为了使目标整合质粒PCRISPR ，将CRISPR阵列的领导者和前三重复和间隔序列为两个DNA片段 ，由PCR放大并由Gibson Assembly插入PUC19骨架中 。在这项研究中使用的DNA寡聚是从集成的DNA技术中排序的 。通过在95°C加热5分钟，并在HEPES杂交缓冲液（20 mM HEPES ，pH 7.5 ，25 mm KCl和10 mM MGCL2）中加热至室温，从而形成了预科和半位点底物。对于半个位点底物 ，杂交以1.5倍的超过两条最短链和第二大股线超过1.25倍 ，并在8％的天然页面凝胶上纯化 。克隆引物和DNA底物的序列显示在补充表2中 。
将Megasphaera NM10相关的Cas1和Cas2-DEDDH基因用于大肠杆菌表达，以G-blocks命令 ，将PCR扩增并分别克隆到具有N-N-末端10×His-MBP TEV标签的基于PET的表达矢量中。转化为化学能力的罗塞塔细胞后 ，将细胞在600 nm约0.6左右生长至光密度，并在16°C下用0.5 mM Isropopyl-β-硫代乙乳糖苷剂在16°C诱导过夜 。收集细胞并将其恢复在裂解缓冲液中（20 mM HEPES，pH 7.5 ，500 mm NaCl ，10 mM咪唑，0.1％Triton X-100 ，1 mm Tris（2-羧乙基）磷酸（TCEP）（TCEP） ，无EDTA无EDTA蛋白酶抑制剂（ROCHE），0.5 mM pMM苯基苯基苯基苯基苯基苯基苯基苯基苯基苯基苯基苯基苯基苯基苯基苯基苯基苯基苯基苯基苯基苯基苯基苯基苯基苯基苯基苯基苯基苯基苯甲酸含量 。甘油）。通过超声处理和通过离心溶解裂解物裂解后 ，将上清液与Ni-NTA树脂（Qiagen）一起孵育 。将树脂用洗涤缓冲液（20 mM HEPES ，pH 7.5 、500 mM NaCl，10 mM咪唑 ，1毫米TCEP和5％甘油）洗涤 ，并用补充300 mm咪唑的洗涤缓冲液洗脱蛋白质 。After overnight digestion with TEV protease, the salt concentration was diluted to 300 mM NaCl using ion-exchange buffer A (20 mM HEPES, pH 7.5, 1 mM TCEP and 5% glycerol) and run through a tandem MBPTrap column (GE Healthcare) and HiTrap heparin HP column (GE Healthcare) to remove the MBP and bind the protein onto the heparin column.将蛋白质用从300 mm到1 m kCl的梯度洗脱，浓缩并纯化在SuperDex 200（16/60）色谱柱上 ，带有存储缓冲液（20 mM HEPES ，pH 7.5，500 mm KCl，1 mM TCEP和5％的甘油）。CAS1和CAS2/DEDDH（WT和D132A突变体）使用了相同的纯化方案。补充表1中提供了蛋白质的序列 。
在整合缓冲液（20 mM HEPES ，pH 7.5 、125 mm KCl ，10 mM MGCL2、1 mM DTT，0.01％非IDET P-40和10％DMSO）中进行了处理测定 。在添加荧光DNA底物（312.5 nm）之前 ，将CAS1（4μM）和CAS2/DEDDH（2μM）预妥协30分钟 ，并在37°C下反应2 h。通过添加2次淬火缓冲液（95％甲酰胺，30 mM EDTA ，0.2％SDS和400μgml -1肝素）和在95°C加热4分钟 ，从而淬灭反应，然后对14％尿素 - PAP凝胶进行分析 。使用台风FLA凝胶成像扫描仪可视化反应 ，并使用ImageQuantTL（V.8.2）对强度进行定量 。将百分比处理活性量化为最终产物带强度与车道所有带的总强度的比率。
CAS1 – CAS2/DEDDH DNA复合物是通过混合50 µM Cas1 ，50 µm Cas2/deDDH和12.5 µM的预佩克或半位点DNA形成的，并在房间温度下使用幻灯片 - 莱泽Mini Dialysis设备透析2 h 。将复合物浓缩到不同浓度的CAS1 – CAS2/DEDDH（扩展数据表1） ，并在Superose 6增加10/300 GL柱上纯化 。使用FEI Vitrobot Mark IV冷冻样品 ，在100％湿度下冷却至8°C。根据样品（补充表1），要么碳2/2 300网格C-Flat网格（电子显微镜科学CF-223C-50）或1.2/1.3 300网格超级固定金网格（电子显微镜科学，Q350AR13A ，Q350AR13A）在15 ma上散发出25 ma for 25 s MA的闪闪发光 。在所有情况下 ，将总体积的4μl样品施加到网格上，并立即用8个单位的印迹力将5 s印迹 。在K3 Direct Electron检测器的超分辨率设置中 ，在以200 kV和×36,000放大倍率（1.115Å像素尺寸）上运行的Talos Arctica上收集了显微照片。使用Serialem（V.3.8.7）收集冷冻EM数据 。图像是在显微镜阶段和梁移位产生的一系列暴露中获得的 。
