如先前所述3,5,7 ，所有小鼠线均由CRISPR -CAS9在基因组工程单元（https://crisprmice.eu/）上产生 。先前已经描述了条件的Tent5aflox/Flox和双敲击Tent5aflox/floxtent5c - / - 先前已描述了7
。从杰克逊实验室购买了CD11C-CRE（B6N.CG-TG（ITGAX-CRE）1-1-REIZ/J）小鼠菌株
，并与Tent5aflox/Flox交叉。FKBP12F36V-HA-TENT5A小鼠系是通过插入DTAG DEGRON的序列和内源Tent5a的N末端的2×ha标记来生成的 。将B6CBAF1 Zygotes与含有Cas9 mRNA的混合物，靶向Tent5a（AAAAGTATATCTCTCTGATGCATC）和双链修复模板进行了微注射
。（tagaaggggcggcgccctcccccaggtgcacagagacgggctcgctcgcttgtgtttcccagatggggaggcagggcagggggtggaaaccatcccccccccccccaggcgcgcgccacccccccccccccccaagcgcgcggcggcgcgcagcagcctgcg ，TGGTGCACTACCGGGTGCTTGAAGAGAGAAAGAAGAAGAAGAAGTTGATCCCCCCCGGACAGAAACAAGCCCTTTAAGTTATTATGCTAGGCAGCAAGGGAGGGGGTGAGGTGAGGTGGGTGGGCTGGGGCTGGGAGAAGAAGGAGGGGGGGGTGCCCAGatgagtgtggtggtcagagcaaCcaaCcaAccaTatatCcccagattgcctatgccctgcactgcgcaccccaggcatcatcatcaccaccaccaccaccaccaccaccaccactcgtcgtcgtcgatgtggtggagcttctcttctaaaaaaaaaaa acctggagggCGGCTACCCCTACGCCCGCCGCCGCCGCGCTATCCGTATGTGTGTGTCCGCGACGATGCGGCGGCGGCGGACAGAGAGATACTTTTGGTGCGGGGGGCTGCTGCTGCGGCGGGCGGCGGCGCGCGCGCGCGCGCGGCGGCGGCGGCTGGCTGGCATTG）。将Zygotes转移到替代母亲身上
，并使用3-Primer方法（FW：GCAGCTCCTGCGAAGTGTG，RV1：TGCCATGGCAAAGTACCTTC ，RV2：rv2：cccacactcatctctctctggcaac）筛选幼崽进行插入 。通过Sanger测序对潜在的创始人进行测序
。在华沙大学生物学学院的动物设施中繁殖了小鼠
，并在常规条件下维持3,5,7的开放式聚丙烯笼子，里面装满了装有筑巢材料和纸管的木奇普床上用品。用标准实验室饮食（Labofeed B ，Morawski）随意喂养小鼠 。将房间的湿度保持在55±10％，温度保持在22°C±2°C
，空气至少每小时更换15次，并使用了12 h – 12-h的光制状态（从06:00到18:00亮起）。在IDEXX实验室进行定期健康监测
。在数据库中用单个数值标签分配了不同基因型的小鼠 ，它们用于组织收集
，并在随后的整个处理过程中用作唯一的标识符。 　　丢弃的残留疫苗材料：mRNA-1273（Moderna，单价或二价原始/Omicron Ba.4-5 Spike） ，BNT162B2（Pfizer Monalaletent或Bivalent Origan/Omicron Ba.4-5）
，Nuvavaxoxovid（Novavax，Novavax ，Revavax
，Revavax，Revavax ，Recombinant Spikike Protein oferein oferety newseline newarditure newderuty newarditure newarditure newarditure newarditure）均已在制造商中使用 。由于当时无法购买
，并且仅使用剩余（否则废弃）材料，因此我们获得了波兰卫生部（MMI.454.1.2021.tm）的批准
。 　　All animal experiments were approved by the II Local Ethical Committee in Warsaw (approval numbers: WAW2/71/2021, WAW2/129/2021, WAW2/95/2022, WAW2/127/2022 and WAW2/007/2023) and were performed according to Polish law (act number 653 266/15.01.2015) and in agreement with the corresponding European Union directive. 　　用0.9％NaCl（对照组） ，1 µg mRNA-1273（ModernA）或BNT162B2 mRNA（pfizer）或50 µL nuvaxovid疫苗（Novavavax）以40 ng-1蛋白质浓度对六到四周大的小鼠免疫注射肌肉内（股外侧区域）注射（对照组），1 µg mRNA-1273（对照组）或BNT162B2 mRNA（pfizer）或50 µL nuvaxoxovid疫苗（Novavax）。在设定的时间点收集组织以进行后续分析 。使用了两性的小鼠
，在直接比较的组中，两性的比例相等或相似
。在免疫实验中不考虑小鼠的性别 ，仅是基因型。 　　先验没有正式的样品大小计算 。基于类似的已发表研究和3RS原理（替代
，减少和精炼）的既定实践来确定样本量
。根据我们以前的经验和可比的研究，我们使用了所需的最低数字来达到统计意义 ，同时保持科学严谨性。为每个实验提供了有关样本量的详细信息 。具有不同基因型的小鼠无法通过实验者区分（除了具有可区分表型的Tent5a - / - 小鼠除外）
。但是
，疫苗接种是一种常规程序，因此在疫苗接种时有关小鼠基因型的知识极不可能影响免疫结果。 　　根据制造商的建议 ，使用商业可用的ELISA试剂盒（EH492RB; 1222062723
，12222110123，1222110123和KRISH015） ，根据制造商的建议测量了小鼠血清中尖峰蛋白受体结合结构域
，抗尖峰IgG和总IgG的浓度 。MacOvSPQ1023，MacOvSPQ0223和MCOV2SSS0822）和Eagle Biosciences（OGG11-K01; 25Q1和26）分别。使用MyBioSource（MBS2000240; L240916286）的ELISA套件测量OVA水平
