补充表6中提供了分析的海绵及其收集位点的清单。将样品分别放入塑料袋中并带到表面 。收集后 ，立即将海绵组织切成碎片
，并在可运输的液氮冰柜（巴哈马收集）或70％的乙醇中存储在-80°C下
。 　　为了制备富集的细菌馏分，使用了先前论文改编的协议14。从新鲜收集的T. swinhoei中 ，除去了500克海绵的薄红色纤维体层 。其余部分被切成小块
，被其他动物清洗，并在国家MJ-C28榨汁机中加工
。将液体和固体残留物转移到2-L的2-L渐变圆柱体中 ，并用无CA和无MG的人造海水（CMF ASW）调节体积为1.5 l。将混合物在室温下孵育15分钟，同时每2分钟搅拌一次以分离海绵细胞
，然后不受干扰地再搅拌10分钟以允许颗粒沉降 。将上清液倒入另一个渐变的圆柱体中，将CMF ASW添加到残基中 ，最终体积为1.5升
，然后是第二个解离和沉降周期。通过32μmnitex网格通过收集的上清液，并以1000g离心10分钟到丝状细胞
。随后将上清液以4500g离心至颗粒细胞细菌。将每个细菌分数用200 mL CMF ASW洗涤一次 ，再次沉淀在200 mL CMF ASW中
，并在4°C下储存 。 　　在排序之前，使用BD Facsaria II细胞分系仪（BD Bioscience）通过流式细胞仪分析了颗粒和上清液的分数
。基于以下大小 ，使用尺寸校准珠（Life Technologies）确定两个馏分内细菌的尺寸分布：1μM
，2μM，4μM ，6μM
，10μM，10μM和15μM（Life Technologies）。相应地稀释用于排序的样品 ，并以每秒钟的500–1,000事件分析尺寸分布 。使用FACSDIVA软件（BD Bioscience）分析了流动性测定结果
。制备每个孔中含有1μl无核酸酶超纯水的无菌96孔板，并相应地对单细胞或多细胞细丝进行排序。通过在荧光显微镜下观察每条滴来进行成功细胞分选的确认 。将所得的96孔板存储在4°C下
，以进行随后的全基因组扩增（WGA）
。 　　通过在95°C，3分钟的热处理中 ，从细胞分类中获得的单个分离细菌细胞或丝被破坏
，WGA是根据PHI29聚合酶介导的多重位移扩增（MDA）技术使用Illstrivera Genomiphi Genomiphi v2 DNA Amplification Kit（GE Healthcare）进行的。每个井的WGA反应都被优化，并按照制造商的建议以10μl的体积进行 。在MDA时 ，在存储前用无核酸酶的超纯水稀释了每条井十倍
。 　　为了检测16S rRNA基因和生物合成基因簇（ONN
，POY，KON ，NAZ
，CTH，KER和PTS） ，对含有单细胞细菌的MDA扩增基因组DNA的井进行了嵌套的PCR。根据以下条件
，使用高保真原性最大最大DNA聚合酶（TAKARA）（TAKARA）（第一个扩增）和Amplitaq Gold 360主混合物（Applied Biosystems）（第二个扩增）基于以下条件进行了PCR 。首次扩增：98°C，5分钟（初始变性）；98°C ，10 s;54°C，15 s;72°C
，1.5分钟（35个周期）；72°C，7分钟（最终扩展）。第二放大：95°C ，10分钟（初始变性）；98°C
，30 s;59°C，30 s;72°C ，30 s（30个周期）；72°C
，7分钟（最终扩展）
。对于第一个扩增，使用了从十倍删除的MDA样品中的1μl模板 ，并直接从第一个PCR扩增产物中使用0.5μL进行第二次扩增。所有PCR均以25μl的最终体积进行 。嵌套PCR中使用的底漆集总结在补充表10中
。通过琼脂糖凝胶电泳确定扩增子大小
，并通过Sanger测序确认。嵌套的PCR在“ Entothemenella” 16S rRNA基因，ONN和POY GENE簇的“ Entotheonella ”一式三份进行 ，分别在不同的日子 。对于其他生物合成簇
，嵌套的PCR仅进行一次
。为了测试污染细菌的存在，使用16SU27F和16SU27F和16SU1492R引物从MDA扩增的孔中进行扩增 ，其中含有或不含包含单丝细菌的MDA放大孔，并随机选择20个克隆的单丝细菌
，以进行测序。 　　测序是在两个平台上进行的：首先，使用全基因组shot弹枪和3 kb长的配对库 ，均根据制造商的说明制备
，并使用钛化学测序；其次，使用nextera（震中生物技术）全基因组shot弹枪配对端和8-kb的伴侣库库 。后者是使用混合方案在8 kb长的配对库构造的最后一步中用Illumina配对适配器替换454个适配器 ，以制备了混合方案
。所得的库片段是通过凝胶电泳选择的尺寸
，并切除至400 bp。在2×151 bp配对的运行中对该库进行了测序，并为8-kb Mate Pair库进行了2×251 bp的运行 。在组装之前 ，连接了8-kb Mate-pair库的读对
