在GitHub（https://github.com/jbloomlab/sarsr-cov_homolog_survey/tree/tree/master/master/master/rbd_asr，https：//github.com/jbloomlab/sars.com/jbloomlab/sars/rbd_asr ，https://github.com/jbloomlab/sars.com/rbd_asr
，https://github.com/jbloomlab/rbd_asr，https://github.com/jbloomlab/rbd_asr一下） ，提供了生物信息学分析的所有步骤。 　　组装了一系列独特的SARBECOVIRUS RBD序列
，其中包含在参考文献中策划的RBD序列 。7，参考文献中报道的SARS-COV-1人和CIVET菌株中的所有独特的RBD序列
。30, and recently reported sarbecoviruses BtKY72 (ref. 13), RaTG13 (ref. 2) GD-Pangolin-CoV (consensus RBD sequence reported in figure 3a of ref. 23) and GX-Pangolin-CoV23 (P2V, ambiguous nucleotide in codon 515 (SARS-CoV-2 numbering) was resolved to retain amino acid Phe515, which is conserved across all其他SARBECOVIRASE）。We also incorporated newly described sarbecovirus sequences RsYN04 (ref. 15), PDF-2370 and PRD-0038 (ref. 19), Khosta-1 and Khosta-2 (ref. 32), RhGB01 (ref. 47), RshSTT182 (ref. 25) and Rc-o319 (ref. 24) into updated phylogenies and functional work after the initiation of our研究（图4和扩展数据图10） 。Hibecovirus序列HP-Betacov/Zhejiang2013（GenBank：KF636752）用于植根SARBECOVIRUS系统发育
。对于扩展数据图2。1和10a – d ，生根中包括其他betacoronavirus外组 。在GitHub（https://github.com/jbloomlab/sarsr-cov_homolog_survey/blob/master/master/rbd_asr/rbd_asr/rbd_accessions.csv ）
，所有病毒名称，物种和位置以及序列登录或引用序列或引用
。 　　通过MAFFT（V.7.471）52对齐氨基酸序列 ，间隙开口惩罚为4.5。根据我们针对SARS-COV-2（Wuhan-Hu-1 GenBank：MN908947，残基ASN331 – THR531）定义的域边界
，将RBD序列从尖峰排列中取下 。使用PAL2NAL（V.14）53构建核苷酸比对。使用RAXML（V.8.2.12）54推断系统发育，使用LG+γ替代模型用于氨基酸序列比对或GTR+γ ，以及用于核苷酸序列比对的第一
，第二和第三密码子位置的单独数据分区
。指定特定进化枝关系（但进化枝内的自由拓扑）的约束文件用于修复扩展数据中的特定拓扑图6A（RBD进化枝1a，1b和2之间的替代关系）和图4A（单属欧洲和非洲RBD RBD进化枝；扩展数据的扩展数据图10A –D）。RBD基因段被用作我们的主要边界 ，用于由于较宽的尖峰排列中存在频繁的重组19,20
，因此，由于存在频繁的重组 ，因此将其用于系统发育推断和祖先序列重建 。1920
。 　　使用FASTML（v.3.11）55使用氨基酸序列对齐
，RAXML的最大似然核苷酸树拓扑，LG+γ取代矩阵 ，分支长度和FastML基于可能的IndeL恢复模型。最大a在感兴趣节点处的后验祖先序列是从边际重建确定的
，为每个对齐位点的氨基酸的串，后验概率最高 ，并根据indel the Indel重建的删除进行了审查 。为了测试祖先表型对重建祖先状态的统计不确定性的鲁棒性，我们还构建了“ Alt ”祖先