。通过实验确定样品稀释 ，以适合每个ELISA的标准曲线。由于免疫接种之间的间隔，不同版本以及许多疫苗和ELISA试剂盒
，具体取决于可用性 。因此，ELISA结果应解释为实验之间的半定量
。对于所研究的所有条件 ，总是同时执行一个实验
，因此可以解释为定量，从而可以在实验条件之间进行直接比较。 　　疫苗注射后6小时 ，12小时
，12小时或48小时隔离肌肉，使用手术剪剪切细节 ，并重悬于2 ml的无血清RPMI中
，补充了1,000 U ml-1胶原酶，并从梭状芽胞杆菌（Sigma-aldrich ，C9407）中
，c9（Sigma-Aldrich，10104159001）和8 µg Ml-1配置酶I（Sigma-Aldrich ，D4693） 。将样品与140-RPM搅拌在37°C下孵育30分钟
。从那时起，将消化的肌肉悬浮液放在冰上并在4°C处理。将十毫升的冰冷FACS缓冲液（PBS中的0.2％BSA）添加到肌肉悬浮液中
，然后用70 µm尼龙滤网过滤（Greiner，542070） 。在滤网上 ，将悬浮液以300克离心7分钟
。用ACK（150毫米氯化铵
，1毫米碳酸氢钾和0.1 mM EDTA，pH 7.2）用ACK（150 mM氯化铵 ，1毫米）对粗粒药处理2分钟
，然后用10 mL FACS缓冲液洗涤2分钟；每次以300克的速度进行离心7分钟。然后将粗整物重悬于1 mL FACS缓冲液中，并通过FACS管的30μm盖滤器拉紧 。盖上盖子 ，将样品在4°C下以800克离心3分钟
，然后丢弃上清液，然后在2 mL FACS缓冲液中重悬于
。在PBS中 ，将相同的样品与33％的Percoll（GE17-0891-01）彻底混合
，并在4°C时以800g旋转30分钟。将上清液丢弃，并对细胞颗粒进行染色 。 　　将细胞用FACS缓冲液洗涤一次 ，并用FC块抗CD16/32（克隆2.4G2）（BD Biosciences，553142）在冰上孵育5分钟
，用FACS缓冲液洗涤，并用抗CD45-Percp – Percp – Percp – Cy5.5 ，抗CD45 – Percp – cy5.5
，Anti-CD11b – BBV786，Antipy-Fe786 ，Antipi-fef-i-Fe786
，80 – 80 – 80 – 80 – 80 – Pepe-pe。抗-I-A/I-E-E-BV605，抗CD11C-PE和抗CD64-APC – FIRE750在4°C下40分钟 ，不受光保护（补充表11中提供了抗体和稀释的详细信息）
。染色后
，用FACS缓冲液洗涤细胞，然后用活/死的紫罗兰死细胞染色套件（Thermo Fisher Scientific ，L34964）在4°C下染色15分钟
，免受光线保护。细胞分选在由Cytexpert SRT V.1.1软件操作的CytoFlex SRT细胞分散器（Beckman Coulter）中进行 。使用限制性门控策略来对M0巨噬细胞和DC进行排序（补充图5）
。门控策略是基于门控活单线的，接下来的细胞被识别为CD45+ ，CD11C+和I-A/I-E（MHCII）+，排除了CD64和F4/80的双重阳性细胞的排除为DCS。将活的单重线识别为CD45+
，CD11C+，I-A/I-E（MHCII）低/ - ，F4/80+和CD64+被分选为M0巨噬细胞 。为了进行后分析
，将细胞分选为100 µL PBS
。在第一个样本上进行了分类分析，以验证分类种群的纯度。对于RNA分离 ，将细胞直接分为100μL或250 µL的提取缓冲液（Applied Biosystems
，kit0204），具体取决于细胞量 ，然后在14,000g下离心5分钟
，并冷冻直至进一步处理 。 　　A549和HEK293 FLP-IN T-REX细胞系及其衍生物在Dulbecco的修改后的Eagle的培养基（DMEM； Gibco）中培养，在37％Co2 copenere中 ，补充了10％FBS（Gibco）和Penicillin-Stroptomycin（Sigma-Aldrich）的10％FBS（Gibco）（Gibco）（Gibco）（Sigma-Aldrich）
，直到80％co2，直到80％co2 coperence
。为了产生HEK293 FLP-IN T-REX（R78007 ，Thermo Fisher Scientific）细胞系，并有条件敲低CNOT1
，我们使用了先前由US29描述的策略。A tri-miRNA construct (listed below; stem–loop sequences ATGGAAGAGCTTGGATTTGAT, CTCCCTCAATTCGCCAACTTA and AGGACTTGAAGGCCTTGTCAA) was designed, and cloned at the BspTI (AflII) + NotI restriction sites in a pKK-RNAi vector (pKK-BI16 nucCherry EGFP-TEV).在六孔板上补充了10％FBS的DMEM高葡萄糖培养基（Gibco）中生长的总共1×106 HEK293 FLP-IN T-REX细胞，并用300 ng的CNOT1含糖构建体转染了300 ng ，与1μgPOG44质粒和250米尔的培养基混合的CNOT1含糖构建体转染
，并补充了250米尔的培养基，并补充了250米 。（Mirus ，mir5400）
。将细胞播种在60毫米板中
，并在添加了40 µg ML-1湿霉素的DMEM高葡萄糖培养基中培养，并在前六到7天中培养。细胞生长 ，直到四个星期后出现单个菌落 。包括对未用PKK-BI16质粒转染的细胞的控制
，以确保细胞系的特定选择。通过在最终浓度为100 ng ml -1的最终浓度下添加强力霉素（Thermo Fisher Scientific）诱导外源miRNA基因的表达
。细胞枚举是由X. Chen（UCSF）实验室描述的Crystal Violet（Sigma，C3886）进行的。简而言之 ，将细胞培养基吸入（必要时收集以进行后续ELISA）
，并用1 mL PBS洗涤细胞 。然后将染色溶液（20％甲醇中的0.25％晶体紫）添加到每个孔中，并在室温下孵育10分钟
。然后除去染色溶液 ， 将细胞用2 mL PBS冲洗6次，然后蒸发其余的溶液