所有数据集都以不同的倾斜角度 ，视频数量和散焦范围（补充表1和扩展数据图3-5）收集。数据处理是在CryoSparc（v.3.2.0，v.3.3.1和v.4.1.1）中进行的44。使用斑块运动校正校正视频 ，以校正梁诱导的运动 ，并使用贴片CTF计算对比度传递函数参数 。
通过迭代过程获得了缺乏PAM缺陷的预漏程序CAS1 – CAS1 – CAS2/DEDDH地图 。在第一轮中，从37个显微照片手动挑选了569个颗粒 ，并提交了Topaz Traine45。所得的黄玉模型用于从显微照片中摘取颗粒 ，并以2个bin系数提取了总共460,631个颗粒，并应用于2D分类 。选择最佳类别后 ，将410,757个颗粒用于从头开始重建和随后的异质细化 ，并提供三个类别 。所有颗粒均用于非均匀的地图细化46，并获得了初始的复杂图。从最初的非均匀细化模型中对颗粒进行了2D分类后，选择了各个等同于各个类别的粒子 ，并在第二轮训练中选择了各向同性方向的颗粒并处理 。总共使用了956个策划的显微照片 ，使用了新的TOPAZ模型，整个过程与最佳异质细化类别的颗粒重复两次 ，以进行随后的不均匀细化和Topaz训练 。从461,266个颗粒中获得了具有PAM缺陷前的PRESPACER BODPACER结合的CAS1 – CAS2/DEDDH复合物的最佳电子密度的最终图 ，并以不均匀的细化为3.1Å。
对于含PAM的PESPACER-CAS1 – CAS2/DEDDH，进行了一轮Topaz训练 。在最初的暴露策展（产生591个最佳显微照片）之后 ，手动采摘并处理了6,302个颗粒以进行Topaz培训工作 。将黄玉模型应用于扩展的1,184个策展显微照片 ，并导致提取3,101,776个颗粒。从头开始重建和异质细化后，构成了最佳类别的1,420,721个粒子套件 ，以不均匀的细化进行处理 。结果 ，获得了2.9Å的含PAM含PAM的PRESPACER结合CAS1-CAS2复合物的密度 。
为了解决后一个数据集中的DEDDH密度，将用于后者密度重建的AB INTIO类粒子总共应用于2D分类作业 ，并将228,220个粒子用于具有明显DEDDH密度的类别。从三个类别进行了从头进行完善之后 ，对最佳类别的粒子进行了另一轮2D分类的处理，并选择了109,912个颗粒，具有更明显的DEDDH密度 ，并使用320个像素盒大小进行重新提取（在所有其他情况下 ，将480个像素盒用于提取工作）。由于最终的2D分类回合，选择了最佳DEDDH密度的49,560个颗粒 ，并重新提取标准盒尺寸 ，并从头开始进行处理，并具有一个类和不均匀的细化 。结果 ，获得了带有DEDDH核酸外切酶密度的3.5Å复合图 ，总共使用49,383个颗粒进行重建 。
对于一个半站点结合的DNA CAS1 – CAS2/deDDH，将含PAM的预留剂的TOPAZ模型应用于手动策划后选择的2,810个显微照片。使用2D分类对2,448,888个结果颗粒进行了细分 ，并选择了25种最佳类别 ，从而产生1,836,610个颗粒 。这些粒子是通过三个类别进行从头开始重建的 。使用不均匀的细化来完善包含1,048,353个颗粒的最佳类，以产生3.1Å的半位地图。
为了观察CAS1 – CAS2/DEDDH半集体络合物中的DNA动力学 ，我们在选定的粒子子集中进行了3DVA36 ，并从2D分类中进行了改进，并在该复合物的Leading-distal侧可见（1,048,353粒子） 。滤波器分辨率为6Å，模式的数量为3 。为了生成补充视频1 ，将3DVA输出模式设置为简单和20帧 ，然后使用UCSF Chimerax生成VSeries。接下来，将3DVA输出模式设置为群集 ，并将簇的数量设置为20 。每个结果群集都单独检查 ，并且选择了两个代表沿螺距轴的DNA运动最大值的簇 。线性结构源自32,722个颗粒，并处理以进行不均匀的细化 ，以获得最终的4.1Å映射。通过重复3DVA工作流的重复 ，通过Topaz拾取获得的完整粒子集，然后选择和代表最弯曲的领域DNA的群集的完整粒子集 ，从最初的粒子设置进行了重复 ，从而改善了最初3DVA聚类产生的弯曲结构，从而获得了最终的3.9Å9 。
