具有N末端HA信号序列的野生型Mususus µOR（6-398），然后是标记标签和C末端8×His tag的标签 ，将其克隆在PfastBAC1载体中。通过将突变51 C13S
，C22S，C43S ，C57S
，C170T，C346A和C351L引入Mutation51 C13S和C351L来创建最小的半胱氨酸构建体（µORΔ7） 。基于µORΔ7构建体 ，生成了双层半胱氨酸突变突变构建体（R182C/R276C）
，用于鹿，µor支治 7（T180C/R276C）和µOR支治 7（R182C/R273C））
。在先前的协议13之后对µOR表示并纯化 ，并进行了一些修改。µOR在SF9昆虫细胞（表达系统，由供应商身份验证
，未针对支原体测试）中使用，使用10 µM纳洛酮的BAC-to-BAC杆状病毒系统 。感染后48小时收集细胞 ，并在10 mM Tris pH 7.5 、1 mM EDTA
，100 µM TCEP，10 µM纳洛酮 ，160 µg ml -1苯甲酰胺和2.5 µg ml -1 lipeptin中裂解
。The receptor was extracted from the Sf9 membrane using buffer of 20 mM HEPES pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.7% N-dodecyl-β--maltoside (DDM), 0.3% CHAPS, 0.03% cholesteryl hemisuccinate (CHS), 30% (v/v) glycerol, 5 mM imidazole, 2 mM MgCl2,160 µg mL -1苯甲酰胺
，2.5 µg ml -1亮肽素，10 µm纳洛酮 ，100 µM TCEP和2 µL苯并酶在冷室中持续1小时。离心后
，将Ni-NTA树脂添加到500 mL离心管（康宁）中的上清液中，并在4°C下旋转2小时 。用20 mm HEPES pH 7.5
、500 mM NaCl ，0.1％DDM
，0.03％CHAP，0.03％CHS ，5 mM咪唑和10 µM奈洛唑和蛋白质在250 mmmmmmmmmm的洗涤缓冲液中洗脱，将Ni-NTA树脂用批次洗涤为20 mM HEPES pH 7.5、500 mM NaCl
，0.1％DDM，0.03％CHAP ，0.03％CHS
，5 mM咪商和10 µM纳洛酮
。ni-nta洗脱液中补充了2 mM CaCl2，并将其加载到抗flag M1树脂（Millipore-Sigma）上 ，以进一步纯化。通过逐渐增加交换缓冲液的比例（20 mm HEPES pH 7.5
，100 mm NaCl，0.5 lmng ，0.5 lmng
，0.05％CHS，2 mM CaCl2和10 µm naloxone） ，将洗涤剂交换为LMNG 。 在室温下添加了2 mM CaCl2的Ni-NTA洗涤缓冲液1小时。最终用20 mM HEPES pH 7.5 、100 mM NaCl
，0.01％LMNG，0.001％CHS ，5 mM EDTA，0.2 mg ML -1 FLAG肽和10 µM纳洛酮洗脱µOR
。使用4-ML 100-KDA截止浓度器（Amicon Ultra）浓缩后
，使用SD200增加10/300列（GE Healthcare），用SEC缓冲液平衡的SEC缓冲液（20 mm HEPES pH 7.5 ，100 mm nacl
，0.0mm NACL，0.01％LMNG ，0.MNG
，0.MNG，0.001％chs and sec heper cons ulta）进一步纯化µOR。收集含有单体µOR的馏分 ，并用500 µl 100 kDa截止浓度器（Amicon Ultra）浓缩 。µOR补充了15％（v/v）甘油
，并在液氮中冷冻
。 　　将人GαI1的DNA克隆到PfastBac1载体中。用N端6×HIS TAG和HRV 3C蛋白酶裂解位点（LEVLFQGP）和Gγ2的人Gβ1的DNA和HRV 3C蛋白酶裂解位点和Gγ2分别克隆到pH和P10的启动子下的PfastBac对载体中 。按照µOR的相同方案产生了GαI1和Gβ1γ2的P2病毒
。GI1异三聚体在HI5细胞（表达系统，由供应商身份验证 ，未用于支原体测试）中