，并扫描板。 　　从Tent5aflox/floxtent5c - / - ，FKBP12F36V-HA-TENT5A和野生型小鼠中分离出来 ，从骨髓单核细胞和野生型小鼠中建立了主要的MBMDM培养物 。两性的年轻小鼠（12-25周）通过宫颈脱位安乐死
。分离股骨和胫骨
，并使用基于离心的方案24,30收集骨髓。将材料从几只小鼠（同性的兄弟姐妹）中混合，以获得足够的细胞进行后续分析 。在进一步的分析中未考虑用作骨髓细胞来源的小鼠的性别
。将骨箭细胞铺在IMDM培养基（Thermo Fisher Scientific ，21980065）中
，并补充了10％FBS（GIBCO），100 U ML-1 Penicillin和0.1 mg ML-1链霉素溶液（Sigma-Aldrich）和10 ng ml-1摩托噬细胞粘液菌（Moll-1）元素 - 含量为31型元素培养因子（MM-1-5）和31型培养因子；37°C在5％CO2中。对于有条件的Tent5a基因靶向 ，用携带CRE重组酶（PCAG-CRE-CRE-IRES2-GFP）分离后第八天转导MBMDMS 。如先前所述
，进行慢病毒的产生，细胞转导和基因分型
。3,7。分离后的第14天 ，将细胞用于实验 。 　　为了诱导TENT5A的耗竭
，将0.7×106 MBMDMS从野生型和FKBP12F36V-HA-TENT5A小鼠中获得的0.7×106 MBMDM在六孔板中播种，而24小时后 ，Degron是通过添加1 µm DTAGVV-1或Dimethyl硫氧化物（DMSO dmso dmso）诱导的。同时将疫苗添加到细胞中，并在设定的时间点中收集细胞
。 　　根据制造商的指示
，使用Messengermax（Invitrogen，LMRNA001） ，用IVT mRNA（带有尿苷或Mψ）对MBMDM进行了反向转染
，该MBMDMS根据制造商的指示，在五个技术复制中编码了高RSCU EGFP（Ref。32） 。简而言之 ，将用于转染的mRNA在Opti-Mem（Gibco
，31985047）中稀释，以在10 µL Opti-Mem中获得40 ng的mRNA ，而Messengermax（Invitrogen
，LMRNA001）在Opti-Mem中稀释，相当于Opti-Mem的Opti-Mem中 ，在10 µL的Opti-MemEm e Offi memem l e perie中
。将稀释的mRNA与稀释的转染试剂混合在96孔板上
，剩下40分钟，然后转移到384孔板上（Perkin Elmer ，6057300）。使用专用的室载玻片（Invitrogen，C10283）
，在伯爵夫人3L计数器（Invitrogen，AMQAF2000）中计数MBMDM 。最后 ，将细胞稀释至每个孔5,000个细胞
，并补充DTAG-V1（Bio-Techne，7374/5） ，最终浓度为2 µm
。对照细胞在没有degron电感器的情况下接种。然后使用多板E3X（Eppendorf
，4987000029）和Combitip 5 mL Biopur（Eppendorf，0030089669）将细胞以100 µL的体积在制备的板上播种 。成像从Perkin Elmer转染后4小时 ，使用三个通道：488 nm（时间：50 ms
，功率：20％，身高：-8.0 µm）；明亮场（时间：20毫秒 ，功率：20％
，高度：-0.0 µm）;数字相对比（时间：20毫秒，功率：20％ ，高度：-1.0 µm）;水目标20×非焦点；binning 2×2
。每2小时拍摄一次实时图像，持续72 h。 　　巴菲大衣是从华沙地区血液中心商业获得的 。所有捐助者都是18-45岁的健康男人
。通过使用淋巴结杆菌（Stemcell Technologies）
，通过密度梯度离心捐赠后1-2小时，在捐赠后1-2小时内分离外周血单核细胞（PBMC）。接下来 ，使用LS柱（全部来自Miltenyi biotec）
，用抗人类CD14抗体涂层的微粒分离CD14+ PBMC（单核细胞），以抗人类CD14抗体涂层的微粒（全部来自Miltenyi Biotec）进行了分离 。对CD14+细胞进行计数 ，并在0.1％锥虫蓝溶液（Sigma-Aldrich）中检查活力
，并用于随后的HMDM分化。每个隔离导致的生存能力超过95％
。 　　将CD14+ PBMC播种在10 cm组织培养物处理的培养皿中，密度为1×106–2×106个细胞 ，每毫升在10 mL的RPMI-1640培养基中（Sigma-Aldrich）
，补充10％热接种FBS（HYCLONE），2 mm-gmm-glutmanine（sigma-aldrich）青霉素和100μgml-1链霉素（均为Sigma-Aldrich） ，1％（V/V）MEM非必需氨基酸溶液（Thermo Fisher Scientific）和1 mM丙酮酸钠（Sigma-Aldrich）补充了50 ng Ml-1的ML-CSF（用于MoClage）MoCroplage（sigma-Aldrich）。检查从M-CSF补充的培养物中收集的粘附细胞中是否有巨噬细胞的标记 。用僵尸紫外线或僵尸固定可生存力试剂盒（Biolegend）和检测膜标记CD14
，CD83，CD86 ，CD163，CD163
，CD206和HLA-DR（补充表11中列出）的抗体对HMDM进行染色
。使用同种型和荧光减去一（FMO）对照和内置补偿算法优化抗体面板。使用FACSDIVA 8.3软件操作的Fortessa X-20分析仪（BD Biosciences）进行流式细胞仪 。FlowJo V.10.6.1软件（BD Biosciences）用于数据分析
。 　　如上所述，前一天将0.5×106–1×106细胞在培养基中的六孔板上播种。在室温下将原始LNP配方中所需量的疫苗mRNA稀释在150 µL Opti-Mem培养基（Thermo Fisher Scientific）中 ，并以滴度智能的方式将10分钟添加到细胞中
，并轻轻混合 。在为单个实验指定的时间点收集细胞
。 　　在剂量依赖性实验中，用不同体积的原始LNP转染细胞 ，并在Opti-Mem培养基中稀释的RNA量（0.2 µg
，1 µg，2 µg ，2 µg
，5 µg或10 µg）。对于对照单元（未用指定代理处理的单元），添加了适当的Opti-MEM 。根据制造商的说明 ，用脂肪阳离子胺的Messengermax（Thermo Fisher Scientific）进行了纯化的疫苗mRNA的所有转染
。在为随后的分析的单个实验指定的时间点收集细胞。 　　根据制造商的指示