，在这些祖先中，同时引入了所有后验概率> 0.2的所有第二多种状态38
。 　　为了确定RBD对齐中潜在的重组断点 ，我们使用了GARD（v.0.2）56
，它确定了可能的重组断点（扩展数据图6C），该断点（图6C）产生了两个比对段 ，表现出系统发生不一致
，并具有足够的整体可能性增长，足以证明对系统的重复（用于流质参数的重复）。为了确定这种可能的重组对祖先序列重建的影响 ，在提议的断点处将比对分为单独的段 。如上所述
，推断出系统发育，并在单独的片段上重建祖先序列 ，并在每个片段的匹配节点处重建的祖先序列被串联
，如扩展数据图6E所示
。 　　编码所有73个独特现存和祖先RBD氨基酸序列的基因是从Twist Bioscience，Genscript和IDT中订购的。基因序列是在GitHub（https://github.com/jbloomlab/sarsr-cov_homolog_survey/blob/master/rbd_asr/parsr/parsed_sepences/rbd_secorence_sepence_sepence_sepence_sepence_sepence_sepence_set_nantotated.csv）上提供的 。如先前所述 ，将基因批量克隆到PETCON酵母表面播放载体（质粒2649）中
。12。如先前出版物中所述，RBD编码序列下游的PCR随机N16条形码 。将RBD序列合并并在两个独立处理的重复下进行条形码。将汇集的条形码父母RBD文库电穿孔到大肠杆菌中
，并以约22,000个菌落形成的单位估计瓶颈，估计在每个库中每个库中的每个亲属RBD估计约300个条形码
。 　　同时 ，我们将位点饱和诱变库克隆了六个位置在某些RBD背景中的位置。目标位置对应于SARS-COV-2位置455、486 、493
、494、498和501 。在GitHub上提供了针对每个背景的RBD索引位置（https://github.com/jbloomlab/sarsr-cov_homolog_survey/blob/master/rbd_asr/parsr/parsed_sepences/rbd_secorence_sepence_sepence_sepence_set_set_annotated.csv）
。精确位点饱和诱变池是通过Genscript产生的
，作为质粒文库。在GenScript诱变库中的失败位置（SARS-COV-1 Urbani中的所有六个位置，SARS-COV-2中的位置494位 ，RATG13和GD-Pangolin中的位置494
，位置为455），或者使用PCR Interess（BTKY72）进行了nn nn nn nn weperration shousely tewe shouse teprantie te nn shouse tew shouse te nn te nn shouse tepers shouse teceens in nn te nn shouse tepers s in nn shouse shousesess选择的背景或背景 。诱变的碎片
。重复的是 ，将突变库合并
，并从RBD编码序列下游附加N16条形码。将合并的条形码突变库电穿孔到大肠杆菌中，并将其镀在目标瓶颈上 ，对应于每个库中每个突变体平均每个突变体的平均值 。 　　从瓶颈转化板上刮除了菌落
，并纯化质粒
。将父母的RBD和突变池以与预期条形码多样性相对应的比率组合在一起，从而产生了在高通量实验中使用的两个条形码的文库重复。根据先前描述的方案58 ，将质粒文库转化为酵母（Awy101菌株57），以10×比例转化了10 µg质粒 。 　　如先前所述
，PACBIO测序用于获取跨越N16条形码和RBD编码序列的长序列读取
。通过Noti消化和凝胶纯化从文库质粒池制备PACBIO测序构建体，然后进行SMRTBELL结扎。使用20小时的视频收集时间 ，在PACBIO续集上的三个SMRT单元格中对每个库进行了测序 。使用CCS程序（v.5.0.0）从子读中生成PACBIO圆形共识序列（CCSS）
，需要99.9％的精度，至少3个通过。所得的CCS可在NCBI序列读取存档（SRA） ，BioSample SAMN18316101上获得
。 　　使用AlignParse（V.0.1.6）59处理CCS
，以识别RBD目标序列，调用任何突变并确定相关的N16条形码序列 ，需要从预期的目标序列中进行18个核苷酸突变