，用4 ml P2的GαI1和10 mL P2的Gβ1γ2的Gβ1γ2在每升细胞中达到300万毫升的密度时。感染后48小时收集细胞，并保持在-80°C的冰箱中 ，直到使用为止 。 　　在裂解缓冲液（10 mM Tris pH 7.5
、1 mM MGCL2、5mMβ-甲醇（β-ME），10 µM GDP
，160 µg ML-1苯甲酰胺，2.5 µg ml-1 leupeptin）中解冻细胞颗粒
。After centrifugation, pellets were solubilized in solubilization buffer (20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl, 1% sodium cholate, 0.05% LMNG, 5 mM MgCl2, 20 mM imidazole, 5 mM β-ME, 10 µM GDP, 160 µg ml−1 benzamidine, 2.5 µg ml−1 leupeptin)并在冷房间中搅拌1小时。在14,000 rpm离心20分钟后 ，将上清液与Ni-NTA树脂混合
，并在4°C旋转1小时 。然后用溶解缓冲液在批处理中洗涤Ni-NTA树脂
。通过在室温下逐渐升高LMNG浓度，将洗涤剂交换为Ni-NTA色谱柱上的LMNG。用洗脱缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5 、50 mM NaCl ，0.01％LMNG
，2 mM MGCL2
、5 mMβ-ME，10 µM GDP ，180 mM咪唑）洗脱蛋白 。他的标签被1:50（w/w）HRC 3 C蛋白酶裂解。将GI1用5 µL的λ蛋白磷酸酶处理
，并针对透析缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5，50 mm NaCl ，0.01％LMNG
，2 mM MGCL2，2 mM MGCL2 ，2 mm MMNCL2，5 mmβ-me
，5mmβ-me，10 µm gdp）倒入4°C的均为4°C cover emove
。通过将GI1加载到2-ML Ni-NTA树脂上 ，可以去除他的标签和污染物。将Ni-NTA树脂的流通液加载到Monoq柱上
，并通过阴离子交换进一步纯化GI1 。收集并浓缩GI1杂体峰
。在补充15％甘油后，GI1冻结了 ，并保持在-80°C的冰箱中。对于鹿样品
，将离子交换纯化的GI1进一步注射到SD200增加的10/300柱（GE Healthcare）中，用SEC缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5 ，100 mm NaCl
，0.01％NaCl，0.01％LMNG ，2 mM MGCL2和10 µM GDP） 。将SEC分数汇总
，浓缩至336 µm，并冷冻
。 　　用6倍他的标签克隆到pfastBac1矢量的人类GRK5 DNA。按照µOR的相同方案生成P2病毒 。GRK5在带有25 mL P2病毒的SF9昆虫细胞中表达 ，并在感染后48小时收集
。在冰上或4°C上进行GRK5的纯化。Cells were lysed in lysis buffer (20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 20 mM imidazole, 5 mM β-ME, 160 µg ml−1 benzamidine, 2.5 µg ml−1 leupeptin) by sonication on ice.通过以14,000 rpm离心去除细胞碎片20分钟 。使用WASH缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5，150 mM NaCl
，20 mM咪唑，5 mMβ-ME）通过Ni-NTA树脂纯化上清液中的GRK5
。将蛋白质在补充160 mM咪唑的洗涤缓冲液中洗脱。将GRK5浓缩并注入SD200增加的10/300柱中 ，用冷室中冷缓冲液（20毫米HEPES pH 7.5
，300 mm NaCl）平衡 。将GRK5的SEC分数汇总，浓缩和闪光冷冻。 　　为了研究在存在β-arrestin-1的情况下µOR的构象变化 ，将C末端截短的β-arrestin-1用于SMFRET和鹿测量
。人类