，使用用于培养细胞的亚细胞蛋白分级试剂盒分割巨噬细胞（Thermo Fisher Scientific，78840） 。所有使用的缓冲液均补充了Ribolock（Thermo Fisher Scientific ，EO0382），最终浓度为1 U µl -1。立即将收集的RNA分离的馏分与Trizol ls合并
，在室温下孵育五分钟，然后在–80°C下冷冻
。对于蛋白质印迹分析 ，将样品冷冻在液氮中。 　　使用经过验证的隐形siRNA：HSS124645
，HSS124646和HSS183139（全部用于TENT5A），使用经过验证的隐形siRNAS进行HMDM中的siRNA介导的敲低 。Knockdowns in mBMDMs were performed using validated stealth siRNAs: MSS279478 (Tent3a; also known as Tut4 and Zcchc11), MSS279479 (Tent3a), MSS210722 (Tent3b; also known as Tut7 and Zcchc6), MSS210723 (Tent3b), MSS200078 (Tent2; also knownAS PAPD4） ，MSS200079（TENT2）
，MSS209990（TENT4A;也称为PAPD7），MSS209991（TENT4A） ，MSS277931（TENT4B; TENT4B;也称为PAPD5）
，也称为PAPD5），MSS277932 ，MSS277932（TENT4B）
，MSS220103（FNDC3A）和MSS220103（FNDC3A）和（FNDC3B）
。 　　如前所述24,33，用Lipofectamine Rnaimax（Invitrogen）进行转染 ，并根据制造商的说明进行转染。使用了推荐的阴性对照（Invitrogen，12935100） 。 　　在补充了0.1％NP40
，蛋白酶抑制剂和粘醇酶（终浓度为0.1 U ML-1； A＆A生物技术，1010-100）的PBS中 ，将相等数量的细胞裂解
，在37°C下30分钟，在1,200 rpm下摇动 ，在37°C下进行37°C
。然后加入3×SDS样品缓冲液（187.5 mM Tris-HCl pH 6.8、6％SDS
，150 mM DTT，0.02％Bromophenol Blue ，30％甘油和3％2-巯基乙醇）
，并添加样品煮沸10分钟。将样品在12-15％SDS-PAGE凝胶上解析，然后将蛋白质湿润转移至400 mA的突起的硝酸纤维素膜（GE Healthcare）1.5 h在1.5 h中 ，在1倍转移缓冲液中
，在1倍转移缓冲液中（25 mm Tris碱基，192 mm甘氨酸和20％属甲醇）（v/v） 。W/V ponceau在3％v/v乙酸中且数字化 ，通过在TBST缓冲液中孵育5％的牛奶1小时，然后在4°C下与特定的一级抗体（在补充表11中列出）在4°C下孵育（列出）1：5,000（α-微管蛋白
，β-肌动蛋白，肌动蛋白 ，EIF2A和GAPDH）在TBST缓冲液中进行3次洗涤10分钟
，并与HRP偶联的二级抗体（Millipore，401215）稀释（Millipbit）（Millipbit）在室温下 ，在TBST缓冲液中洗涤了3次
，并使用X射线膜或Chemidoc（Biorad）或Ibright（Thermo Fisher Scientific）成像系统可视化
。 　　根据制造商的说明，分别从具有TRIZOL试剂或TRIZOL LS试剂的细胞或疫苗样品中分离总RNA ，分别溶解在无核酸酶的水中
，并在-20°C（短期）或-80°C（长期）中储存。使用配备有7×115 mm锯齿齿（Fine）发电机探针的Omni Tismue匀浆器，通过在Tri试剂（Sigma ，T9424）中通过组织均质化（Sigma
，T9424）中的组织均质化（Sigma，T9424）中分离出来自冷冻肌肉和淋巴结的RNA 。根据制造商的说明进一步处理均匀的混合物
。对于QRT – PCR ，RNA-Seq和DRS库的准备，RNA用涡轮DNase（Thermo Fisher Scientific
，AM1907；或Invitrogen，AM2238）处理。为了评估分离株的完整性 ，使用Agilent High Serivitive RNA屏幕板（Agilent
，5067-5579），用Agilent 2200贴皮系统分析DNase处理后的每个RNA样品 。 　　遵循从分离柱中DNase治疗（QIAGEN ，79256）的RNA分离的指南
，使用Arcturus picopure RNA分离试剂盒（Applied Biosystems，kit0204）分离从荧光激活的细胞分选（FACS）获得的RNA（applied Biosystems ，kit0204）。对于QRT – PCR分析
，我们将每种类型的1,000个细胞从单独的小鼠中直接分类为100 µL提取缓冲液
。在cDNA测序的情况下，我们对每种类型的20,000个细胞排序 ，从三只小鼠汇集
，直接从250 µL提取缓冲液中排序。在降水步骤中，我们使用了1：1（V：V）70％乙醇：提取缓冲液比率 。在每种情况下 ，RNA在15 µL洗脱缓冲液中洗脱
。 　　根据制造商的说明，使用500 ng的DNE基总RNA作为模板（Invitrogen
，18080093）合成cDNA。最终的cDNA浓度保持在2.5 ng µl -1（从总RNA转换） 。在FACS分类细胞的RNA的情况下，将11 µL整个洗脱液用于cDNA合成
。 　　为了确定ModernA的MRNA-1273在小鼠组织或FACS分类细胞中的浓度 ，使用定制制作的Taqman探针与Taqman Gene基因表达主混合物（Applied Biosystems
，4369016）一起使用并与预设计的基因表达分析进行β-肌动蛋白（Applied Biososystemss，MMMMMMMM0120）一起使用并进行标准化。反应混合物的总体积为10 µL ，并具有1倍浓度的主混合物和基因表达测定 。每个反应使用5 ng cDNA（从总RNA转换）
。在FACS分类细胞的情况下
，使用了2 µL 1.5倍稀释的cDNA，该cDNA大致转化为每384孔板的60个细胞 ，假设RNA分离过程中材料的回收率为100％
，而cDNA合成效率为100％。制造商的指示使用了Taqman Gene表达主混合物的热循环程序 。 　　为了估计注射位点或FACS分类细胞中TENT5A和TENT5C的相对表达，以及HEK293T中的mRNA-1273和带有不同疫苗的A549细胞中的mRNA-1273水平 ，我们使用了铂金SYBR sybr sybr sybr green qpcr supermix-udg（Invitrogen