，这是预期的16-核苷酸长度序列的预期16-核苷酸长度序列，不超过3个匹配的序列均超过3层序列。 　　接下来 ，我们使用处理的CCSS将每个条形码链接到关联的RBD序列 。我们首先用CCS确定的精度过滤序列 <99.99% or indels. The empirical sequencing accuracy estimated by comparing RBD variants associated with barcode sequences sampled across multiple CCSs (https://jbloomlab.github.io/alignparse/alignparse.consensus.html#alignparse.consensus.empirical_accuracy) was 99.0% and 98.4% in libraries 1 and 2, respectively. For barcodes sampled across multiple CCSs, we derived consensus RBD variant sequences, discarding barcodes of which CCSs with identical barcodes exhibited >1点突变或> 2个indels
，或> 10％或> 25％的CCS具有相同的条形码，分别包含次级非共识突变或indel
。CCS处理管道可在GitHub（https://github.com/jbloomlab/sarsr-cov_homolog_survey/blob/master/master/results/summary/summary/process_ccs.md）上获得。最终的条形码视频查找表将每个N16条形码与其关联的RBD序列链接起来 ，可在GitHub（https://github.com/jbloomlab/jbloomlab/sarsr-cov_homolog_survey/blob/blob/master/master/master/results/variants/nunucleotide_varariant_varariant_varariant_toble..c）中获得 。 　　购买或从商业来源购买或生产的酵母菌结合测定法的重组二聚体ACE2蛋白
。重组人ACE2（UNIPROT：Q9BYF1-1）购自Acrobiosystems（AC2-H82E6），由18-740的残基组成
，涵盖了固有的二聚化结构域，其后是其标签和用于下游检测的AVITAG。CIVET（Paguma larvata）Ace2（Uniprot：Q56NL1-1）购自Acrobiosystems（AC2-P5248） ，由18-740的残基组成
，涵盖了固有的二聚化域，并带有N末端 ，他的标签用于下游检测 。小鼠（mus musculus）ACE2（Uniprot：Q8R0I0-1）购自中苏生物学（50249-m03h）
，由18-740的残基组成，涵盖了固有的二聚化域 ，随后是他的标签和人类IgG1 FC域
，用于下游检测
。 　　Genscript产生了酵母 - 播种结合测定法的其余ACE2S（图4扩展数据）。具体而言，PANGOLIN（Manis Javanica ，GenBank：XP_017505746.1）
，R 。Affinis787（GenBank：QMQ39222），R
。FACRINIS9479（GenBank：QMQ39227） ，R.Sinbank 3364（Genbank 3364（Genbank：QMQ39292929219）和R. sinicus：R.QMQ39216）ACE2残基19–615用C末端人IgG1 Fc结构域克隆，用于二聚和下游检测。将表达质粒转染到HD 293F细胞中以进行蛋白质表达 。ACE2-FC融合蛋白从第六天的培养上清液中通过FC-TAG亲和力纯化纯化。 　　在SD-CAA培养基（6.7 g L-1酵母氮基碱
，5.0 g-1 casamino casamino-sids，2.13 g l-1 Mes和2％（w/v）右旋糖 ，pH 5.3）中
，转化的酵母库等分试样在30°C的振荡器中生长过夜