，不含半胱氨酸的长时间剪接变体（C59V/C125S/C140L/C150V/C242V/C251V/C269S），被themed的β-arrestin-1（1-382）（1-382）（βarr1（ΔCt））（βarr1（∆ct））52 pet 1 and tern terminal 6-terminal 6 c and terminal interial in-terminal 6×3 c cc and cotter and cc cotter and Hissinal and Hers and verter verter and cc cot verBL21（DE3）合格的细胞。将大肠杆菌细胞在用100 µg ml -1氨苄青霉素的结核病培养基中培养 ，直到OD600在220 rpm的振荡器中在37°C下达到1.2 。温度降低至18°C
，并用200 µM IPTG诱导蛋白质表达16小时
。在冰上或4°C上进行βarr1（∆CT）的纯化。收集细胞并在补充160 µg ML -1苯甲胺和2.5 µg mL -1亮肽的160 µg mL -1苯甲胺和2.5 µg ml -1苯甲胺和2.5 µg ml -1苯甲酰胺中，在补充的缓冲液1（20 mM Tris 8.0（25°C） ，300 mM NaCl
，20 mM）中收集细胞 。离心后，将上清液中的蛋白质与Ni-NTA树脂在4°C下孵育1小时
。将Ni-NTA树脂用缓冲液1广泛洗涤 ，然后用3列体积的缓冲液2（20 mm Tris 8.0（25°C），50 mM NaCl和20 mM咪唑）洗涤。用补充160 mM咪唑的缓冲液2对βarr1（∆CT）洗脱 。将βArr1（∆CT）加载到源15Q 4.6/100 PE阴离子交换柱（GE Healthcare）上
。用2柱体积的缓冲液A（20 mM Tris 8.0（25°C）
，50 mM NaCl）洗涤该柱，并用15列的线性梯度从0到30％缓冲液B（20 mm Tris 8.0（25°C） ，1 M NACL）洗脱βarr1（∆CT）。将峰值分数合并
，并补充NaCl至终浓度为300 mm，从而阻止蛋白在接下来的步骤中浓缩至高浓度时沉淀 。将蛋白质浓缩 ，并在SD200增加10/300柱中
，用20 mm HEPES pH 7.5，300 mm NaCl平衡的蛋白
。对于鹿样品 ，在D2O中进行SEC缓冲液
，然后将βArr1（∆CT）浓缩至986 µM并冷冻。 　　按照标准µOR纯化方案纯化µOR，除了在抗FLAG M1树脂和SEC纯化程序上用10 µm Damgo代替纳洛酮 。在DAMGO存在下纯化的4 µm µM µM ∆7（R182C/R276C）在20毫米HEPES pH 7.5、35 mm NaCl ，5 mm MGCL2
，100 µM TCEP，20 µmmmmgcl2 ，20 µmmmmmgcl2中孵育1,2-二十烷酰基-SN-甘油-3-磷酸 - （1'-Myo-Inositol-4'，5'-双磷酸）（C8-PIP2）
，0.01％LMNG，0.001％CHS ，CHS和100 µM DAMGO在室温下1 h。然后将ATP和GRK5添加到最终浓度为1 mm和0.8 µm的反应中
，并在加入更多GRK5之前孵育1小时
。每1小时总共添加GRK5，总共将反应保持在室温下。 　　为了评估磷酸化水平 ，并确保使用离子交换色谱法完成完成
，将12 µL的磷酸化反应在不同的时间点上含有约50 µpololes的磷酸化反应去除，并使用20 mm Tris pH 8.0（25°C） ，50 mm nacl
，0.0mn，0.01％g ，将其稀释至200 µl
，并将其稀释至200 µl纳洛酮 。然后将样品注射到Monoq（5/50）阴离子交换柱（GE Healthcare）中，用20 mm Tris 8.0（25°C） ，50 mM NaCl，0.01％LMNG和10 µM NALOXONE平衡的缓冲液A平衡
。用1列的缓冲液A洗涤柱
，然后用40列的线性梯度从0到40％缓冲液B的20 mm Tris 8.0（25°C），1 M NaCl ，1 M NaCl
，0.01％LMNG和10 µM NALOXONE在室温下。通过荧光检测器（Shimadzu）以280 nm的激发和340 nm的发射监测蛋白质洗脱（扩展数据图12a） 。 　　与GRK5孵育4小时后，将反应用20 mM HEPES pH 7.5 、100 mM NaCl ，0.01％LMNG
，0.001％CHS，2 mM CaCl2和10 µM纳洛酮稀释到3毫升M1 M1 M1树脂之前 ，将反应稀释