，11733046）的一般协议，以实现ABI的ISTROUNTION ISTROUNTION ISTROUNTION ISTROUNSTER
。 　　对于所有QRT – PCR分析 ，使用了QuantStudio 5实时PCR系统，384-WELL（Applied Biosystems
，A28140）。 　　引物爆炸算法用于在小鼠转录组（RefSeq mRNA）中找到mRNA-1273的独特扩增子 。在扩增的区域内，选择了15个最佳的GC含量（53.3％）作为探针杂交的目标位点。我们选择了FAM DYE和MGB-NFQ Quencher作为5' ，并为探针进行了3'修饰
。该探测是由Thermo Fisher Scientific Custom Taqman探针服务合成的。为了测试设计测定法的特异性和灵敏度
，我们进行了一个连续稀释实验，在该实验中 ，我们用50 ng的DNG MRNA-1273刺激了500 ng的DNALED小鼠总RNA
，并进行了cDNA合成 。然后，我们用相同浓度的未刺激的小鼠cDNA进行了10×连续稀释液
。QRT – PCR分析表明 ，该设计的测定是特异性的
，可以检测到总RNA多达10 Ag的mRNA-1273，这相当于大约25个分子。同样 ，我们制备了一个标准曲线
，具有10×mRNA-1273的10倍连续稀释液，以估计FACS获得的细胞中疫苗的绝对浓度 。使用Agilent高灵敏度RNA胶带确定cDNA合成前疫苗的浓度
。将五个纳米疫苗的疫苗添加到500 ng酵母总RNA中 ，并合成cDNA。最终样品体积为200 µL 。接下来，我们使用2.5 ng µl -1浓度的酵母cDNA进行了八个系列稀释液（10×）
。每个浓度的CT值都用作绘制指数曲线的数据点
，我们使用该方程将CT值转换为mRNA-1273的分子，假设其分子质量为1321.81 kDa。接下来 ，将计算出的分子数量标准化为384孔板中的细胞数量（从用于cDNA合成的洗脱体的％翻译
，假设在排序和RNA分离过程中100％恢复细胞以及cDNA合成效率） 。 　　与ER应激相关的基因的相对表达，我们评估了CHOP（也称为DDIT3） ，GRP94（HSP90B1）
，PERK（EIF2AK3）和XBP1 mRNA剪接mRNA-1273-转染的HMDMS中的HMDMS（使用野生型和Tent5a敲低），使用Platinum sybr sybr sybr qud Qpcr Suppermix）Suppermixs Suppermix）（遵循制造商推荐的ABI仪器的一般协议
。将每个样品的基因表达标准化为ACTB。 　　补充表12中列出了引物和探针序列 。 　　为了检查mRNA-1273的3'-UTR和末端序列 ，将RNA从疫苗样品小瓶中新鲜分离。然后
，将1 µg疫苗mRNA连接到20 pmol ra3_7n适配器：5 rapp/ctgacnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnntggaattctcgggtgccaagg/3ddc/3ddc，在20 u fishsase 7中（NEB ，M0204S）
，用T4 KQ2227 RNA Ligase 1（NEB，M0204S）的T4 KQ2227 RNA Ligase 1的10 u（t4 KQ22271×T4 RNA连接酶反应缓冲液（NEB ，M0204S），1 mM ATP和20％PEG8000在25°C的总反应量为20 µl 4 h中4小时
。将连接酶在65°C下灭活20分钟。根据制造商的协议
，用0.8×kapa纯珠的连接产物用0.8倍的kapa纯珠纯化，并用15 µL无RNase水洗脱 。对清洁的连接产品进行了40 pmol Illumina索引适配器的逆转录：5'-CAAGCAGAAGAGACGGCATACGAGAGAGAGAGATATCAGTATCAGTGTGTGACTGAGTGAGTCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCGAGAATTCCA-3'18080093） ，0.25毫米DNTP混合物
，5 mm DTT和20 U RNase（Thermo Fisher Scientific，10777019）
。将反应混合在45°C下孵育1小时 ，并在热环生中孵育20分钟。用1×的kapa纯珠清洁逆转录产物
，并用19 µL无RNase水洗脱 。在1：3的比例中稀释准备的cDNA
。在库放大步骤中，将0.5 µl的cDNA与0.4 pmol的基因特异性起动器5'​​-aatgatacggcgacgaccagcagagatccgagatctacgtacgtcagtcagagttccgagtcgagtccgacgacgacgagagagagagagagagagagagagagagagagatcgatcggcggggtg-3' ，0.25'-CAAGCAGAAGAGACGGCATACGAGAT-3'
，0.25 mM DNTP，渗流高保真DNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific ，F530S）
，1倍phusion HF HF Buffer（Thermo Fisher Scientific，f530s ，F530s）和3％DMSO。为了放大，在65°C下使用了标准的涉及程序进行退火和25个周期 。在2.5％琼脂糖凝胶中分离50 µL的PCR产物
。从凝胶中切出450 bp的带
，并用凝胶净化（A＆A Biotechnology，023-50） 根据套件协议。将图书馆用1.0×kapa纯珠的比例清洗了两次 。对样品进行贴皮分析作为质量控制
。该库是在Illumina Novaseq 6000 Sequencer上测序的。 　　从R2读取（包含poly（a）尾巴）的RA37_N适配器序列（castadapt34）（选项-g ccttggcacccgagaattcancantcancantcancantcantcancantcannnnnnnnngtcag –discard -untrimmed） 。然后 ，仅读取包含poly（a）尾巴的读数（选项-a tttttt -discard -drimmed -fasta）。使用Fastx_Reverse_complement从FastX工具包（0.0.13）中对获得的序列进行反向补充
，并使用BioStrings软件包加载到R中
。为了摆脱不需要的修剪手工艺品，选择了长度在0到10之间的序列 ，在每个序列以进行可视化目的之前