。To induce RBD expression, yeast was washed and resuspended in SG-CAA + 0.1% D medium (6.7 g l−1 yeast nitrogen base, 5.0 g l−1 casamino acids, 2.13 g l−1 MES, 2% (w/v) galactose and 0.1% (w/v) dextrose, pH 5.3) at an initial optical density at 600 nm (OD600) of 0.67, and在室温下孵育16-18小时，轻度搅拌。 　　对于每个库 ，用PBS-BSA（0.2 mg ML-1）将45个OD600诱导的培养物洗涤两次
，RBD表面表达用1：100稀释的FITC结合FITC结合的FITC结合的C-MYC TAG标记，将其标记在PBS-BSA中将标记的细胞洗涤两次 ，并重悬于PBS中以进行FACS分析 。 　　使用FACSDIVA软件（V.8.0.2）在BD FACSARIA II系统上进行了酵母库分类实验
。对于RBD表达水平的高通量测量值
，单个细胞将细胞门控（扩展数据图2B），并将其分配为4个FITC荧光（扩展数据图2C） ，其中bin 1捕获了99％的未固定细胞
，垃圾箱2-4将剩余的文库分为tertiles。将细胞用1％BSA的1 mL SD-CAA预润湿5 mL管 。我们在4个垃圾箱中每个库中恢复了约800万个单元
。在新鲜的SD-CAA中，将分类的细胞重悬于每毫升的2×106细胞中 ，用1：100青霉素 - 链霉菌素重悬于30°C的一夜之间。从术后酵母样品中纯化质粒 <4 × 107 cells per miniprep column using the Zymo Yeast Miniprep II kit (D2004) according to the manufacturer’s instructions, with the addition of an extended (>2 H）酶溶酶处理和细胞裂解前的-80°C冻结周期 。如前所述，从每个质粒等分试样从每个质粒等分试样扩增N16条形码12
，并提交给Illumina Hiseq 50 bp单端测序
。 　　为了丰富用于下游滴定实验的RBD变体，我们还使用RBD+（FITC+）bin对每个库进行了大约2×107个单元格（扩展数据图2B）。将RBD+富集的种群重悬于每毫升1×106个细胞中 ，以进行过夜的生长
，并在9个OD600等分试样以-80°C冷冻，以进行随后的滴定实验 。 　　在第一组实验后添加的突变体（RADG13和GD-PONGOLIN的位置455处的突变 ，BTKY72中的所有六个位置的突变）并不富集RBD+富集
，并且不是Bulk表达式测量的一部分，但与RBD+ -Enriched Timers is in sub in subseq sequalies conterration in s s s s s s s s sereq测量
。 　　对于ACE2结合亲和力的高通量测量值 ，如上所述
，诱导了RBD表达的酵母库。将诱导的培养物以每个滴定样品为8 OD600等分，并用PBS-BSA洗涤两次 。将细胞重悬于1×10-6 m的ACE2浓度中 ，以1 m的间隔和0 M ACE2浓度在1 m的间隔内重悬于1×10-13 m。将样品在室温下温度轻度搅拌过夜
。The samples were washed twice in ice-cold PBS-BSA, and resuspended in 1 ml secondary label (1:100 Myc-FITC and 1:200 PE-conjugated streptavidin (Thermo Fisher Scientific, S866) for human ACE2, 1:200 iFluor647-conjugated mouse anti-His (Genscript, A01802) for civet ACE2 and 1:200PE结合的山羊抗人IgG（Jackson Immunoresearch Labs 109-115-098）用于所有其他FC标记的ACE2配体）
，并在冰上孵育1小时。将细胞用PBS-BSA洗涤两次，并重悬于PBS中以进行FACS分析 。 　　将滴定样品用于表达单个RBD的细胞（扩展数据图2B） ，然后根据ACE2结合将其划分为四个垃圾箱（扩展数据图2D）
。在每个浓度下，在4个垃圾箱中收集至少5×106的细胞。将分选的细胞重悬于1 ml SD-CAA中