，不包括在重叠区域中没有完美匹配的所有读取
。在454个长的配对端接头上分开了连接的对，不包括所有读取 ，没有完美的匹配
，并且对两个结果的读数进行了反向补充，以模拟大型插入Sanger读取。另外 ，通过PACBIO测序（GATC）和Sanger测序（IIT）获得了序列信息 。然后使用Newbler（v2.6）de Novo Assembler组装所有读取，以FastQ格式提供了非GS-FLX读取
，除了将30 BP作为最小重叠匹配外，还使用默认参数进行汇编。TSY1和TSY2基因组的重叠数分别为1,774和3,270
。使用R2CAT49进行同步分析。使用快速注释和子系统技术（RAST）进行自动注释44 。天然产物生物合成基因簇的手动鉴定和注释是基于与经过验证的生物合成基因作为查询的相似性搜索（BLAST）
。使用抗生素和次级代谢物分析壳（Antismash）进行天然产物基因簇的其他自动鉴定45。使用自由使用的软件22,45,46确定初步的PK和NRPS域结构和腺苷酸化域特异性 。所有手动注释和常规生物信息学分析均使用Biomatters创建的Geneious版本6.0.6（可从http://www.geneious.com获得）
。使用PCR扩增具有高保真性或Longamp TAQ DNA聚合酶（新英格兰Biolabs）和测序（GATC Biotech）的脚手架间隙。 　　根据制造商的规程 ，从带有快速DNA旋转试剂盒（Q-Biogene）的海绵样品中分离出DNA 。PCR扩增使用Eubacterial 16S rRNA基因特异性引物16SU27F和16SU1492R以前发表
。在以下嵌套PCR中使用两个不同的过程将所得的PCR产物用作模板。首先
，新设计的“ Entotheonella
” 16S rRNA基因特异性引物Ento271F和Ento1290R 。条件：将1 µL DMSO添加到50 µL PCR混合物中
。在95°C下进行初始变性步骤2分钟，然后在95°C下35个循环30 s ，在63°C下退火30 s
，在72°C下伸长1分钟。该程序以72°C的最终伸长步骤完成5分钟 。使用了Dreamtaq聚合酶（Fermentas）。其次，“ Entotheonella”特异性引物Ento238F（参考文献15）和Ento1442r
。条件：在98°C下的初始变性步骤2分钟 ，然后在95°C下35个循环持续10 s
，在55°C下在55°C下退火30 s，在72°C下伸长1.5分钟。使用Takara EX TAQ聚合酶 。使用不同的底漆对增加可检测到的“ Entothelena ” 16S rRNA基因的多样性
。将PCR产物纯化 ，连接到PGEM-T（Promega）中
，并转化为热吸收的大肠杆菌Novablue细胞。使用矢量引物SP6和T7，进行了每个海绵的20个克隆上的集落PCR 。使用酶HAEIII和MSPI对这些PCR产物进行了双重限制消化 ，并测序了每个RFLP（限制性片段长度多态性）模式的一个代表性的插入
。 　　如先前所述，从Thionella swinhoei W1制备了宏基因组DNA。通过电泳在低熔点琼脂糖上进一步纯化粗牙NNA
，然后使用PEQGOLD凝胶提取试剂盒（PEQLAB）进行凝胶提取 。如上所述，由swinhoei W1制备了丝状细胞分数
。使用引物KSDPQQF和KSHGTGR51从总海绵DNA和丝状细胞中扩增酮合酶片段。在25 µl PCR混合物中 ，将大约0.4 µl纯化的海绵宏基因组DNA或0.5 µl冲洗细胞沉淀物用作PCR模板
，该PCR模板还包含2.5 µl 10倍热植物缓冲液（新England Biolabs），每个0.5 µl的10 mm dntps ，25 l.25 ll的25毫米
，1毫米25毫升 。KSDPQQF和KSHGTGR底漆，以及0.25 µL高保真热启动聚合酶（Jena Bioscience GMBH）或0.125 µL TAQ DNA聚合酶高保真度（Invitrogen）
。热周期程序以35个循环设置 ，由以下步骤组成：在105°C下加热
，在95°C下添加2分钟，在95°C下的变性1分钟 ，在不同温度下退火
，在不同温度下（55 、58
、61°C），在74°C下进行1分钟 ，在74°C下进行1分钟，在74°C处于74°C。随后将带有所需尺寸的PCR产物（约700 bp）固定
，并将其连接到Pbluescript II（SK-）（Stratagene）中 。测序携带700 bp插入物的质粒。 　　使用SINA WebAligner53自动将16S rRNA基因序列和参考序列自动与SILVA参考对齐对齐，并合并到Silva版本106数据库54,55中
。然后将对齐方式手动完善。使用长（≥1,200bp）序列在ARB中计算出具有1,000个引导性重新采样和100个带有100个自举重新采样的最大似然树的最大简约树 。使用ARB中的Parsimony Interactive工具添加了短序列 ，而无需更改树拓扑
