所有细胞系均基于E. Heard实验室提供的E14 MES细胞
。Cells were cultured on gelatin-coated culture plates in Glasgow minimum essential medium (Sigma-Aldrich, G5154) supplemented with 15% fetal calf serum (Eurobio Abcys), 1% -glutamine (Thermo Fisher Scientific, 25030024), 1% sodium pyruvate MEM (Thermo Fisher Scientific, 11360039), 1% MEM non-essential氨基酸（Thermo Fisher Scientific
，11140035）在37°C下8％CO2，在8％CO2中 ，100 µMβ-甲醇
，20 U ML-1白血病抑制因子（Miltenyi Biotec，Premium等级）。每月一次对细胞进行支原体污染测试 ，未检测到污染 。在piggybac-enhancer换位后
，将细胞培养在补充2i（1 µM MEK抑制剂PDO35901（Axon，1408）和3 µM GSK3抑制剂CHIR 99021（Axon ，1386））的标准E14培养基中
。 　　敲击所需的同源臂
，SOX2启动子，SCR和SCR截短版本（EI）通过渗入与Gibson Assembly Cloning Cloning（Neb ，E2611）相吻合的Primers通过Primibils使用Primers兼容的引物
，从E14 MES细胞基因组DNA（Thermo Fisher Scientific，F549）放大了E14 MES细胞基因组DNA。靶向矢量是从Rob Mitra赠予的3-SB-EF1-PBBAR-SB SB质粒开始生成的 。为了克隆同源性臂进入载体 ，使用Q5定向诱变试剂盒（NEB，E0554）引入了BSPEI和BCLI限制位点
。通过使用gibson组装策略将左同源性臂克隆
，通过用BSPEI（NEB，R0540）线性化。使用吉布森组装策略将右同源臂通过用BCLI（NEB ，R0160）线性化来克隆 。首先使用NDEI（NEB
，R0111）和Sali（NEB，R0138）从3-SB-EF1-PBBAR-SB载体中删除EF1A启动子 ，然后使用Gibson组装策略来克隆SOX2启动子
。通过用Bamhi（NEB
，R3136）和NHEI（NEB，NEB ，r3131）线性化
，将SCR及其截短的版本（截短的SCR或EI）克隆在PiggyBac Transposon特异性倒末端重复序列（ITR）之间。使用Gibson装配策略，在增强子的5'和3'末端插入了人α2球蛋白基因和SV40 poly（a）序列的转录暂停序列 。由PGK启动子驱动并侧翼由FRT位点驱动的携带嘌呤霉素耐药基因的选择盒 ，通过用ASISI（NEB
，R0630）限制性酶进行线性化，将Sox2启动子的前面克隆在Sox2启动子的前面
。补充表1中提供了用于克隆的引物的列表。 　　使用在线工具（https://eu.idtnna.com/site/order/order/designtool/index/crispr_sequence）设计的Piggybac Transgene在15号染色体上敲入的GRNA序列是设计的 ，并从microsynth ag中购买 。使用BSAI限制位点将GRNA序列克隆到PX459质粒（addgene）中。使用Amaxa 4d-Nucleofector X-Unit和P3主要细胞4D-核对象X KIT（Lonza，v4xp-3024 kt）
，使用核对纤维转基因产生了携带Piggybac转基因的E14 MES细胞创建者
。用Accutase（Sigma-Aldrich，A6964）收集细胞（2×106） ，并恢复在100 µl转染溶液中（82 µl初级溶液
，18μl补充，1μg涂鸦靶向载体 ，将SCR携带
，单独转移到SCR或1 µg cas159 ch159 Ch159 Ch159 Ch159 Ch159 Ch159 Ch159 Ch159 Ch159（Lonza）。使用协议CG110进行核反理 。在E14标准培养基中，将转染的细胞直接在预热的37°C培养物中播种
。然后 ，转染后24小时
，将1 µg mL-1的嘌呤霉素（Invivogen，ant-pr-1）添加到培养基中3天 ，以选择用PX459 GRNA/CAS9载体转染的细胞。然后将细胞在标准的E14培养基中培养4天 。为了选择插入Piggybac靶向载体的细胞
，通过在补充1 µg ml -1的嘌呤霉素的标准培养基中培养细胞来进行第二脉冲尿霉素
。选择3天后，通过在96孔板上通过荧光激活的细胞分选（FACS）分离单个细胞。在补充的标准E14培养基中保存2天 ，并补充有100μgμl-1 primocin（Invivogen，ant-PM-1）和10 µM岩石抑制剂（Stemcell Technologies
，Y-27632） 。然后将细胞培养在标准E14培养基中，紫霉素1 µg mL -1
。通过用裂解缓冲液（100 mM Tris-HCl pH 8.0 ，5 mM EDTA