，用1：100青霉素 - 链霉素重悬，并在深孔板中在30°C下过夜 。根据制造商的说明 ，使用Zymo酵母96孔微型REPREP试剂盒（D2005）纯化了来自每个人群的质粒等分试样
，并在静止裂解之前添加了延长（> 2 h）Zymolyase处理（> 2 h）Zymolysolase处理和-80°C冻结循环
。如前所述，从每个质粒等分试样从每个质粒等分试样扩增N16条形码12 ，并提交给Illumina Hiseq 50 bp单端测序。 　　对于第一组实验后添加的突变体池（Ratg13和GD-Pangolin的位置455的突变
，BTKY72中的所有六个位置的突变）已经使用人ACE2和R. Affinis 787 ACE2进行了重复的滴定 。用这些ACE2配体进行了较小的库子池滴定，如上所述进行 ，但每个样品缩放为1.6 OD600
，每个浓度收集> 100万个细胞
。 　　将使用DMS_VARIANTS（v.0.8.5）根据PACBIO测序确定（v.0.8.5）确定的库型序列读取（可在NCBI SRA上可用，BioSample SAMN20174027）与库条形码对齐 ，从而产生了每个face bin bin bin bin bin bin bin bin bin bin bin bin bin bin semote neque terme nemote bin。与实际分类到该垃圾箱的单元格相比
，每个FACS箱内的读数计数被垃圾箱的总读数比降低了 。github（https://github.com/jbloomlab/sarsr-cov_homolog_survey/blob/master/master/master/results/counts/variant_counts.csv）可获得每个FACS垃圾箱中每个条形码的表格下的计数
。 　　我们根据其跨FACS垃圾箱的计数分布以及每种垃圾箱的已知对数转换的荧光边界的分布，使用最大似然方法12,60估计了每个条形码变体的RBD表达水平 ，以及已知的fitDistrplus套件（v.1.0.14）61在R.表达测量中，对Barcodes sance s in Compods os barcods s ober barcods s ober compodss ober的最大最大可能性方法12,60估计了对数转换的荧光边界。垃圾箱 。在Github（https://github.com/jbloomlab/sarsr-cov_homolog_survey/blob/master/master/results/summary/summary/compute_meandfression_meanf.md）中描述了用于计算人均表达值的完整管道。 　　如先前所述
，我们估计了每个滴定浓度在每个滴定浓度下在每个滴定浓度下的ACE2结合水平的水平，如先前所述 ，计算为简单的平均60
，如前所述12
。我们确定了明显的结合常数KD，应用程序描述了每个ACE2的每个条形码变体的亲和力以及免费参数A（滴定响应范围）（滴定响应范围）和B（滴定曲线基线）与非线性最小二乘回归的BISCE2 BABILABERIPATION：ACE2 BABELELINGITATION： 　　如果在该浓度下在四个FACS箱中观察到少于10个计数 ，则在给定ACE2浓度下测得的平均bin值被排除在变体的曲线拟合中。如果在两个非连续的箱1+3或2+4中发现了单个双峰的证据
，则也从曲线拟合中排除了单个浓度点（> 40％的条形码计数，或在每个边界箱1+4中都发现了条形码计数的20％） 。为了避免错误拟合 ，我们将拟合基线参数B限制为1至1.5之间
，响应参数A为2至3之间，KD ，APP参数为1×10-15至1×10-5
。如果所有样品浓度的平均计数低于10
，或者由于计数低于10的计数而缺少> 20％的样品浓度，则将丢弃条形码变体的拟合。我们还丢弃了曲线拟合的情况 ，在均值均方根残留的情况下（从0到1归一化的残留物（从0到1相对于拟合响应响应参数A）与拟合响应参数a）为> 10×均等均等均方均方均等均方 。KD，APP结合常数表示为-LOG10（KD
，APP），其中较高的值表示较高的亲属结合
