色缓冲液中孵育4小时。额外洗涤后 ，将整个安装层浸入安装介质（Vectashield
，矢量实验室）中，并安装在腔室盖上 ，用于使用Zeiss LSM 700或900个共聚焦显微镜在四个通道中成像 。使用Volocity图像分析软件（Quorum Technologies Inc.，Guelph
，Antario）进行共聚焦图像堆栈的3D渲染
。对于需要五种颜色的图4H，用两种荧光二抗染色来区分纤毛 ，并使用Volocity软件将共定位的体素融合到伪结所通道中。Lectin staining (FITC-Sambuca Nigrin, Vector Labs FL-1301; Biotin-Maackia Amurensis, Vector Labs FL-1301) was carried out according to the manufacturer’s protocol after fixation of organoids with 0.1% paraformaldehyde in PBS for 1 h at room temperature followed by blocking with avidin/biotin (Vector Labs SP-2001).生物素麦芽菌蛋白凝集素用链霉亲和蛋白pe结合物（Thermo Fisher SA10041）标记
，并在钥匙BZ-X700中对洗涤凝集素染色后进行成像 。 　　使用商业靶向重新定价测定法对十种类器官进行了测序，该测定法具有131个癌症基因和伴随软件（Toma Compass肿瘤突变分析系统 ，加利福尼亚州福斯特市）的端到端覆盖范围
，以确定长期类器官培养物中的致癌突变的存在
。在Illumina NextSeq 500上对库进行了测序。补充表6中列出了非同义变体 。在补充数据2中提供了变体调用文件
。 　　在初级板条后2-3周内的器官培养物与1 U ML -1中性蛋白酶（Worthington，Cat LS02100）和100 ku DNase I在肺部器官培养基中分离。然后通过重力沉积收集基底器官 ，然后将上清液吸出或收集以供下游使用 。然后将基底器官进一步分馏
，在定制的Ficoll-Paque梯度（4 vol ficoll-Paque至1 vol PBS）上，并在室温下以300克离心10分钟
。将上清液吸出 ，并将器官颗粒重悬于10 mL PBS中
，在15 mL圆锥管中，通过重力沉积收集 ，并如上所述将其镀入ECM。 　　用Tryple解散器官，然后用10％体积的胎儿小腿血清中和
，在100 kU ml-1处进行DNase，用肺类器官培养基洗涤 ，然后用10 nm Lysotracker Red DND-99（热fisher L7528）的100 nm lysotracker lysotracker lysotracker rysotracker rysotracker介质孵育 。然后如上所述将细胞洗涤并重悬于FACS缓冲液中
，与FC块孵育，然后在冰上与标记鸡尾酒在冰上孵育 ，由PERCP-CY5.5抗EPCAM抗体和僵尸的Aqua Aqua Aqua活性染色（Biolegend 423101）（Biolegend 423101）稀释的Face Fusencation in Face Fusencation in face socksions in face inface incemation incemation in face infos inface insoction percipy percpp-cy5.5.5抗EPCAM抗体和Zombie Aqua Aqua Aqua抗体。将Epcamhi和Lysotrackerhi细胞分类为具有10μMY-27632（Tocris 1254）的肺类器官培养基
，并在ECM和肺运节培养基中培养24小时，然后在没有Y-27632的肺部类器官培养基中培养24小时
。通过添加1：1 Vol：Vol含量的L细胞条件培养基（L-WRN CM） ，纯AT2器官的生长得到了增强
，该培养基（L-WRN CM）含有Wnt3a，R-Spondin3和Noggin ，并补充了重组EGF41。补充图1中提供了完整的门控策略 。所有FACS抗体均购自Biolegend
。抗HTII-280（AT2 Marker
，Terrace Biotech）FACS纯化代替Lysotracker也可以获得定性相同的结果。通过Tryple从ECM解离并播种到室内玻璃盖玻片上，然后用晚期DMEM/F12和5％胎牛血清42培养 ，将AT2器官细胞转化为AT1细胞 。 　　如先前所述43，慢病毒在D14处的FACS EPCAM+ D14处的基质器官感染的MOI估计为0.9