，0.2％SDS，50 mM NaCl ，NaCl
，蛋白酶K和RNase）裂解细胞提取基因组DNA。 并随后的异丙醇沉淀 。通过基因分型PCR分析单个细胞系，以确定Piggybac供体载体的杂合插入
。选择并扩展了显示校正基因分型模式的细胞系。补充表1中提供了用于基因分型的引物的列表 。 　　根据制造商的指示 ，使用Lipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific
，l3000008），用2 µg的PCAG-FLPO-P2A-P2A-HYGROR质粒（FLP）重点酶编码用于Flippase（FLP）重点酶。将转染的细胞在标准E14培养基中培养7天
。然后使用96孔板上的FACS分离单细胞。通过用裂解缓冲液（100 mM Tris-HCl pH 8.0、5 mM EDTA ，0.2％SDS
，50 mM NaCl，蛋白酶K和RNase）和随后的异丙醇沉淀提取基因组DNA 。通过基因分型PCR分析单个细胞系 ，以验证尿霉素耐药盒的缺失
。补充表1中提供了用于基因分型的引物的列表。选择并扩展了显示正确的基因分型模式的细胞系 。使用CAS9引导的适配器连接（NCATS）51处理选定的细胞系进行靶向的纳米孔测序，并且只有显示出piggybac供体载体的独特整合的细胞线被用作增强子动员实验的创始人线
。 　　Piggybac转座酶（PBASE）的小鼠密码子优化版本用红色荧光蛋白Tagrfpt（EVROGON）克隆到PBROAD3矢量（PBROD3_HYPBASE_IRES_TAGRFPT）中
，使用Gibson Assembly Cloning（NEB，E2611）。根据制造商的说明 ，使用Lipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific
，L3000008），用0.5 µg PBROD3_HYPBASE_IRES_TAGRFPT转染细胞（2×105） 。为了增加增强子换位的概率 ，在24孔板中同时同时进行了12个独立的PBase转染
。通过流式细胞仪分析监测细胞群中Hypbase_ires_tagrfpt转座酶的转染效率以及表达水平。然后
，在用PBASE转染7天后，使用96孔板中的FACS分离单个EGFP+细胞系 。在补充的标准E14培养基中保存2天的细胞 ，并补充有100μgml-1 primocin（Invivogen
，ANT-PM-1）和10 µM岩石抑制剂（Stemcell Technologies，Y-27632）
。将细胞在E14标准培养基中培养7天 ，并三式三份用于基因组DNA提取
，流式细胞仪分析和冷冻。 　　使用Sprinkerette PCR对单个细胞系中增强子插入位点的映射进行了映射 。如前所述进行了该协议，并进行了少量修改。根据制造商的说明 ，使用Quick-DNA通用96试剂盒（Zymo Research，d4071）从96孔板中提取来自单个EGFP+细胞系的基因组DNA
。通过0.5 µL的BSP143I限制酶（Thermo Fisher Scientific
，FD0784）在37°C下消化纯化的基因组DNA 15分钟，然后在65°C下进行20分钟。首先将长（HMSPAA）和短（HMSPBB）Splinkerette适配器重悬于5×Nubuffer 2（NEB ，B7002）以达到50 µm的浓度 。然后
，将50 µL的HMSPA适配器与50 µL HMSPBB适配器（AA+BB）混合，达到25 µm的浓度
。将适配器混合物变性并通过将其加热到95°C的方式将其退火5分钟 ，然后冷却至室温。然后
，使用5 U的T4 DNA连接酶（Thermo Fisher Scientific，EL0011）将25个PMOL退火的夹层适配器连接到消化的基因组DNA ，并在22°C下孵育1小时
，然后在65°C下进行热灭活步骤10分钟 。For splinkerette amplifications, PCR 1 was performed combining 2 µl of the splinkerette sample, 1 U of Platinum Taq polymerase (Thermo Fisher Scientific, 10966034), 0.1 µM of HMSp1 and 0.1 µM of PB5-1 (or PB3-1) primer, and splinkerette PCR 2 was performed using 2 µl of PCR 1, 1 U of PlatinumTAQ聚合酶（Thero Fisher Scientific，10966034） ，0.1 µM HMSP2和0.1 µM PB5-5（或PB3-2）底漆
。通过琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增的质量。使用PB5-2（或PB3-2）发送样品进行Sanger测序（Microsynth AG） 底漆 。在补充表1中提供了用于夹紧PCR和测序的引物的列表
。如“ PiggyBac-Enhancer插入位点在单个细胞系中的映射
”中所述进行的增强子插入位点的映射。 　　在流式细胞仪测量之前