。 　　对于整个基因组树
，扫描了“ Entotheonella
”变种TSY1和TSY2，以示出细菌和古细菌中存在的38种普遍保守的单拷贝蛋白的同源物。将组件转换为所有六个读取框架 ，并使用从thyoSift（http://phylosift.wordpress.com/）中获得的HMMMER3软件包56中检测到标记基因并与HMMSEarch和Hmmalign对齐 。提取的标记蛋白序列用于构建每个基因组38个标记的串联比对
。系统发育推断方法使用的是最大似然的FastTree2（参考文献57）和最初由Christian Goll和Alexandros Stamatakis提供的自定义RAXML Bootstrap脚本（Heidelberg Theorical Institute for Greationality研究）
，并由D. Jacobsen修改。该脚本需要两个输入文件，即对准格式的对齐文件和由raxml-light58计算的起始树 。脚本工作流程可以简要汇总如下
。第一raxml版本7.3.5（参考文献59）创建了多个序列比对的重复和逐步加法订单parsimony树作为最大似然搜索的起点 ，基于用户定义的速率异质性和替换模型。下一个raxml-light58在每个bootstrap复制上运行 。在所有raxml-light运行完成后
，将产生的重复树进送入raxml中，以计算启动树上绘制的引导程序支持值
。这种方法的主要优点比简单地运行RAXML以顺序执行自举计算的主要优点是 ，可以使用多个raxml-light实例并行评估几个Bootstrap重复。此外
， 对于大规模的系统发育推断，RAXML-Light实现既比RAXML更快 ，更有效，因为它是专门用于在高性能计算环境中使用的
，并且具有有效的检查点和重新启动功能58 。用于自定义RAXML bootstrap脚本的速率异质性和氨基酸进化模型是伽玛和le-gascuel（LG），以及20速率类别的CAT近似值和FastTree2的Jones-Taylor-Thornton（JJT）。我们首先生成了带有FastTree2的系统发育树 ，其中包括2,509个细菌和古细菌分类单元
，以验证“ Entotheonella”在生命树中的位置
。Next we calculated phylogenies (Fasttree2, RAxML script) using a reduced data set of 991 taxa of closely affiliated phyla, including Proteobacteria, Acidobacteria, Nitrospirae, Deferribacteres, Chrysiogenetes, and the recently proposed phyla Aminincenantes and Nitrospinae17,31. 　　KER（KERA5）和CTH（CTHA2）NRPS（非核糖体肽合成酶）基因的腺苷酸 - 域区域是从从Swinhoei y-Filematios y丝状馏分中分离出的基因组DNA中的PCR，该基因使用Phimentos y-Filemation y filemantos biollantity DNA Polymerase（New Indland Biolland biolland biolland biollands）。引物KERA5F和KERA5R用于域KERA5和引物CTHA2F和CTHA2R用于域CTHA2 。将PCR产物连接到载体PGEM-T轻松或pBluescript SK（+）中 ，并转化为大肠杆菌DH5α
，将亚克隆用于PET28B
。根据最近的发现，许多A域与MBTH样蛋白60,61共表达时仅在体外活跃 ，每个HIS标记的腺苷酸化结构域都与KER途径的MBTH样蛋白Kerl共表达。将kerl克隆到共表达矢量PCDF-DUET中 。为了过表达KERA5
，在具有卡纳米霉素（50μgml-1）和链霉素（50μgml-1）选择中，将含有表达质粒的大肠杆菌BL21（DE3）培养为1-L培养物 ，在37°C和250°C的D600 Nm中
，将其生长
。然后将培养物冷却至16°C，然后用IPTG诱导（异丙基β-D-1-硫代乙酰乳糖苷； 1 mm） ，并在16°C和250 R.P.M中生长20 h。通过将表达质粒转化为大肠杆菌BL21-A1并在上面种植克隆，除了在D600 nm达到0.4时添加了0.2％阿拉伯糖
，从而极大地改善了可溶性CTHA2的过表达 。如先前报道的26,62,63，进行了蛋白质纯化和基于质量交换的腺苷酸化测定
。 　　用乙醇 ，甲醇