。在室温下用30 mL洗涤缓冲液洗涤M1树脂30分钟。最终使用20 mM HEPES pH 7.5、100 mM NaCl
，10 µM纳洛酮，5 mM EDTA和0.2 mg ML -1 FLAG肽的洗脱缓冲液洗脱µOR 。浓度后 ，将µOR进一步注射到SD200增加10/300柱上
，用20 mM HEPES pH 7.5，100 mM NaCl ，0.01％LMNG，0.001％CH和10 µM Naloxone平衡的SEC缓冲液平衡
。收集含有单体µOR的馏分
，并用500 µl 100 kDa截止浓度器（Amicon Ultra）浓缩。µOR补充了15％（v/v）甘油，并在液氮中冷冻 。 　　在先前的方案30之后 ，合成了碘乙酰胺偶联的CY3和CY5荧光团
。简而言之
，将1 µmol的磺基苯胺3 NHS酯或磺基苯胺5 NHS酯（Lumiprobe）溶解在500μL干二甲基亚硫氧化二甲基硫氧化二甲基（DMSO）中。然后在室温下将其滴入500μL的干燥DMSO中的50μl尸体溶液中 。将反应溶液在室温下搅拌5分钟，然后在乙酸乙酯中倒入15毫升5％甲酸。收集沉淀物 ，并使用10 mM乙酸三乙酯pH 7.0水缓冲液（溶剂A）用100％乙腈（溶剂B）作为移动相纯化沉淀物
。使用旋转蒸发器将产品分数干燥。然后将所得的纯荧光团 - 杜鹃盐化合物溶解在1 mL干燥的DMSO中 。将N
，N-二异丙甲胺（100μL）添加到该溶液中，然后是1 mg碘乙酸NHS酯
。将反应溶液在室温下搅拌15分钟 ，然后倒入15 ml乙酸乙酯中。收集沉淀物并通过高性能液相色谱纯化 。 　　将Bromo衍生物53（261 mg
，1.0 mmol）（HO-559）溶解在丙酮（20 mL）和NAI（300 mg，2 mmol）中
。将反应混合物回流1小时 ，然后蒸发。将残基溶解在乙酸乙酯/二乙基醚（50:50
，20 mL）中，并用盐水（2×10 mL）洗涤 。将有机相干燥（MGSO4） ，过滤，蒸发并用闪光色谱（己烷：二乙基乙醚）纯化
，产生230 mg（74％）的黄色晶体；熔点：132–134°C；保留因子（RF）= 0.4（己烷：乙酸乙酯2：1）;C10H15INO2（MW：308.1）C：38.98计算的元素分析；H：4.91;N：4.55％；测量：C：39.02;H：4.78;N：4.61％；IR（CM -1）：1665，1615;MS（EI ，M/Z
，％）：308（8），294（6） ，278（6）
，151（100），136（8） ，109（52）
，43（61）
。 　　用Boetius微熔点设备测量熔点。红外（IR）光谱是使用Bruker Alpha FT-IR仪器获得的，并在钻石板上具有衰减的总反射率支撑 。质谱记录在电子电离（EI）模式（70 eV）的Shimadzu GCMS-2020光谱仪上
。元素分析是在Fisons EA 1110 CHNS仪器上进行的。在默克Kieselgel 60（0.040-0.063毫米）列上进行闪存柱色谱法 。定性薄层色谱法（TLC）在涂有默克凯塞尔吉尔（Merck Kieselgel）的市售板（20 cm×20 cm×0.02 cm）上进行。 　　在TM4和TM6上使用半胱氨酸突变的最小cysteine µOR ，即µor支治 7（T180C/R276C）和µOR支治 7（R182C/R273C）
，由商业含量的硫化硫酸-Cy3和Sulfo-Cy3和Sulfo-Cy7（lumipipe）标记碘乙酰胺偶联的CY3和CY5分别
。在20 µL标记缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5，100 mM NaCl ，0.01％LMNG，0.001％CHS
，10 µM NALOXONE）中，将SEC纯化的µOR稀释至10 µm。将30 µM的供体荧光团和60 µM的受体荧光团添加到反应中 。在20°C孵育30分钟后 ，将游离染料用10毫米半胱氨酸淬灭
。然后将反应加载到装有2 ml G50树脂（Sigma）的自制的拆卸柱上
，该树脂（Sigma）用DeSalt Buffer（20 mM HEPES pH 7.5，100 mM NaCl ，0.01％LMNG
，0.001％，0.001％CHS ，15％甘油）。合并含有µOR的分数
，等分并冷冻 。µOR的浓度约为500 nm