，粘贴了四个字母（代表poly（a）尾巴），而代表mRNA-1273末端的核苷酸组成的序列logo logogogo package则产生。 　　对于体外翻译 ，使用了网状裂解物IVT试剂盒（Invitrogen
，AM1200M） 。使用生产者建议的默认缓冲区组装反应
。翻译混合物（ - MET）用未标记的蛋氨酸补充为50μm。在每个反应中，使用1μg或3μg纯化的盖盖RNA作为模板 。反应进行180分钟
。使用ELISA在反应混合物中检测到尖峰蛋白。 　　来自一组双链DNA片段的IVT是IVT 。在两个连续的PCR反应中制备转录模板
。首先 ，使用RLUC_F1/R1特异性引物放大了来自PRL5Box质粒的Renilla荧光素酶的所需片段
，该引物包含第二轮PCR中使用的所有引物的悬垂性（补充表12）。PCR产物通过凝胶电泳验证 。正确的扩增子与RLUC_T7_F2底漆在第二个PCR反应中用作模板，与RLUC_F1的悬垂序列杂交 ，并包含T7启动子，然后向后启动rluc_ax_r2
，从rluc_r1 oligo and priend of a priend（a priend）tail a partect（a priend）tail a a partect（a）tail a a partecte a a partection（均为prient）（一个）tail a a partect a a a partect（a）
。通过凝胶电泳评估并纯化所得的PCR产物。在37°C的50 µL反应体积中，在包含600 pmol T7模板 ，10 µL的5×转录缓冲液（200 mM Tris-HCl
，30 mm mgcl2，30 mm mgcl2 ，10 mm bermidine和50 mm nacl）
，5 µl rntp rntp（20mmmm rntp rntp）（20mmmm rntp rntp）（20mmmmmmmmmmgcl2）中，在37°C下进行体外转录反应1.5 h 。1％Triton X-100 、80 U核糖酶抑制剂和100 U T7 RNA聚合酶。然后 ，在接下来的15分钟内
，用涡轮DNase（Ambion）除去DNA模板
。峰值rNA被提取苯酚 - 氯仿，沉淀 ，通过变性电泳
，纯化在RNA纯化珠上，并用作DRS运行中的对照。在每个DRS运行中 ，包括代表RNA的尖峰ins的混合物，其中包括定义长度（10 A
，15 A，15 A ，30 A
，45 A，60 A ，60 A
，90 A和120 A）的尾巴 。 　　EGFP和记者mRNA分别是质粒模板和双链DNA片段的IVT
。编制EGFP mRNA转录的模板如下：高rscu eGfp32 cds从Invitrogen购买，并使用Bigeasy-TSA有能力的细菌（Lucigen）克隆到质粒载体Pjazz（Lucigen）中φ6.5（taatacgactcactataggg）。将质粒在聚（A）尾末端（NEB PAQCI）上消化 ，并经过验证
，可以通过琼脂糖凝胶电泳完全消化 。通过缓冲酚 - 氯仿提取和乙醇沉淀纯化DNA模板
。在PCR反应中制备用于记者mRNA的转录模板（补充注释6和扩展数据图8a，b） ，如下：恶性疟原虫的全长CDSS骨化cdsporozoite（CS）蛋白（PFCSP_3D7; pfcsp_3d7; ncbi参考序列：xp_001351122.1; ov exte;https://www.trilinkbiotech.com/）和Zika病毒蛋白E（Zikve; NCBI参考序列：MRNA-1273或BNT162B2的UTRS）使用Geneart Service（Thermo fisheart Service（Thermo Fisherific）合成
，YP_002790881.1）与MRNA-1273或BNT162B2的UTR合成。对于OVA和Zikve构建体，添加了N末端ER信号肽序列（MFVFLVLLPLVSSSQCV） 。使用Benchling（https://www.benchling.com/）中的软件 ，对所有CDS进行了优化，用于在鼠标单元中表达
。使用与UTR互补的引物在5'端引入RNA T7启动子φ6.5（Taatacgactcactatagggg）的dNA
，并在5'端引入RNA T7启动子φ6.5（Taatacgactcactataggg），而mRNA-1273或pfizer bnt162b2或带有或不带有或不带有或不带有tctag pentag pentag pentag pentage pertectear（pfizer bnt162b2）的py（a）尾巴。在OVA DNA的情况下 ，如上所述对PCR放大了一组
，但带有T7启动子序列的底漆，可以有效地进行共转录RNA限值（Taatacgactcactataagg） 。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳验证 ，并用KAPA纯珠（KAPA Biosystems）纯化
。 　　The composition of the in vitro transcription reaction was: 40–80 ng µl−1 of DNA template, transcription buffer (40 mM Tris-HCl, 26 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 2 mM spermidine and 10 mM DTT), T7 RNA polymerase36 (0.04 µg µl−1, in-house prepared), 5 mM ATP/CTP (Thermo Fisher科学）
，5 mMN1meψTP（Advent Bio）或UTP（Thermo Fisher Scientific）和4 mM GTP（就EGFP和OVA记者的mRNA而言，打算用于共转录封盖； Thermo Fisher Scientific）或5 mm GTP（对于所有其他Repororter Mrnas Mrnas Mrnas Mrnas; Thermo fisherific; Thermo fishericific;对反应混合物补充了1 U µl -1核糖RNase抑制剂（Thermo Fisher Scientific） ，0.002 U µl -1无机焦距磷酸酶（Thermo Fisher Scientific）（Thermo Fisher Scientifitific）