，其第三代慢病毒载体（PGK-GFP T2A PURO，PGK-GFP T2A PURO ，SBI CAT
。P2A PURO CASSETTE
，Paul Rack的礼物）。感染96小时后，用呼霉素以600 ng ml-1的浓度处理48小时 ，以选择转导细胞 。选择后两周
，将表达GFP的类器官或表达麦克松的类器官分离为单个细胞，并以1：1的比例混合 ，并在每次通道的28天后作为单色或混合评分
。从初始FACS纯化的EPCAM+
，缺乏基质的类器官启动器培养物的隔离策略后，采用了相同的方法来用于纯化的AT2和基础培养物。 　　采购成年人类肺组织并如上所述分离 ，但用僵尸Aqua Live标记细胞如上所述
，用FACS缓冲液洗涤，然后在4°C中固定在PBS中的2％PFA中 。然后 ，随着PBS-甘氨酸洗涤的省略，使用上述整体过程对细胞进行染色
。然后将固定和透化细胞与1：400 Alexa Fluor 647偶联小鼠抗人细胞角蛋白5抗体（ABCAM）在4°C下在透明缓冲液中的1：400稀释。然后用FACS缓冲液洗涤细胞
，并用PE共轭小鼠抗人TNFRSF12A抗体（克隆Item-4，Biolegend）在冰上进行30分钟 ，然后在BD ARIA融合仪器上进行洗涤和分析 。补充图1中详细介绍了项目4抗体的完整门控策略和QPCR验证。 　　在大约4周培养的新鲜人类远端肺或原发性器官培养物中的单细胞悬浮液如上分离
，用FC块（Biolegend）处理，并在FACS缓冲液中与僵尸Aqua 1：400 ，1μgml-1 percp-1 percp-cy5.5（CD49F）
，2μgml-1 FITC抗人ITGB4（CD104）和1μgml-1 PE抗人类TNFRSF12A（CD266）
。标记后30分钟，将细胞用FACS缓冲液洗涤两次 ，并为Epcamhi
，Itga6/itgb4hi，TNFRSF12AHI和TNFRSF12ANES进行排序。在补充图1中提供了完整的门控策略 。将5,000多个细胞用肺类器官培养基和10μM岩石抑制剂Y-27632分类为Eppendorf管
。所有FACS抗体均购自Biolegend。 　　将细胞播种在ECM中 ，并用10μM岩石抑制剂Y-27632浸没在肺器官培养基中 。从器官培养物中溶解的细胞的播种密度为每孔1,000个细胞
，每μLECM的密度为100个细胞
。从新鲜人类远端肺中溶解的细胞的播种密度为每孔3,000个细胞，每μLECM的密度为300个细胞。24小时后 ，更改培养基以去除岩石抑制剂，此后每72小时更换一次 。两名独立观察者在电镀后14天对器官形成进行了量化
。 　　在2-3周时
，在2-3周中含有AT2，基底和俱乐部细胞类型的未分流培养物用H1N1菌株PR8感染 ，在用抗病毒化合物预处理24小时后
，用H1N1菌株PR8修饰，以表达病毒复制44。ECM通过在PBS中添加5 mM EDTA分散 ，然后用PR8-H1N1-GFP报告病毒洗涤和接种
，估计为1个含有媒介物或抗病毒药的培养基的MOI为1 。12小时（一个流感感染周期）后，完整的类器官GFP表达通过荧光显微镜使用钥匙BZ-X700自动显微镜观察 ，或者与单个细胞分离
，并在PBS中用0.1％PFA固定，然后用FACS定量GFP+细胞固定（补充策略中提供了GFP+细胞
。使用GraphPad Prism 7（GraphPad Software ，San Diego
，CA）使用四参数非线性回归曲线拟合生成抗病毒剂量反应曲线。以类似的方式评估了H1N1的向流，但除非将ficoll分解的基础细胞馏分与非基质裂缝分离为单个细胞 ，并在37°C下以1 h的估计MOI进行1 h估计的MOI感染1 h，然后在37°C下进行1 h
，然后将ECM洗涤并播放到16 h，然后将其培养为16 h ，然后将其培养为16 h
，然后逐渐被培养为且构成和对象 。 　　如用修饰所述的28，将嵌入50μLECM液滴中的肺类器官转移到悬浮培养物中。简而言之 ，通过使用无菌小叶尖端（Eppendorf 22493008）移位
，将ECM包裹的类器官轻轻移开，并放置在15 mL Lobind锥形管中（Eppendorf 301222216） ，其中含有PBS中5 mm EDTA
。每次ECM液滴（每15毫升锥形管3 ECM液滴）在4°C下在旋转平台上旋转1小时
，使用了EDTA溶液的五毫升溶液。在4°C下以200克离心3分钟，然后去除上清液 。将沉淀重悬于超低附着的六孔组织培养板中的生长培养基（Corning Costar 3471）