，丙醇和丙酮提取了Thinella swinhoei和富集的“ Entothemane ”细胞级分的整个海绵样品。将整个海绵提取物和“ entotheonella”提取物进行超出性液相色谱（UPLC）加热电喷雾电离（HESI） - 高分辨率 - 高分辨率质谱法（HRMS）和纳米-LC HESI-HRMS分析，然后进行EMZED47数据分析 。HESI -HRMS数据是在与Dionex Ultimate 3000 UPLC系统的热Q精确耦合上收集的
。为了对“ entotheonela
”和theonella提取物进行标准分析 ，溶剂梯度（a = h20 + 0.1％甲酸甲酸
，b =乙腈 + 0.1％甲酸 + 0.1％甲酸在0-2分钟为5％，在2-14分钟为2-14分钟 ，在14-17 min的流量为0.5 ml min -ml min -ml Min -ml Min -n Minemene n Minemence n n y Min n Minemence n and n Min -Min Min -Min Mineceence Ancomece n mineceence在27°C（A）至30°C（B）下100Å（150×4.6毫米）柱。MS在（a）200–2,500 m/z（质量到电荷比）或（b）分别为100–1,600 m/z的扫描范围内以正电离模式进行操作
，分别在100-1,600 m/z，分辨率为70,000或140,000时 ，以m/z 200的分辨率为70,000或140,000 。为了鉴定使用UPLC设置的多理性酰胺
，以45％N-丙醇为0.5 ml min-1的等值均匀的洗脱，在45°C的现象Kinetex 2.6 µM C18100Å（150×4.6 mm）的现象上使用。MS在扫描范围内以正电离模式运行 ，范围为1,000-6,000 m/z，分辨率为140,000 m/z 200
，喷雾电压设置为3.7 kV，毛细血管温度至320°C
。用于检测异源产生和TCEP（TRIS-（2-羧乙基） - 磷酸）处理的蛋白质蛋白 ，溶剂梯度（a = H20 + 0.1％甲酸
，B =乙腈 + 0.1％甲酸 + 0.1％formic酸在0-2分钟，5％ ，5％的时间为5％
，5-2-95％ - 145％ - 14.5％，95％ - 14.5％ ，Ml min -1）用于Aeris Widepore现象3.6 µm C4200Å柱（50×2.1 mm） 在27°C。MS在扫描范围内以正电离模式运行
，范围为600-2,000 m/z，分辨率为70,000 m/z 200 ，喷雾电压设置为3.7 kV
，毛细血管温度为320°C 。将经碘乙酰胺处理样品的MS实验调节至150-2,000 m/z的扫描范围
。使用电荷状态5-50（1-50（胰蛋白酶消化）中的1-50个（1-50个），使用质量计算的手册2.0.53.5版本的手动XTRAUS XTRAUS XTRACTION功能2.0.53.5版本2.0.53.5用于从光谱中获取蛋白质量 ，将阈值设置为信号为3的噪声，为噪声为3
，3用于检测到的电荷状态的最小数量（2中的最小值），仅为比次估计数量的25％ ，25％
，25％，25％。同位素模式比较的拟合因子设置为80％ ，预期强度误差为3 。在胰蛋白酶消化样品上进行的MS – MS实验以400-1800 m/z的质量范围为24.5、35 、35
、35和45.5
。Targeted MS–MS was applied on the [M+H] ions [1051.8]3+, [1057.8]3+, [1076.54]3+, [1105.73]4+, [1110.0]4+, [1129.0]4+, [1148.0]4+, [1474.0]3+, [1480.0]3+, [1505.0]3+ and[1530.0]在2 m/z的隔离窗口中以70,000的分辨率为m/z 200。MS -MS片段的肽质量是从观察到的[M+ H]+离子（[M+ 2H] 2+的Y37 ION）手动计算的 。此外
，配备有声称的PEPMAP RSLC NANO VIPER色谱柱（2 µm，C18 ，100Å（15 cm×50 µm）与Thermo Q Qualtive一起使用的Thermo Easy-NLC 10001-丙醇 + 0.1％甲酸在10–80％的B中为0-60分钟
，在0.3 mL min-1的流量下为61-95分钟，以鉴定由“ Entothemella”产生的次级代谢物
。 使用MSEXPORT将Thermo RAW文件转换为MZXML文件 ，并与基于Python的开源式弹出框架进行进一步处理47。将处理后的数据与已知的Theonella化合物的列表进行了比较
，并纯化的on nemide，cyclotheonamide和多理性标准标准 。为了生成质谱分子网络25 ，使用了依赖数据的纳米-LC和UPLC高分辨率HESI-MS-MS实验的组合数据集