。在GitHub（https://github.com/jbloomlab/sarsr-cov_homolog_survey/blob/master/master/results/summary/summary/commpute/compute_binding_kd.kd.kd.md）深处描述了用于计算人均绑定亲和力的完整管道。 　　为了得出我们的最终测量结果 ，我们在代表每个RBD基因型的内部复制条形码上崩溃了测量 。对于每种RBD基因型
，我们都丢弃了每条重码测量值的顶部和底部5％（表达测量值）或2.5％（滴定亲和力），并计算了每个库中其余条形码的平均值
。这些条形码平均的测量值之间的相关性在图2G的扩展数据中显示了独立条形码和测定的库复制之间的相关性。最终测量值确定为从每个重复的条形码汇总的平均测量值的平均值 。在扩展数据中 ，直方图中显示了两种重复的最终测量结果的条形码总数
。图2F。如果在每个重复中未用至少一个非过滤条形码对RBD基因型进行采样
，或者在单个复制中对RBD基因型进行至少一个非过滤的条形码，则将丢弃RBD基因型的最终测量值 。在GitHub（https://github.com/jbloomlab/sarsr-cov_homolog_survey/blob/master/master/results/summary/summary/barcode_to_genotype_genotype_phenotypes.md）上描述了条形码崩溃的完整管道。可以在GitHub（https://github.com/jbloomlab/sarsr-cov_homolog_survey/blob/master/master/results/final_variant_variant_scores_scores_scores/wt_variant_cores.csv and wwtps：variant_cssv and github上找到 ，可以在GitHub（https://github.com/jbloomlab/sarsr-cov_homolog_survey/whomolog_survey/whomolog_survey和https://github.com/jbloomlab/sarsr-cov_homolog_survey/blob/master/results/final_variant_scores/mut_variant_scores.csv）
。 　　对于库实验后的RBD（图4和扩展数据图4 、6F和10E）
，将RBD克隆为ISEOGENIC股票中的2649质粒，使用LIAC/SSDNA变换方法对序列进行了验证并单独转换为酵母。如上所述 ，培养物的RBD表达
，并在ACE2浓度序列上标记，如V-Bottom 96孔板中所述 ，每孔为0.067 OD600酵母 。使用BD LSRFortessa X50流式细胞仪测量RBD+细胞的ACE2标记，并使用FlowJo（V.10）处理数据
。PE（ACE2）平均荧光强度与ACE2标记浓度的结合曲线如上所述
，其中包括山系数斜率参数n。 　　R. Affinis 787（GenBank：QMQ39222.1），R 。Affinis 9479（GenBank：QMQ39227.1） ，R
。Sinicus 1446（GenBank：QMQ39213.1）
，R。Sinicus WJ1（GenBank：QMQ39206.1），R 。ACT66275.1） ，R
。Sinicus 3364（GenBank：QMQ39219.1）
，R。Sinicus WJ4（GenBank：QMQ39200.1），R 。Sinicus 1438（Genbank：QMQ39203.1） ，R.Sinbank 1434（Genbank 1434）QMQ39212.1）通过Genscript合成ACE2胞座构建体并将其放入PCMV质粒中
。胞外域的域边界是残基19-615。使用信号-5.0（残基1-18）鉴定天然信号标签
，并用N末端MU磷酸酶信号肽代替 。然后将这些构建体融合到编码凝血酶裂解位点和在C末端的人FC片段的序列。所有ACE2 – FC构建体均在Gibco Expi293表达培养基中的37°C表达培养基中的Expi293F细胞（Thermo Fisher Scientific，A14527）中产生
。使用PEI-25K（Polyscience）转染培养物 ，其细胞生长至每毫升300万细胞
，并培养4-5天。使用1 mL HITRAP蛋白A HP亲和力柱（Cytiva），浓浓度和闪光在1×PBS中 ，从澄清的上清液中纯化蛋白质，pH 7.4（10 mM Na2HPO4