，将EGFP+细胞系在血清+ 2i培养基中培养2周 。使用BD高吞吐量采样器（HTS），在BD LSRII SORP流式细胞仪上测量了单个细胞系的EGFP水平 ，这使得以96孔板格式获得了样品采集
。每个克隆重复三次测量。使用FlowJo计算每个克隆的平均EGFP荧光强度，并将所有三个重复平均 。 　　首先通过减去在同一96孔板中培养的野生型E14 MES细胞中测量的平均EGFP荧光强度来纠正在流式细胞仪中测得的每个细胞系的平均EGFP荧光水平。然后
，通过将其除以所有细胞系的平均平均强度，在启动子位置以40 kb窗口内的所有细胞系的平均平均强度进行归一化 ，并乘以公共因子
。 　　根据制造商的说明
，使用Lipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific，L3000008）将细胞（5×105）用2 µg PBASE转染。通过流式细胞仪分析监测细胞群中PBase的转染效率以及PBase的表达水平 。然后 ，在用PBASE转染5天后
，使用Dneasy血液和组织试剂盒纯化基因组DNA（Qiagen，69504）
。为了减少未发生Piggybac-inhancer切除的细胞的贡献 ，我们使用体外CAS9消化策略耗尽了EGFP序列。使用在线工具（https://eu.idtdna.com/site/order/order/designtool/index/crispr_sequence）设计了用于EGFP耗竭的GRNA序列（补充表1） 。定制设计的ALT-R CRISPR-CAS9 CRRNA包含针对EGFP的GRNA序列（GRNA_1_3PRIME和GRNA_2_3PRIME）
，ALT-R CRISPR-CAS9 TRACRRNA（IDT，1072532）和Alt-R-R链球菌Pyogenes Pyogenes pyogenes cas9 enzyme（IDT ，IDT
，1081060）
。Cas9对EGFP片段的体外切割是根据IDT方案“用核糖核蛋白复合物在靶DNA的体外切割”进行的。简而言之，通过在95°C的95°C加热5分钟并允许冷却至室温（15-25°C） ，从而组装了100μm的Alt-R CRISPR – CAS9 CRRNA和100​​μMALT-R CRISPR-CAS9 TRACRNNA 。为了组装RNP复合物，将10μm的Alt-R引导RNA（CRRNA：TRACRRNA）和10μMALT-R SPCAS9酶在室温下孵育45分钟
。为了在体外消化EGFP
，将300 ng的基因组DNA从用PBase转染的池细胞中提取，并用1μMCAS9/RNP孵育2小时。消化后 ，加入40 µg蛋白酶K
，并在56°C下进一步孵育10分钟，以从Cas9核酸内切酶释放DNA底物 。使用Ampure Beads XP（Beckman Coulter ，A63881）纯化后
，基因组DNA被0.5 µL BSP143I限制酶消化（Thermo Fisher Scientific，FD0784） 在37°C下进行15分钟 ，然后在65°C下进行热灭活步骤20分钟
。然后使用30 U的T4 DNA连接酶HC（Thermo Fisher Scientific
，EL0013）将退火的碎片衔接子（AA+BB; 125 pmol）连接到消化的基因组DNA，并在22°C下孵育1 h ，然后在65°C的热量启动下进行热量启动。为了进行间隙扩增
，进行了96个独立的PCR 1反应，结合了100 ng的Sppinkerette样品 ，1 U的铂Taq聚合酶（Thermo Fisher Scientific，10966034）
，0.1 µm HMSP1和0.1 µm HMSP1和0.1 µm的PB3-1 Primer和Splinkerette PCR 2 pr PRESS PRARCE，PCR 2 press PROTER ，PCR 2的PR PRESS PROTER PRARES PRARES PRARES PRARED U.聚合酶（Thermo Fisher Scientific
，10966034），0.1 µM HMSP2和0.1 µm的PB3-2引物 。补充表1中提供了用于Splinkerette PCRS的引物的列表。使用NEB Ultra II套件根据制造商的协议处理了Splinkerette Amplicon产品 ，使用50 ng的输入材料进行了处理
。如“基于人群的Splinkerette PCR中的piggybac-enhancer插入位点的映射 ”部分中所述进行了全基因组插入的映射。 　　使用基于参考文献的基于TN5-Transposon的ITR映射技术
，对细胞池中的PiggyBac整合进行了映射 。53较小的改变
。根据制造商在24孔板中的说明，使用Lipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific ，L3000008）将细胞（2×105）用0.5 µg PBase转染。并联进行八次独立的转染 。通过流式细胞仪分析监测细胞群中PBase的转染效率以及PBase的表达水平
。然后