。 　　为了单独或与G蛋白进行鹿的样品进行鹿研究，在标记缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5 ，100 mm NaCl
，0.01％Lmng，0.001％lmng ，0.001％CHS，10 µM）中
，将SEC纯化的µOR支治（R182C/R276C）稀释至20 µm，将其稀释至20 µm。将氮氧化物自旋标记试剂HO-1427添加到最终浓度为400 µm 。在室温下孵育3小时后 ，将反应用5 mM半胱氨酸淬灭
，并将其注入SD200增加10/300柱，用SEC缓冲液平衡（20 mM HEPES pH 7.5 ，100 mm NaCl
，NACL，0.01％LMNG ，0.001％LMNG
，0.001％CHS，2 mm Cacl2 in D2O中）
。将单分散峰的分数合并 ，并平均分为十1.5毫升管。将蛋白质用SEC缓冲液稀释四倍 。对于纳洛酮
，TRV130，PZM21 ，MP，丁丙诺啡和吗啡的终浓度为1 mm
，将配体添加到每个管中，Damgo为400 µm ，lofentanil的200 µm和BU72的500 µm
。一根蛋白质的管子没有配体。将µOR和配体在室温下孵育2小时 。将每个管中的蛋白质浓缩并分成两个部分
，其中一部分与20％（v/v）D8-甘油混合，转移到毛细管中 ，然后冷冻。另一部分与超过三倍的GI1混合
，该磨牙在D2O缓冲液中纯化，并在室温下孵育30分钟
。1：100 apyrase（v/v ，neb）被添加到G蛋白样品中以去除游离GDP并在室温下孵育1小时。然后将G蛋白样品与20％（v/v）D8-甘油混合
，并转移至毛细血管并冷冻 。 　　为了使鹿研究中的样品与βarr1（∆CT）进行复合物，按照上述类似的协议 ，将µORPΔ7（R182C/R276C）标记为HO-1427
。将SEC分数合并并平均分为10×1.5 ml管。用D2O稀释缓冲液稀释该蛋白
，为20 mM HEPES pH 7.5
、100 mM NaCl，0.01％LMNG ，0.001％CHS，5 µM C8-PIP2
，以及在最终浓度下各个配体，如上所述 。将µOR与配体在室温下孵育2小时
。然后将蛋白质浓缩 ，与D2O缓冲液中的四倍摩尔过量的βarr1（∆CT）混合
，并在室温下孵育1小时。然后将样品与20％（v/v）D8-甘油混合，转移到毛细血管并冷冻 。 　　所有SMFRET实验均按照先前的协议在25°C下进行 ，并进行了一些修改54
。简而言之
，基于带有EMCCD摄像头（Andor Ixon ultra 897）的尼康Eclipse Ti-E，对自制的客观型TIRFM显微镜进行了单分子FRET研究 ，并进行了532 nm的固体激发激励激光（Coherent Inc. Obis Smart Lasers）。通过显微镜收集探针的荧光发射
，并通过干扰二分法（T635LPXR，Chroma）和带通滤波器（ET585/65 M（Chroma ，cy3）和ET700/75 M（Chroma
，cy5）（Chroma，cy5） ，在双视率光谱闪光灯（PhotoMetrictics）中，通过干扰二分法（T635LPXR
，Chroma）和带通滤波器分离 。在双视光谱分离器中，没有带有带通滤波器用于CY7
。该硬件受到控制 ，并使用Cell Vision软件（北京凉爽技术）收集SMFRET电影。 　　通过生物素化的M1 Fab和链霉亲和素将µOR固定在盖玻片上 。简而言之
，将已清洗和用生物素聚丙烯甘氨酸清洗和钝化的组装玻璃室与20 mM HEPES 7.5，100 mM NaCl一起与0.05 mg ML-1链霉亲和素一起孵育。一分钟后 ，在孵育缓冲液中
，将未结合的链霉亲和素用25 nm生物素化的M1 Fab（50 mm HEPES pH 7.5，100 mm NaCl ，0.01％LMNG
，0.001％CHS，2 mm Cacl2 ，5 mm Cacl2
，5 mm mgcl2和100 µm Ligigand）洗净
。将生物素化的M1 Fab在通道中孵育一分钟，并通过孵育缓冲液洗涤未结合的M1 Fab。将N末端标记的荧光团标记的µOR稀释至约20 nm的孵育缓冲液 ，并在测量前在冰上孵育1小时 。将µOR稀释至约1 nm，并注入腔室
。通过成像缓冲液（温育缓冲液 + 50 nm prodocatechute-3,4-二氧酶（PCD）
，2.5 mm prodocatechuic（PCA），1.5 mm衰老的小葡萄糖 ，1 mm 4-硝基苯甲酸醇（NBA）