，而对于EGFP和OVA记者的MRNA，用于cotrancripational cap7 capligy cappig capep capep trinuctience trinuctience trinucm trinucm trinucm trincime ，（内部准备）。在37°C下进行120分钟的反应 。根据制造商的协议
，使用0.2 mL Gopure柱使用Poros Oligo（DT）25亲和力树脂（Thermo Fisher Scientific）使用0.2 mL Gopure柱对体外转录产物进行了验证，并使用0.2 mL Gopure柱进行FPLC纯化。使用UV吸光度测量确定纯化的mRNA的浓度
。RNA制剂的纯度和完整性通过自动电泳系统（Tapestation 2200 ，Agilent Technologies;扩展数据图8C）确定。然后，根据制造商的协议
，使用制造商的VECE，使用制造商的VCE ，使用制造商的VECE
，将使用vercinia封盖系统（NEB）和CAP 2'-O-O-甲基转移酶（NEB）和CAP 2'-O-O-甲基转移酶（NEB）和CAP 2'-O-O-甲基转移酶（NEB）提供CAP1，然后将记者RNA（EGFP和Cotranscription盖上的OVA除外）与制造商的VCE一起使用制造商的内置套房 ，则使用CAP1提供 。用KAPA Pure Beads（KAPA生物系统）纯化了限制的mRNA
。通过自动电泳确定mRNA制剂的纯度和完整性（挂接2200
，Agilent Technologies；扩展数据图7d）。 　　在65°C的20 u RNase Out（10777019，Thermo Fisher Scientific）存在下 ，将两微克从mRNA-1273疫苗样品中分离出的RNA在65°C下进行了变性3分钟
，并立即放在冰上 。用0.5 mM ITP（三磷酸肌苷），1×NEB 2.0缓冲液（B7002 ，NEB）和2 U poly（U）聚合酶（M0337S
，NEB）在37°C下用37°C进行45分钟，并通过snap-frieligregogen终止
。在Kapa Pure Beads（7983298001 ，Roche）上以1×比率清洁I-Tailed RNA，并用于DRS库的准备。I-Tailed样品需要连接特殊的适配器RTA_C10
，该适配器在3'端包含10个细胞：5'-GAGGCGCGGCGGTCAATTTCCTA AGAGCAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3' 。为了使I-tailing特定的RTA适配器，我们遵循了ONT直接RNA测序 - 序列特定的协议；将0.5 µg的I尾mRNA-1273带到DRS库制备的第一个连接步骤
。如直接RNA测序（ONT ，SQK-RNA002）方案中所述进行库制备。 　　如前所述进行DRS 。对于原始疫苗分离株
，最多使用0.5 µg的RNA进行库制备
。对于从细胞培养物或小鼠组织获得的RNA分离株，将3.5-5 µg的总mRNA与50-200 ng的寡聚 - （DT）25富集的mRNA混合在酿酒酵母中 ，标准和预先定义的poly（a）长度
，并与导向rna sequencing semecing kiting kit kit（sqkk-rna002 insur tate sqk-rera）的指示进行了处理。 　　对于cDNA测序，使用cDNA-PCR测序试剂盒（SQK-PCS111）或PCR-CDNA Barcododing Kit（SQK-PCB111.24或SQK-PCB114.24）使用cDNA-PCR测序试剂盒（SQK-PCS111）或PCR-CDNA bar编码试剂盒进行库制备 。用14个循环的PCR反应放大文库 ，并使用Qubit 1×DsDNA高灵敏度试剂盒测量DNA浓度（Invitrogen
，Q33231）。然后，如果多路复用 ，它们会被稀释并平均混合以达到60-100 FMOL的最终浓度
。 　　使用标准的SQK-PCS111方案制备了用于预期的疫苗mRNA的预期样品（例如
，从疫苗注射位点排序的细胞）进行测序的cDNA文库（适用于具有预期疫苗mRNA的预期样品（例如疫苗mRNA）的样品）。合成第一个cDNA链后，在与RTP和SSPII_MOD_2的12周期PCR反应中预先放大了来自逆转录反应的样品（特异于mRNA-1273 ，具有UMI序列，ttttctgtgtgtgctgctgctttvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvttccaccccccccgacaacacccttcgtgagcgg）使用longamp Hot start taq Master Mix Mix 。然后将反应产物纯化在Kappa珠上
，用SFB缓冲液洗涤，用H2O洗脱 ，并用于随后与条形码引物的PCR反应
，根据SQK-PCB111-24方案（14个周期，5分钟 ，扩增）进行
。最后
，用Qubit测量cDNA浓度，并将12个包含约60 ng cDNA的文库与RAPT适配器结扎并进行了测序。 　　使用R9.4（用于DRS和V.11 DNA化学）或R10.4（对于V.14 DNA化学）流动细胞（ONT）以及流细胞启动试剂盒（Exp-FLP002）进行测序 。在DRS的情况下 ，使用Guppy（ONT）或在cDNA测序的情况下使用Dorado（ONT）对原始数据进行了基础
。原始测序数据（FAST5或POD5文件）沉积在欧洲核苷酸档案中（ENA
，Project Prjeb53190；补充表13）。 　　Basecalled nanopore reads were mapped to the respective transcriptome references (Gencode 26 or Gencode 38 for mouse and human samples, respectively) using Minimap2 2.17 with options -k 14 -ax map-ont –secondary=no, and processed with Samtools 1.9 to filter out supplementary alignments and read mapping to reverse strand (Samtools view -b -F 2320).使用Nanopolish 0.13.2 Polya函数估算每个读取的poly（a）尾部长度23 。 　　为了分析mRNA-1273渗透读数，对（补充注释2）进行了纳米波尔polya算法（补充注释2）至（1）包括未绘制的读取 ，可以分析SDTW识别的读数的poly（a）长度的分析（补充注释1）和（2）在3'''''tail tail tail tail tail tail（a）上（补充注释1）和（2）尾声（2）