，在用PBASE转染7天后，将6个细胞的6个细胞池中的低GFP值（门低1和低2和低2）和6个细胞池和337个高GFP值（GATE高）的3个细胞池分为24孔板。在补充的标准E14培养基中保存2天的细胞 ，并补充有100μgml-1 primocin（Invivogen
，ANT-PM-1）和10 µM岩石抑制剂（Stemcell Technologies，Y-27632） 。根据制造商的指示 ，使用Quick-DNA Miniprep Plus（Zymo Research，d4069）提取细胞在E14标准培养基中培养1个通道（从门低1和低2）或2个通道（来自Gate High的池）的标准培养基
，并根据制造商的指示提取细胞
。如参考文献中所述产生的TN5转座子。54 。标记反应如下进行
。引物TAC0101＆TAC0102（45μl的100μm）与10μl10μl10×Tris-EDTA（pH 8）混合，并通过加热至95°C退火 ，然后将慢速倾斜向下（0.1°C S-1）
，直到4°C。通过将衔接子（1：1：2的稀释适配器）和TN5转座子（1.5μl的2.7 mg Ml -1库存）组合在18.7μlTN5稀释缓冲液中（20 mM HEPES，500 mM Nacl ，25％甘氨酸）中
，可获得转染体获得 。通过将100 ng的基因组DNA与1 µL组装的转座体，4 µL 5×TAPS-PEG缓冲液（50 mM Taps-NaOH ，25 mM MGCL2
，8％（V/V）PEG8000混合，进行标记。 最终体积为20 µL
。将反应在55°C下孵育10分钟 ，然后用0.2％SDS淬火。为了获得最佳的映射结果
，对Piggybac转座子的两侧进行处理以获得5'ITR-和3'ITR特异性文库 。首先，我们通过3'ITR特异性（TAC0006）和5'ITR特异性（TAC0099）引物的线性扩增PCR丰富了目标区域
。PCR混合物为3 µl标记的DNA ，1 µL1μM富集引物，2 µL DNTP（10 mM）
，4 µL 5×5×Phusion HF缓冲液（NEB），0.25μlphusion phusion HS phusion HS flex聚合酶（2 U µL -1 ，NEB）
，在20 µL -lifified as a ins ass in 20 s cly ass in clandsssss in 20 s clys and ass ins insplified ass and ass ins clys as as clastive as as clastif。在98°C下为10 s的45个循环，在62°C下为20 s ，在72°C下为30 s；然后在72°C下20 s 。使用TAC0161（3'ITR）和TAC0110（5'ITR）与N5XX（Illumina
，Nextera Index套件）结合使用TAC0161（3'ITR）和TAC0110（5'ITR）进行PCR 1
。PCR混合物为5 µL富集PCR，1 µL10μM底漆 ，2 µL DNTP（10 mM）
，4 µL 5×PHUSH HF HF缓冲液和0.25 µL Phusion HS Flex聚合酶（NEB），最终体积为25 µL ，并以25 µL和25 µL的速度：30 S AT 98 s Ats AT 98°C；在98°C下为10 s的3个循环
，在62°C下为20 s，在72°C下为30 s；在98°C ，在72°C下为50 s的8个循环。在PCR 2中，将N7XX（Illumina
，Nextera索引套件）适配器添加到PiggyBac的特定位置 。使用TAC0103（ITRS）和N7xx进行PCR
。PCR混合物为2 µL PCR1，1 µL10μM底漆 ，2 µL DNTP（10 mM）
，4 µL 5×5×PHUSH HF HF缓冲液和0.25 µL Phusion聚合酶（Thermo Fisher Scientific），最终体积为22 µL ，并在98°C下的最终体积为22 µL
，并在98°C下进行扩增。在98°C下为10 s的10个循环，在63°C下为20 s ，在72°C下为30 s 。然后
，检查了1％琼脂糖凝胶的5 µL库，并根据涂片强度合并不同的样品
。最后 ，使用CleanPCR（CleanNA）珠子以1：0.8样本：珠子纯化珠子纯化库。最终库是使用Illumina Miseq（150 bp
，配对末端）测序的 系统 。如“通过标签
”部分进行的“ piggybac-enhancer插入位点的映射”部分所述进行了全基因组插入的映射。 　　使用在线工具（https://eu.idtdna.com/site/site/Order/designtool/designtool/index/crispr_squerence）设计了含有CTCF结合位点的基因组区域耗竭的GRNA序列，并从microsynth ag（补充表1）购买
。使用BSAI限制位点将GRNA序列克隆到PX459质粒（addgene）中。为了删除第一个正向CTCF结合位点（染色体15：11520474–11520491） ，用0.5 µg的PX459 CTCF_KO_GRNA3/Cas9和1 µg PX459 CTCF_KO_GRNA10/Cas9 plipiicuscect lofificixsimidsimidsimidsimidsimidsimidsimidsimidsimidsimidsimidsimidsimidsimidsimidsimidsimidsivemidsics（px459 ctcf_ko_grna3/cas9）转染3×105个细胞 。11668019）根据制造商的说明