使用Alphafold 2程序47获得CAS1和CAS2/DEDDH的初始模型 。为了构建与TT PAM复合物结合的CAS1 – CAS2/DEDDH的模型 ，预测的Cas1和Cas2单体被独立停靠在UCSF Chimerax（V.1.2.5）48的FitMap工具中。DNA模型是从头制造的。使用COOT（V.0.9.4.1）49（V.0.9.4.1）的真实空间改进和刚性身体拟合工具的回合和Real_space_refine工具（V.1.19.2-4158）50中的Real_Space_Refine工具 ，使用二级结构，Ramachandran和Rotamer约束 。这个复杂的模型是其他Cas1 -Cas2结构的初始模型，这些模型以类似的方式进行了改进 。
在整合缓冲液（20 mM HEPES ，pH 7.5 、125 mm KCl ，10 mM MGCL2 、1 mM DTT，0.01％非IDET P-40和10％DMSO）中进行了连接测定。在添加DNA底物（312.5 nm）之前 ，将CAS1（4μM）和CAS2/DEDDH（2μM）预先复合30分钟 ，并在37°C下添加DNA底物（312.5 nm），并积分靶PCRISPR（20 ng ml-1 ，〜10 nm） ，并在37°C下反应2 h 。用0.4％SD和25 mM EDTA淬灭反应，在室温下用蛋白酶K处理15分钟 ，然后用3.4％SDS处理 。在1.5％琼脂糖凝胶上分析了反应 ，并使用台风FLA凝胶成像扫描仪可视化。
在整合缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.5 ，125 mm KCl ，10 mM MGCL2，1 mM DTT，0.01％非IDET P-40和10％DMSO）中进行了整合测定（50μl反应） 。在添加含有BSAI切割位点（312.5 nm）的DNA底物之前 ，将CAS1（4μM）和CAS2/DEDDH（2μM）预先复杂30分钟 ，然后进行15分钟反应，然后进行15分钟 ，然后添加整合靶PCRISPR（20 ng ml-1 ，〜10 nm），〜10 nm）和2 h in in 2 h in in 37°°°°c in c. in 37°°°°°°°°°°°°c c. c. in cy°°c 。使用DNA清洁和浓缩物5试剂盒（Zymo Research）纯化产物 ，并用6μl水洗脱。如先前所述37：6μl纯化的采集反应 ，6.5μl水，2μl10×Taq DNA-Ligase缓冲液（NEB） ，NEB） ，2μLDNTP溶液混合物（2μLDNTP溶液混合物（10 mm coppect）（80 mm），NEB ，NEB ，NEB，NEB，NEB ，2μl（2-ug） ，用纯化的整合产物（2μl10μl）（neb），Neb ，2-lig lig lig lig lig lig lig lig ta ，1μLT4DNA聚合酶（1 U，NEB） 。使用Zymo研究试剂盒纯化间隙填充反应 ，并用6μl水洗脱 。PCR与编码BSAI切割位点的底漆生成了与黄金胶质兼容的氯霉素选择盒 ，并使用Qiagen Minelute PCR纯化试剂盒进行纯化。补充表2中显示了所使用的引物序列 。根据标准的BSAI组装协议，使用纯化的 ，充满缝隙的集成产物和氯霉素选择盒进行了金门克隆反应 。使用Zymo研究试剂盒纯化产物 ，并用6μL水洗脱，将1μL电穿孔到DH10B细胞（NEB）中。将电穿孔的细胞回收在975μllb中 ，并在含有碳二甲霉素（100μgml -1）和氯霉素（25μgml -1）的LB琼脂上镀载。在幸存的菌落中 ，使用Sanger测序对95进行测序，并使用Snapgene（V.5.0.8）分析了序列 。
通过确定包含CRISPR基因座的基因组使用CRISPRDECT，并提取了阵列5 kb以内的编码序列51 ，可以鉴定出来自元基因组数据的CAS2-DEDDH基因座 。通过针对手动验证的NCBI NR数据库的爆炸搜索构建了DEDDH HMM模型。52 。使用E <1×10-5（参考文献52）使用HMMSEarch搜索编码序列 。这项工作也入围了对CAS1和附近的其他CAS蛋白的可靠命中的比赛。使用Alphafold 2计算了初步的CAS2/DEDDH模型 ，以帮助结构建筑47 。
对于生化实验，结果代表了最高质量的凝胶 。所有实验通常至少重复进行 ，尽管并非完全相同的格式。进行试验实验以确保可重复性 。测量取自不同的样品 。通过对95个菌落进行测序并计数生物学一式三份的整合事件来进行全部位集成测定。通过试验实验确保可重复性后 ，可以选择样本量 。所有数据点均显示在图面板上 。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。
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