。使用上述UPLC和纳米LC条件进行色谱分离。随后将每个父离子扫描的前10个最强烈的离子在m/z 200时的分辨率为17,500，归一化碰撞能（NCE）的分辨率为35 。将隔离宽度设置为5 dA
，动态排除为15 s，默认电荷状态为4 ，以启用高分子质量质量质量元素的碎片（例如
，二次质量质量质量元素）。使用MSCLUSTER64合并了相同的光谱以形成共有光谱
。计算每对光谱（光谱比对）的余弦值，并使用MATLAB SCRIPTSSS25,65去除从溶剂对照中获得的光谱。余弦值阈值设置为0.5 ，而一个余弦值表示相同的光谱和0的余弦值显示没有光谱相关 。在Cytoscape66中可视化了所得网络
。通过与T. swinhoei的二级代谢产物的数据库进行比较
，通过比较进行了共识光谱。 　　使用swinhoei y-y-FiDelity DNA聚合酶（新England Biolabs）从T. swinhoei y-FiDelity DNA的基因组DNA（新的England Biolabs）中，从基因组DNA（新的England biolabs）中从基因组DNA中得到PCR降低了基因组DNA的假定硝酸水合物样酶的前体基因 ，并使用PET28B（Merck（Merck）（Merck）primer14-frienter-prienter-frentire-frentire-frentiare primerers1_14-f（10） 。将所得的构建体用NCOI/Hindiii消化
，并将其连接到Petdueti（Merck）中，从而产生N-HIS标记的前体肽表达构建PMH124
。使用引物LANTH-TSY1_14-F和LANTH-TSY1_14-R放大了从TSY1_14的假定LANM样linthionine合成酶基因 ，并将其克隆到PCDFDUETI中
，以获得未被拆卸的修饰修饰酶表达构建pMH104。为了进行功能分析，将PMH124单独转化为大肠杆菌BL21（DE3） ，并与PMH104共转化 。将表达培养物（100 mL）用1 ml的过夜培养物接种，并在250 r.p.m处在16°C下孵育
。与IPTG诱导后的5天。通过离心（3,220g 10分钟）收集细胞
，并在液氮中冷冻的沉淀 。通过在裂解缓冲液（50 mM磷酸钾，pH 8.0 ，300 mm NaCl
，20 mM咪唑，10％（V/V）甘油）中进行超声处理 ，将细胞裂解
，并将上午孵育300 µL Protino Ni-Nta ni-Nta树脂（Macherey Nagel）（Macherey Nagel）（Macherey Nagel）供4 Hat At At Rocking rocking rocking
。Resin was pelleted at 850g (20 min, 4°C) and applied to a Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad), washed with 5 ml lysis buffer, 5 ml wash buffer (50 mM potassium phosphate, pH 8.0, 300 mM NaCl, 40 mM imidazole, 10% (v/v) glycerol), and eluted with three 500-µl fractions of elution缓冲液（50 mM磷酸钾，pH 8.0 ，300 mm NaCl
，250 mm咪唑，10％（v/v）甘油）。将洗脱级分调为152 µm的蛋白浓度（2 µg µl-1 ，通过Roti-Nanoquant修饰的Bradford Assay（Carl Roth））和Tris（2-羧乙基）磷酸（TCEP）盐酸（Sigma Life Science
，Sigma Life Science，Bioultra）测量 在100倍摩尔多余的地方添加以减少二硫键的形成 。在25°C下孵育30分钟后 ，如上所述对样品进行UPLC HESI -HRMS分析。为了确定游离硫醇和推定的灯笼桥的数量，将对照和修饰的肽用碘乙酰胺衍生化
。简而言之
，将肽脱盐（Vivaspin，5 kDa Mwco ，Sartorius）
，其体积为100毫米碳酸氢铵（pH 7.86），并调节至1 µg µl -1（76 µm）。用9 mM TCEP和0.09％SDS治疗（在25°C下为25分钟） ，在25°C下没有光线30分钟的情况下
，将样品用16 mM碘乙酰氨酰胺（Sigma Life Science，Bioultra）处理 ，并通过UPLC Hesi-HRMS进行分析 。在HRMS分析之前
，将测序级胰蛋白酶（Promega）添加到其余部分：胰蛋白酶：蛋白质比为1:25，并在37°C下孵育2小时
。