。为了删除第二个正向CTCF结合位点（染色体15：11683162–11683179），用1 µg PX459 GRNA2_CTCF_KO/CAS9和1 µg PX459 GRNA6_CTCF_KO/Cas9 plofification（cas9 plicifiicics）转染1 µg PX459 GRNA2_CTCF_KO/CAS9转染1×106个细胞11668019）根据制造商的说明。然后
，转染后24小时，将1 µg ml -1的嘌呤霉素添加到培养基中3天 。然后将细胞在标准的E14培养基中培养4天
。为了选择具有纯合缺失的细胞系 ，通过96孔板上的FACS分离单个细胞。在补充有100μgml-1 primocin（Invivogen
，ANT-PM-1）和10 µM岩石抑制剂（Stemcell Technologies，Y-27632）的E14标准培养基中 ，将分类细胞保存2天 。然后将细胞培养在标准E14培养基中
。通过用裂解缓冲液（100 mM Tris-HCl pH 8.0 、5 mM EDTA
，0.2％SDS，50 mM NaCl ，蛋白酶K和RNase）和随后的异丙醇沉淀提取基因组DNA。通过基因分型PCR分析单个细胞系
，以确定含有CTCF结合位点的基因组区域的纯合缺失 。选择并扩展了显示校正基因分型模式的细胞系
。补充表1中提供了用于基因分型的引物的列表。 　　用Accutase（Sigma-Aldrich，A6964）收集细胞 ，并吸附在聚赖氨酸（Sigma-Aldrich
，p8920）的预盖覆盖层上 。然后在PBS中用3％PFA（EMS，15710）在室温下用PBS固定细胞 ，用PBS洗涤，并在-20°C下保存在70％的乙醇中。在70％乙醇中至少孵育24小时后
，将盖玻片与新鲜制备的洗涤缓冲液一起孵育10分钟，由10％甲酰胺（Millipore Sigma ，S4117）组成2×SSC（Sigma-Aldrich
，S66639）
。在37°C下，在新鲜制备的杂交缓冲液中 ，将盖玻片杂交过夜（约16小时）
，该缓冲液由10％甲酰胺，10％硫酸葡萄酸盐（Sigma-Aldrich ，d6001）组成
，在2 x SSC中包含125 nm的RNA-fish Probe集合，与SOX2的Labib ables and ax2 plab abere ands and ax2 pabers and ix2babip and a sox2 babiris and abeser and abeser and a in quasar 670（Stellar 670）Quasar 570（Stellaris）。杂交后 ，将盖玻片用洗涤缓冲液在37°C下在37°C的37°C下洗涤两次
，然后摇动，然后在PBS（Sigma-Aldrich ，d8537）中与500 ng ML-1 DAPI溶液（Sigma-Aldrich，D9564）孵育5分钟 。然后将盖玻片在PBS中洗涤两次
，并用延长的金培养基（Invitrogen，P36934）安装在幻灯片上 ，并在室温下固化24小时
。然后将盖玻片密封并在24小时内成像。 　　在配备有100 mW 561 nm和100 mW 642 nm HR二极管固态激光器
，Andor Ixion 885 EMCCD相机以及αPlan-Fluar×100/100/100/100/1.45 Na Na Imermersion目标的Zeiss Axion观察者Z1显微镜上获取图像 。使用DSRED ET滤光片集（AHF AnalySenteChnik，F46-005） ，Cy5 HC Mfish滤波器集（AHF AnalySentEchnik
，F36-760）和SP
。Aqua HC-Mfish滤清器集（AHF Analysentechnik，F36-710）。RNA-Fish探针的典型暴露时间设置为300-500毫秒左右 ，15-20 EM增益和100％激光强度 。DAPI信号通常以20 ms的暴露时间成像
，EM增益为3和50％激光强度
。图像的像素尺寸为0.080×0.080 µm，Z-STEP约为55-70 Z-planes ，Z-Step为0.25 µm。 　　将原始图像用刀片
，python和fiji处理，以提取每个细胞的RNA数量 。下面描述的KNIME工作流程基于先前发布的WorkFlow55
。首先将Z-stack投影到每个荧光通道的最大投影。然后使用高斯卷积（σ= 3）对单个细胞进行分割 ，然后使用OTSU滤波器，分水岭和连接的组件分析进行核分割的全局阈值进行过滤 。然后用种子流域估算胞质区域。核的细胞部分在视图框架之外被自动排除
。在最终分析中手动排除了包含明显的伪影
，错误分段或未完全捕获的细胞。斑点检测基于Trackmate56中实现的高斯方法的拉普拉斯 。对于包含RNA探针信号的通道，通过选择0.2μm的点尺寸0.2μm和阈值以基于多个代表性图像的视觉检查 ，通过选择点尺寸为0.2μm和阈值来检测RNA斑点（滚动球半径20-25像素）