。 　　For the analysis of BNT162b2-originating reads, the nanopolish polya algorithm was modified analogously (Supplementary Note 3) to (1) include unmapped reads enabling the analysis of poly(A) lengths for sDTW-identified reads and (2) detect two poly(A) segments interleaved with a 10-nt linker and report their lengths in the output. 　　对于cDNA条形码库（SQK-PCB111-24）
，将原始测序数据用Dorado 0.5.3.3或Dorado 0.7.0进行了基础，并并行映射到相关的参考（带有选项–secondary = no可以排除次要比对）和Poly（a）检测到可选的 - poly-Poly-Poly-Poly-Poly-Poly-Poly-Poly-Poly-a。基本的BAM文件被Dorado Demux取消列出 ，并用Samtools排序 。从pt：i标记（在基本的BAM文件中）使用Python脚本提取每个测序读取的poly（a）长度
。在mRNA-1273样品的情况下，还使用读取序列用于使用正则表达式从基本序列中识别末端五聚体。 　　使用Kruskal – Wallis检验估算每个转录本的P值
，并使用Benjamini – Hochberg方法进行了多次比较 。如果调整后的P值小于0.05，并且对于每种条件至少有20个支持读数 ，则记录本被认为是poly（a）尾部长度的显着变化。 　　使用Star Aligner（v.2.7.6a）39
，将Illumina RNA-Seq读数映射到小鼠参考基因组（GRCM38，ENSEMBL ，发行94）
。读取计数是使用子读包（v.2.0.1）的特征搜索分配给基因的。多模型和读取重叠多个功能不计算 。纳米孔读数计数源自纳米波利亚polya输出文件
，用于分析poly（a）尾部长度
。总结了为每个基因分配的读数，并获得了计数进行后续分析。 　　使用deseq2（v.1.22）生物导体软件包40进行差异表达分析 ，并使用时间顺序实验的数据进行了可能性比率测试 。通过WALD测试计算每个时间点的成对比较
，使用APEGLM方法缩小了log折叠变化值
。使用Ward.D方法和每个基因的Z量表表达值将具有相似表达模式的基因与分层聚类聚类。使用ComplexHeatMap软件包绘制热图41 。G：使用profiler42或clusterProfiler进行基因本体论（GO）富集分析
。Genes were assigned as immune response genes (Fig. 4c and Supplementary Tables 6 and 7) if they were annotated to GO (Biological Process) terms GO:0140374, GO:0090714, GO:0034340, GO:0034341, GO:0034342, GO:0045087 or GO:0035455. 　　使用CORDON（https://github.com/bioinfohr/cordon）和Cubar（https://github.com/mt1022/cubar）r软件包分析密码子的使用指标。为了计算密码子适应指数，提供了基于先前研究7的500个高表达基因的参考集 。为了计算有效数量的密码子 ，使用脊椎动物上下文中的密码子偏置或偏好
。根据参考序列中每个氨基酸的发生频率确定最佳密码子的频率。比较了GenBank的SARS-COV-2尖峰蛋白参考序列的mRNA疫苗BNT162B2和mRNA-1273（登录：NC_045512.2：21563-25384）
，小鼠内源性转录（蛋白质编码），与GO的术语相关联（例如 ，与eNdreop and eNDRAPS相关联）Tent5a和Tent5c，根据先前的研究7选择
，以及用于OVA，PFCSP和Zikve的IVT报告序列 。使用BioConductor和GenRCA稀有密码子分析工具（https://www.genscript.com/tools/rare-codon-analysis）获得的功能评估GC含量和其他序列特征 ，将鼠标作为宿主有机体和kazusa数据库作为密码子用法参考。用GGPLOT2可视化分析的结果
。 　　没有使用统计方法来预先确定样本量。除非另有说明
，否则使用R环境或PRISM 6软件的两个或多个生物独立实验重复的数据进行统计分析 。图中提供了每个实例中使用的统计测试
。 　　如图传说中所示，从poly（a）尾部长度分析的数据显示为散点点图 ，并显示了各个数据点。Poly（A）长度的中值显示在带有Poly（a）尾巴的mRNA种群的图（作为水平条和数字值）上（即
，在mRNA-1273，OVA ，OVA
，PFCSP和ZIKVE记者的情况下，没有末端五聚体 ，或者在BNT bnt162b2的所有读物中）平均值将是偏差的
，因为poly（a）长度不遵循正态分布 。图表明读取的读数分数（蓝色阴影）或缩短（红色阴影）的尾巴
。估计分类阈值（降苯基化和重新丙烯基化）是从粗疫苗RNA（在mRNA-1273的情况下使用Pentamer）的值分别接近0.2和0.8分位数。对于DRS数据，mRNA-1273和BNT162B2的mRNA-1273和125和125设置为85和115 。对于使用Dorado进行的cDNA测序分析 ，通常给出poly（A）尾部长度的较短估计值，MRNA-1273尾巴的阈值设置为80和110
，而BNT162B2尾巴的阈值为50和50和80（分析是在没有其他分段的情况下进行的，因此据报道了最后一个聚（A）段的长度）
。 　　除了mRNA-1273对A549细胞和生存力测定的mRNA-1273处理外 ，大多数实验至少重复了两次
，从而导致了可比的结果。分析中排除了组织收集，细胞隔离 ，处理或数据收集过程中具有明显技术故障的样本 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得
。