，1 mm CycococtateRrae（cot））。使用细胞视觉软件以10 s -1的帧速率拍摄电影 。为了在与无GDP的GI1进行复合物中测量，在100 µM配体存在下 ，将20 nm µOR与20 µM GI1孵育30分钟
，然后再添加1：100（v/v，neb）apyrase
。在冰上孵育1小时后 ，将复合物稀释并注入腔室
，并按照上面的相同方案进行测量。为了在GI1和GDP的存在下进行测量，将表面成像的µOR与成像缓冲液一起孵育 ，然后将20 µM GI1孵育
，并将各种浓度的GDP在成像缓冲液中注入室内并成像 。为了在存在βARR1（∆CT）的情况下进行测量，将磷酸化的 ，Cy3/Cy5标记的µOR稀释至约20 nm，在停滞蛋白缓冲液中（50 mm HEPES pH 7.5
，100 mm NaCl，NACL ，0.01％LMNG
，0.01％LMNG，0.001％CHS ，0.001％CHS
，2 mm Cacl2，5mmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm lig cl.添加了C8-PIP2）和90 µMβArr1（∆CT）
。在冰上孵育1小时后 ， 用βArr1（∆CT）以90 µm的最终浓度将µOR稀释至1 nm。固定后
，将未结合的µOR用补充90 µMβarr1（∆ct）的成像缓冲液洗净，并拍摄电影 。 　　为了提取单分子荧光的时间轨迹 ，通过开发为ImageJ插件（http://rsb.info.nih.gov/ij）开发的定制软件程序来分析收集的电影
。荧光斑点是通过九像素区域内的2D高斯函数拟合的
，使用hough transform55的变体匹配供体和受体斑点。背景减去2D高斯峰的总体积用作原始荧光强度I 。 　　实际的FRET效率是通过方程计算的，其中ID是供体的原始荧光强度 ，IA是受体的原始荧光强度，χ是供体发射到受体通道中的串扰。γ解释了供体和受体之间的量子产率和检测效率的差异
，并计算为受体光漂白56（γ=ΔIA/ΔID）对受体强度（ΔIA）变化的变化比率
。χ为0.05，对于Cy3/cy5和Cy3/cy7染料对 ，γ分别为1和0.2。通过基于三个标准的定制MATLAB脚本挑选了FRET痕迹57：（1）TRANCE的信噪比
，该比率分别为Cy3/cy5和Cy3/cy7 dye Pairs，该tr曲线被定义为摄影前的总强度的平均值 ，分别为4和3；（2）供体痕迹具有单步光漂白；（3）迹线持续至少2 s 。为了计算G蛋白和GDP存在的过渡速率
，仅选择了至少显示一个高/低点转变的痕迹，并通过隐藏的基于马尔可夫模型的软件（Hammy）44选择并分析
。Hammy确定了两个粮食状态。每个条件的高-FRET停留时间的累积频率计数均在原始软件中拟合到单个指数衰减曲线 ，从而产生高-FRET停留时间 。每个条件的低点停留时间的累积频率计数均安装在原始软件中
，以双向指数衰减曲线和低点停留时间相应地计算为加权平均值
。 　　Four pulse, Q-band DEER data were collected at 50 K on a Bruker e580 equipped with a QT-II resonator and a 150 W TWT amplifier using the pulse sequence: π/2(νA) – τ1 – π(νA) – (τ1 + t) – π(νB) – (τ2 − t) – π(νA) – τ2 – echo, withτ1= 300 ns，τ2=3.5μs ，ΔT= 16 ns
，16步循环和重复时间为510μs。观察者脉冲（νa）分别为π/2和π脉冲设置为18 ns和36 ns，并在共振下施加了70 MHz 。100 ns泵浦脉冲（νb）应用于共振上 ，由任意波形发生器产生的50 MHz线性CHIRP脉冲组成
。我们此外使用了8步ESEEM抑制协议。所有实验均使用XEPR v2.6b.163实施 。 　　通过使用Deerlab工具箱（V.0.9.2）58在MATLAB（V.2019b）中实现的高斯混合模型（GMM）处理鹿数据
。简而言之，同时分析了所有30个数据集（仅10×配体
，10×配体+GI，10×配体+β-Arr） ，假设其平均位置和宽度（全球拟合参数）的两到七个高斯人的可变数量在20-100Å
，以及2-20Å，以及2-20Å ，以及2-20Å