。斑点检测是基于从跟踪者的高斯方法的拉普拉斯式的。在RNA通道中检测到RNA斑点的子像素定位
，每个实验条件的每个细胞的斑点列表，并生成复制 。然后通过Python中的细胞聚集每个通道中的斑点 ，以提取每个细胞的RNA数量
。 　　为了生成增强剂记者测定的向量
，SOX2启动子，SCR和SCR（EI和EII）的截短版本从E14 MES细胞基因组DNA中使用Primers使用Primers a Primers and Gibson Asspembly策略进行了phusion高效DNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific ，F549）。如上所述
，将SOX2启动子克隆到3-SB-EF1-PBBAR-SB矢量中 。通过用Agei（NEB，R3552）线性化矢量 ，然后使用Gibson Assembly克隆
，将SCR和截断版EI和EII克隆在SOX2启动子的前面
。在增强子的5'和3'端都插入了人α2-珠蛋白基因和SV40 poly（a）序列的转录暂停序列。为了测试增强剂活性，根据制造商的说明 ，使用Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific，11668019）
，与0.5 µg不同版本的PiggyBac载体和0.5 µg PBROD3_HYPBASE_IRES_IRES_TAGRFPT共转染了3×105个细胞 。作为对照，转染了携带SOX2启动子的0.5 µg PiggyBac载体
。转染后24小时 ，收集细胞并通过流式细胞术分析。 　　在室温下将细胞（20×106）与1％甲醛（EMS
，15710）交联10分钟，并用甘氨酸淬灭（最终浓度 ，0.125 m） 。将细胞在1 M Tris-HCl pH 8.0
、5 M NaCl和10％NP40和完整蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich
，11836170001）中裂解，并使用MBOI的1,000 U（NEB ，R0147）酶消化。然后将消化的染色质与10,000 U的T4 DNA连接酶（NEB
，M0202）在连接酶缓冲液中绑扎，并补充了10％Triton X-100（Sigma-Aldrich ，T8787）和240 µg的BSA（NEB
，B9000）
。在65°C下用400μg蛋白酶K（Macherey Nagel，740506）和苯酚 - 氯仿纯化 ，将结扎的样品与400μg蛋白酶K（Macherey Nagel，740506）进行除外。3C library preparation and target enrichment using a custom-designed collection of 6,979 biotinylated RNA ‘baits’ targeting single MboI restriction fragments chromosome 15: 10283500–13195800 (mm9) (Supplementary Table 2; Agilent Technologies; designed as in ref. 57) were performed according to the SureSelectXT Target Enrichment System for Illumina Paired-End多路复用测序库协议 。唯一的例外是使用9 µg的3C输入材料（代替3 µg）和使用Covaris超声处理的DNA使用以下设置：占空比：10％；峰值事件功率：175；每次爆发的周期：200;治疗时间：480 s；浴温：4°C至8°C）
。 　　使用在线工具（https://eu.idtna.com/site/site/order/order/designtool/index/crispr_sequence）设计针对转基因同源臂外部染色体的特定基因组区域的GRNA序列（补充表1）。定制设计的Alt-R CRISPR – CAS9 CRRNA（5个针对上游地区的CRRNA和5个针对该地区的crrnas
，将其瞄准了集成转基因的区域），Alt-R CRISPR – CAS9 Tracrrna（IDT ，1072532）和Alt-R-R SPCAS9酶（IDT
，1081060） 。样品制备和CAS9富集是根据先前描述的协议51进行了一些修改的
。根据制造商的说明，使用Gentra Puregene细胞试剂盒（Qiagen ，158745）提取Mes Cell创建者系的基因组DNA。使用TapSestation（Agilent）系统检查高分子质量DNA的质量 。通常
，使用虾碱性磷酸酶（RSAP； NEB，M0371）在37°C下处理5 µg高分子质量DNA进行孵育30分钟30分钟 ，然后在65°C下5分钟以dephosphorate dephosphorate dna dna无端
。对于CAS9富集目标区域