。将悬浮的类器官与5％CO2在不同时间（范围0–30天）在37°C下孵育 ，以表征根尖的极性
，纤毛生成和分化，并为SARS-COV-2的感染实验制备顶尖的器官。 　　VEOE6细胞是从ATCC获得的 ，作为无支原体库存，并在补充DMEM中维持10％FBS 。SARS-COV-2（USA-WA1/2020）在具有2％FBS的DMEM的VEOE6细胞中传递
。使用Avicel（FMC生物聚合物）和Crystal Violet（Sigma）在VEROE6细胞上通过斑块测定法测定滴度
，对病毒基因组序列进行了验证，并用Passage 3病毒对所有感染进行了验证。将类器官计数并将其转移到悬浮培养基中6-8天 ，然后在样品中相对于1个MOI的MOI
，在病毒培养基中重悬于病毒培养基中，或者在样品中总体器官细胞相同 ，然后在37°C下在5％CO2下在5％CO2下孵育2小时 。然后将类器官铺在肺器官培养基中（顶室类带）中的悬浮液中
。在指定的时间点
，用肺器官培养基和PBS洗涤根尖的类器官，并重悬于Trizol LS（Thermo Fisher） ，PBS中新鲜制作的4％PFA
，或250μl肺器官培养基中。通过在-80°C下的冷冻裂解在肺类器官培养基中重悬的细胞 。培养上清液保存在Trizol ls中或直接添加到斑块测定单层中
。所有SARS-COV-2工作均在斯坦福大学的BSL3条件下在II级生物安全机柜中进行。 　　通过添加750μlTrizol（Thermo Fisher Scientific）提取SARS-COV-2感染的类器官的RNA，在55°C下孵育5分钟 ，然后添加150μl氯仿 。通过涡旋将每个样品混合7 s后
，将样品在25°C下孵育5分钟，然后在4°C下以12,000 rpm离心15分钟。根据制造商的说明 ，将水层小心从每个样品中仔细去除，并与两个体积的100％乙醇混合
，并使用RNA Clean＆Comentator-25 Kit（Zymo Research）纯化
。所有RNA样品均用DNase（无涡轮DNA试剂盒，Thermo Fisher Scientific）处理。Brillian II SYBR绿色QRT-PCR 1步主混合（VWR）用于将RNA转换为cDNA ，并在CFX96触摸实时PCR检测系统（BIO-RAD）上扩增特定的RNA区域 。在50°C下进行逆转录反应30分钟
，在95°C下进行10分钟，然后用95°C的两步qPCR进行10 s ，55°C 30 s
，总共40个周期
。两个底漆集用于放大跨越核苷酸位置14221–14306或剪接的SARS-COV-2 SGRNA30的未切割的SARS-COV-2基因组RNA（GRNA）。底漆序列在补充表7中 。 　　从PBS中4％多聚甲醛的原发性手术切除术的30分钟内，在30分钟内固定的标本中 ，从固定的标本中实现了人类远端肺组织的最佳染色
。将样品在4°C的固定剂中孵育
，转移至30％蔗糖，并嵌入到OCT中。将冷冻切片切成10μm ，在70°C下进行基于柠檬酸盐的抗原检索（矢量实验室）30分钟
，然后用如上所述在洗涤缓冲液中用10％山羊血清阻塞1小时 。图3A和多克隆兔抗TNFRSF12A（Thermofisher PA5-20275）使用小鼠抗TNFRSF12A（克隆Item-4，Biolegend）用于图3B ，F和扩展数据图845
。 　　在观察室的两个盖玻片（Lab-Tek II两室床罩）中，将活细胞固定在两个盖玻片之间
，并使用尼康TE2000E显微镜使用差分干扰对比度（DIC）显微镜拍摄，并具有63倍物镜。在成像过程中 ，样品将样品与5％CO2保持在37°C 。数字视频是由Hamamatsu高分辨率ORCA-285数码相机收集的
，并使用OpenLAB 5.5.2软件（Improvision）渲染
。记录后，将样品固定并染色 ，而无需从腔室中移除
，然后转移到共聚焦显微镜中以进行免疫荧光显微镜。 　　除非另有说明，否则所有数据都代表了至少两个独立的实验 ，每个独立实验都使用从一个个体中得出的类器官进行 。框图范围首先跨越第三四分位数
，水平线表示中位数，晶须代表数据范围最小或最大值 ，或者在离群值的情况下
，是四分位间范围的1.5倍，与以数据点表示的异常值相群。t检验是两尾 ，p值表示为 *p <0.05，**p≤0.01和***p≤0.001
。完整的详细信息在补充方法中提供。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得 。