，以及范围内。对于每个单独的条件，将种群（本地拟合参数）的总和归一化为1 。允许每个数据集中的每个数据集中的每个数据集中的每个数据集中一个独特的调制深度（范围0.3-0.7） ，并且每个传感器条件允许在25-150μm的范围内具有唯一的受体浓度。基于模型的距离分布和背景校正的偶极核是使用迪埃拉布函数计算的
，并使用FitParamodel.m例程同时拟合到所有30个数据集（Multistart = 10）
。使用AKAIKE信息标准（AICC）和更限制的贝叶斯信息标准（BIC）进行了事后模型选择，这些标准（BIC）都在所有鹿数据集进行全球评估 ，并且都作为大多数帕斯蒂姆模型进行了6个高斯人。对所有拟合参数
，偶极拟合和参数距离分布进行了使用1,000个引导程序迭代的错误分析，并在95％的置信度下进行了评估 。不同的传感器条件之间的大量种群变化是通过分离的95％置信区间确定的 ，并用 *（星）标记
。 　　作为对照，我们还使用deerlab和longdistances中的Tikhonov正则化（TR）和基于模型的分析分析了所有鹿数据（v.946; http://www.biochemistry.ucla.ucla.edu/faculty/faculty/hubbell/hubbell/software.html）。正则化或平滑度参数分别通过AICC和L-Curve标准确定 。两种分析的结果都是可叠加的
。为了进行比较
，在扩展数据中显示了从基于模型的（6个高斯）最佳拟合和无模型的鹿lab拟合中得出的距离分布。两种方法都产生了几乎相同的距离分布，并揭示了所有配体或传感器依赖的距离变化 ，这些变化支持了基于模型拟合的有效性 。最明显的差异出现在35-45-Å距离范围内
，基于模型的分析能够区分两个峰，即39Å和43Å ，具有不同的宽度
，即3.8Å和2Å
。这一发现体现了与Tikhonov正则化或无模型分析相比，全局 ，基于GMM的拟合方法的固有优势之一。尽管Tikhonov正则化或基于模型的分析将单个正则化或平滑度参数应用于整个距离范围
，但所选的GMM允许单个距离峰的不同宽度，因为它们可能存在于不同的构象状态 。基于模型的方法的其他优点包括对每个总体（高斯区域）的直接量化以及使用基于协方差矩阵或基于自举的方法对每个拟合参数进行严格的误差分析
。 　　我们对纳洛酮和Lofentanil进行了生物学重复 ，并没有G蛋白。这些条件代表了研究的配体/换能器条件
，我们观察到良好的可重复性 。特别是，对于两个配体 ，较小的GI诱导的移位均准确再现（扩展数据图8D）。 　　表达µOR的SF9细胞的膜用于饱和结合和竞争结合
。饱和结合是通过将SF9膜与增加浓度的拮抗剂[3H]二肾上腺启了（3H-DPN，Perkin Elmer）在室温下在含有0.5 mL的结合缓冲液中
，含有50 mM Tris-HCl pH 7.5，100 mm NaCl ，0.1％BSA的拮抗剂[3H]二肾上腺吗啡（3H]二肾上腺）进行2小时。通过在结合反应中添加10 µM纳洛酮来测量3H-DPN的非特异性结合 。为了分开未结合的3H-DPN
，在GF/B Brandel滤波器上迅速过滤结合反应
。然后将过滤器用5 ml冰冷的结合缓冲液洗涤3次。放射性是通过液体闪烁计数来测定的 。 　　对于与3H-DPN结合的竞争，将SF9细胞膜与2.9 nm 3H-DPN一起孵育 ，并在0.5 mL的结合缓冲液中浓度增加DAMGO
。在室温下将结合反应孵育2小时。通过快速过滤借助48孔收割机（Brandel）将自由配体通过快速过滤到GF/B Brandel过滤器中 。放射性是通过液体闪烁计数来测定的
。 　　使用Prism 9.0（GraphPad软件）分析了所得数据。通过将饱和数据拟合到一个站点（总和非特异性结合）模型中
，计算出3H-DPN的解离常数（KD） 。Damgo的Ki是通过将竞争结合数据拟合到一个站点（fit Ki）模型中来计算的
。 　　对于与[3H]纳洛酮结合的竞争，将上述制备的含小鼠µORμOR虫细胞膜稀释 ，以使野生型（1：1,000）（1：1,000）和最小cyspyeline小鼠µOR（1：100）在20 mM HEPES pH 7.4
，100 mm NaCl和0.05％BSA中归一化。然后将膜与3 nm [3H]纳洛酮一起孵育，并在其各自的最终浓度下串行脱光的正骨配体 。将测试的配体稀释到上方的缓冲液中 ，最终浓度为100 µm
，以四倍的连续稀释系列，以10个总浓度。唯一的例外是BU72 ，在相同的连续稀释之前，它将其稀释至1.3 µm终浓度