，所有十个Alt-R CRISPR-CAS9 CRRNA首先以等效量（100 µM）汇总，然后在95°C下与100 µM Alt-R-R CRISPR-CAS9 TRACRRNA孵育5分钟 ，以组装Alt-R Guide RNA Duplex Duplex（CrRNA：TracraCrna：TracraCrna：TracraCRNA）。为了组装RNP复合物
，将4 pmol的Alt-R SPCAS9酶与8 pmol Alt-R Guide RNA（CRRNA：TRACRRNA）在室温下孵育20分钟 。通过添加10 µL的RNP复合物，10 mM的DatP（NEB ，N0440）和5 U的TAQ聚合酶（NEB，M0267）并在37°C下在72°C下5分钟
，在37°C下孵育30分钟
。根据制造商的说明，使用连接测序试剂盒（Nanopore ，SQK-CAS109）进行纳米孔测序的适配器连接。用Ampure PB珠纯化（WITEC
，100-265-900）之后， 将样品加载到Mniion系统中 ，选择SQK-CAS109协议 。 　　为了绘制纳米孔测序读数
，我们首先构建了一个自定义基因组，该基因组由左侧约10 kb小鼠基因组序列的侧翼和下游的转基因序列组成。自定义基因组可以在GitHub（https://github.com/zhanyinx/zuin_roth_2021/blob/main/nanopore/cassette/cassette/cassette.fa）上找到
。使用MiniMAP2（v.2.17-R941）映射到自定义基因组 ，并带有“ -x map-ongon ”参数。纳米孔测序分析已使用Snakemake工作流（v.3.13.3）实施 。使用IGV（v.2.9.4）可视化读取
。完整的工作流可以在GitHub（https://github.com/zhanyinx/zuin_roth_2021）上找到。 　　用ACCUTASE（5分钟
，37°C）收集小鼠胚胎干细胞并计数 。用300 µL Trizol试剂裂解细胞（3×105）
。使用Zymo的Direct-Zol RNA提取试剂盒提取RNA。根据制造商协议，在Illumina Truseq滞留mRNA-Seq之后进行了库制备 。使用以下选项将读取映射到Mus Musculus基因组（构建MM9） ，使用以下选项：-outsjfilterReads唯一 - out -outfiltertype bysjout -outfiltermerultimapnmax 10 -Alignsjoverhangmin 6 -alignsjdboverhangmin 2- alignsjdboverhangmin 2 -outfiltermax andfiltermax nmax 0.004 -almaxnovermax -anoverlmmax -almmax -almmax -almmAx-AlignIntronMax 1000000- OUTSAMSTRANDFIELD INTRONMOTIF -OUTFILTERTERINTRONMOTIFS删除novenonancanonicalnicalAnnoNtatient -OutSamType bam sortedByCoordion -seedSearchStartlmax 50 -twopassmode -basic
。使用QUASR软件包59中的QCOUNT使用“ TXDB.MMUSCULUS.UCSC.MM9
”来定量基因表达
，以用于基因注释（生物导体包装：Carlson M和Veraderbp。txdb.mmusculus.ucsc.mm9.ucm9.ucm9negencefor txdb for txdb对象（s）; 2. 2. 2. 2. 2. 2. 2. 2. r 。主动启动子被定义为LOG2 [RPKM+0.1]高于1.5的基因
。 　　使用HIC-PRO60（v.2.11.4）分析捕获-C数据；这些参数可以在GitHub（https://github.com/zhanyinx/zuin_roth_2021）上找到。简而言之，读取对被映射到小鼠基因组（构建MM9） 。识别结扎现场后 ，回收了嵌合读数。仅使用唯一的有效对映射到目标区域来构建接触图
。然后将迭代校正61应用于bined数据。目标区域可以在GitHub（https://github.com/zhanyinx/zuin_roth_2021）上找到 。对于SCR_ΔΔCTCF，SCR_ΔCTCF和衍生的克隆线
，使用复制数据的数据用于整个手稿中的定量和图
。 　　为了评估通过插入转基因和动员增强子（异位序列）引起的结构扰动，我们考虑了由于异位序列的存在而导致的基因组距离差异。在创始人的细胞系（例如SCR_δCTCF）中 ，插入转基因会修饰上游位点和下游插入位点之间的基因组距离 。为了解决这些差异
，我们生成了距离差异捕获-C映射，其中每个条目对应于相互作用的相互作用箱之间的相互作用
。离群值（使用四分位数规则定义）或没有捕获-C相互作用的垃圾箱被视为噪声并过滤掉。也被滤除了定义为Z分数最高0.1％的单例 。z评分定义为（obs - exp）/stdev ，其中obs是给定相互作用的捕获-C信号
，EXP和exDEV分别是捕获C信号在两个基因座的基因组距离处的捕获-C信号分别是两个基因座的基因组距离