。所有配体都均包括独立的“无配体”对照（100％结合）和过量的冷纳洛酮（200 µM）对照（0％结合）
，以归一化点。在室温下摇动混合物1小时，然后收集到Filtermat B（Perkin Elmer） ，并用冷结合缓冲液（20 mm HEPES pH 7.4
，100 mm NaCl）洗涤 。然后将过滤器在60°C下干燥，然后再添加一张Multilex B/HS融化闪烁板（Perkin Elmer） ，并在Microbeta Counter（Perkin Elmer）上读取
。如上所述绘制并标准化四倍的数据值。 　　基于BRET的测定法基于Trupath59和逮捕信号48 。为了测量µOR与GI1的耦合
，将HEK 293个T细胞（由供应商认证的ATCC CRL-3216（ATCC CRL-3216）在10 cm的菜肴中铺上了10 cm的菜肴，每盘3-4百万个细胞在dulbecco的每盘3-4百万个细胞中 ，在Dulbecco的Modgle's Mediam Medimed（Dmem）中（DMEM）补充10％FBS中
。第二天
，将细胞培养基替换为新鲜的DMEM+10％FBS培养基。使用1：1：1：1的受体DNA比：Gα-RLUC8：Gβ1：Gγ2-GFP2（每构建体500 ng），将细胞转染2小时 。在Optimem（Gibco-thermofisher）中以每µg DNA的比率为3 µl Trantit的比率为3 µl Transit（Gibco-Thermofisher） ，以每µL Optimem的浓度为10 ng DNA
。第二天
，使用Versene（0.1 M PBS+0.5 mm EDTA，pH 7.4）从板上收集细胞 ，并在200 µL培养基中的50,000个细胞（DMEM+1％diallysed fbs fbs fbs fbs）中以50,000个细胞的密度为50,000个细胞，以50,000个细胞的密度为50,000个细胞。第二天
，将白色背景（Perkin Elmer）应用于板的底部，并仔细抽吸了生长培养基 ，并用60 µL的测定缓冲液（1×Hank的平衡盐溶液（1×HBSS
，Gibco），20 mM Hepes ，pH 7.4）替换为5 µm（final listeration）coelenties coelenties coelentere nan nan nan nan nan nan nan nan nan nan nan nan nan imie（ph 7.4）
，pH 7.4 pH 7.4） 。在5分钟平衡周期后，用在测定缓冲液中制备的30 µL药物（3×）处理细胞 ，持续5分钟
。然后在LB940 MITHRAS读板读取器（Berthold Technologies）中读取板
，该板的整合时间为1 s。串行四次读取板，并在所有分析中使用了第四个读取的测量值 。将BRET比率计算为GFP2发射与RLUC8发射的比率。 　　为了测量µOR耦合与β-arrestin-1的耦合 ，除了：HEK 293 T细胞以1：5的比例与µOR-RLUC8和VENUS-β-β-arrestin-1中共转染Bret-G蛋白测定法中的过程大多相似
。在添加测试药物之前
，将白色背景（Perkin Elmer）应用于板底部，并仔细抽吸生长培养基 ，并用60 µL的测定缓冲液（1×HBSS，20 mM HEPES
，pH 7.4）替换，并补充了5 µm（终最终浓度）（在测定液中浓度）Coelenterenterazine Hananolozine hananololties nananolight技术。在5分钟平衡周期后 ，用在测定缓冲液中制备的30 µL药物（3×）处理细胞
，持续5分钟 。然后在LB940 MITHRAS读板读取器（Berthold Technologies）中读取板，该板的整合时间为1 s ，含量为485 nm（RLUC8-Coelenterazine H）和530 nm（Venus）发射过滤器
，以每孔1 s的速度
。串行四次读取板，并在所有分析中使用了第四个读取的测量值。将BRET比率计算为金星发射与RLUC8发射的比率 。使用非线性回归和PRISM 9（GraphPad）中的非线性回归和剂量反应刺激方程绘制了来自G蛋白或抑制蛋白分析的BRET比率
。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。