。接下来，我们计算了距离标准化和噪声过滤的捕获-C映射之间的比率。将带有2个垃圾箱的窗口的双线性平滑施加到比率图上 ，以评估由异位序列的插入引起的结构扰动 。 　　使用具有四个状态的Chromhmm28来称呼染色质状态
。补充表3提供了使用的组蛋白修改数据集的列表。在H3K9me3和H3K27me3中富集的状态合并
，因此产生了三种染色质状态：活性（富含H3K27AC，H3K36ME3 ，H3K36ME3
，H3K4ME1和H3K9AC），H3K9AC ，REPISSICAL H3和H3 and H3 and H3 and 3k9 and in n3 k.nich and in n3 knich ins in in n3 insed in in n3 knich ins in n3 k 。中立（无富集）。 　　为了识别真正的阳性增强子重新插入位点，我们首先过滤了包含EGFP片段的读取
。然后
，我们仅保留读取对的读取对，其中一侧映射到ITR序列 ，另一侧映射到Splinkerette适配器序列。我们使用带有默认参数的BWA MEM62分别将读取对的ITR/Splinkerette侧映射到鼠标基因组（构建MM9） 。仅保留了ITR和Splinkerette侧面读取20多个读取的集成站点
。 　　为了映射单个细胞系中的增强子位置
，将没有适配器序列的Sanger测序（microsynth）被过滤了。然后，使用VMATCHPATTERN（BioStrings v.2.58.0）将适配器后的前24个bp映射到小鼠基因组（MM9） 。可以在GitHub（https://github.com/zhanyinx/zuin_roth_2021）上找到用于映射Sanger测序的脚本
。 　　在对齐配对末端的测序读数之前 ，使用Castadapt63的适应来过滤读取
，并以多个步骤处理每个读取对。源自TN5和每个ITR的序列模式被去除 。来自两个ITR的配对末端读物都得到了相同的处理
。首先，在第二次读取的开始时检测到5'ITR和3'ITR序列的唯一部分的存在 ，如果存在
，则将此序列修剪。接下来，修剪了5'ITR和3'ITR上发现的TTAA位点的序列 。该序列仅部分包含用于每个ITR的相应引物 ，并用于过滤读取
，该读取包含始于转座子的正确PCR产物期望的序列
。序列到但不包括，ttaa被删除。接下来 ，所有来自TN5或ITR的所有其他序列模式均从对中的第一个读取的5'端以及两次读取的3'末端删除 。 　　过滤和修剪读取后，将读数与参考基因组进行对齐
，其中split-GFP构建体的计算机插入，但带有单个TTAA基序 ，而不是PiggyBac Transposon。这是通过将质粒中发现的同源臂与MM10参考基因组的对齐来完成的
。参考匹配的两个臂上的完整序列被插入的质粒序列取代。 　　使用Bowtie2进行对齐
，将片段长度设置为最小为0 bp，最大为2,000 bp进行对齐 ，并使用了非常敏感的选项 。将读取与基因组对齐后
，使用Sambamba64去除重复项，并使用Samtools65进行过滤读取未正确配对的读取对
。然后 ，我们指定了每对读对
，第二个核苷酸的前4个核苷酸的位置读为推定的插入位点。为了计算起源于非动物位置的读取的比例，重叠的非动物位置重叠的读取对数（替换了硅插件的piggybac的TTAA）在读取的总读取数量上分为读取的总读取数量 ，至少是一个读取的读数
，与一个读取的质量相比，与2个读取的读数相比 ，与2个读取的读数相比，与2个读取的读数相比
，与2个 。3'ITR
。 　　线性模型用于根据平均EGFP强度预测EGFP mRNA的平均数量。将模型拟合在7个数据点上，对应于使用单分子RNA荧光原位获得的EGFP mRNA的平均数量 ，以及通过流式细胞仪获得的平均EGFP强度（扩展数据图1H; R2 = 0.9749
，p <0.0001，t检验） 。 　　从机械增强子 - 启动器模型中得出的现象学两态模型（图2）和明显的两态模型（图3）均同时拟合到在单个细胞系中测得的平均EGFP水平 ，以及在SSC在不同距离处的SMRNA-FILE测量的RNA分布中测量的RNA分布
，从而在不同的距离处与促进剂相比
。通过分析计算了mRNA的平均数量，并且每个细胞的mRNA数量的稳态分布被数值近似（补充信息 ，模型描述）。现象学两态模型的参数是最小值
，最小值，降速率KOFF ，启动速率µ和恒定C和山丘指数H
，它们共同控制KON对接触概率的非线性依赖性 。表观两态模型的参数是基础速率，增强的速率 ，OFF速率KOFF，起始速率µ
，调节步骤β的前向和向后速率之间的比率以及调节步骤n的数量n
。所有这些参数在拟合过程中被认为是免费的。明显的两态模型也适用于用SCR的截断版本从EGFP+细胞系推断出的bin的平均数量mRNA分子数（图4） 。在这种情况下，使用对数转换的似然比将三个版本的表观两态模型拟合到数据。参数β（版本1）或（模型2）或两者（模型3）被认为是自由参数 ，而其他参数固定在全长SCR数据集获得的最佳拟合值中
。使用对数转换的似然比
，将三个版本的拟合度与所有参数都被认为是免费的模型的拟合度进行了比较。增强剂 - 启动器通信模型的数学描述，即明显的两态模型的推导 ， 并在补充信息（模型描述）中详细说明了拟合程序 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得
。