，1.8 mM Kh2po4，1.8 mm kh2po4 ，2.7 mm kcl
，137 mm kcl，137 mm nacl） 。细胞系未对支原体污染进行认证或测试
。 　　BTKY72 RBD构建体（BTKY72 s残基318-520）通过genscript与具有N端Mu磷酸酶信号肽的CMVR质粒合成 ，并通过短链接（-ggessss）与AVIFHEN（-gge）（-ghhhhhh）（-ghhhhhh）（-ggssss）与AVIFHN-avifea（-gghhhh）（-ghhhhhh） -BTKY72突变构建体T498W（BTKY72 S残基487）和K493Y/T498W（BTKY72 S残基482/487）通过BTKY72 RBD构建体从Genscronc中亚克隆。BTKY72和BTKY72突变体RBD构建体是在Gibco Expi293表达培养基中在37°C下的Gibco Expi293表达培养基中产生的
，该培养基在130 rpm的Humidified 8％CO2孵化器中旋转 。使用PEI-25K转染培养物，其细胞生长至每毫升300万细胞 ，并培养3-5天
。使用1 ml Histrap HP亲和力柱（Cytiva）从澄清的上清液中纯化蛋白质
，然后使用商业Bira试剂盒（Apapidity）浓缩，然后使用生物素化。然后 ，使用1 ml Histrap HP亲和柱（Cytiva）从Bira酶纯化蛋白质
，在1×PBS，pH 7.4中浓缩和闪光浓缩 。细胞系未对支原体污染进行认证或测试
。 　　用1,000 rpm的摇动在30°C的八位位红色（Forte Bio）仪器上进行测定。将链霉亲和素的生物传感器在水中水合10分钟 ，然后在10×动力学缓冲液（未稀释）中孵育60 s 。在基线平衡之前，在10×动力学缓冲液中以5–10μgml -1的量在10×动力学缓冲液中加载生物素化的RBD
，在基线平衡之前，在10×动力学缓冲液中120 s
。在10×动力学缓冲液中以1 µm的速度进行ACE2 -FC（二聚体）的关联。这些数据是基线减少的 。实验是用BTKY72 RBD的三个单独的纯化批次进行的。所有RBD都固定在相同的水平上 ，即1 nm的变化
。将数据绘制在GraphPad Prism中
，并显示了代表性图。 　　BTKY72 S构建体由Genscript合成，并将其克隆到具有C端3×FLAG标签的HDM质粒中 。BTKY72突变体S构建体T498W（BTKY72 S残基487）和K493Y/T498W（BTKY72 S残基482/487）通过BTKY72 s结构的Genscrond亚克隆
。使用HEK293T（ATCC CRL-11268）细胞制备假型VSV颗粒。使用Lipofectamine 2000（Life Technologies）转染HEK293T细胞在Opti-MEM转染培养基中具有S辅导质粒 ，并在37°C下与含有10％FBS的DMEM的8％CO2一起在37°C下孵育5小时 。转染后一天
，将细胞感染VSV（G*ΔGLuciferasy），在2小时后 ，将感染的细胞用DMEM洗涤五次
，然后再添加培养基补充了抗VSV G抗体（I1-小鼠杂交瘤上清液1:40，ATCC CRL-2700 ，ATCC CRL-2700）
。接种后18-24小时收集假颗粒
，通过3,000g离心10分钟从细胞碎屑中阐明，使用100 mwco膜以3,000 rpm的速度浓缩100× ，并在-80°C下冷冻。如上所述产生了模拟假病毒的模拟VSV假病毒，但在没有S.细胞系的情况下
，未对支原体污染进行认证或测试 。 　　HEK293T细胞（ATCC CRL-11268）和HEK293T细胞在10％FBS中培养具有稳定的人ACE2（参考文献63）的稳定转染，在37°C下在37°C的1％Penicillin-streptypycin DMEM中培养 ，在一个混湿的8％CO2培养箱中
。将细胞铺在多酰胺涂层的96孔板中。对于R. affinis ACE2进入
，使用Lipofectamine 2000（Life Technologies）在感染前36-48 h对HEK293T细胞中的affinis ACE2进行瞬时转染（在Opti-Mem中合成） 。在37°C的5 h孵育中，在加湿的8％二氧化碳培养箱中孵育后 ，将DMEM添加为10％FBS
，并将细胞在37°C下在加湿的8％CO2孵化器中孵育36-48小时
。细胞系未对支原体污染进行认证或测试。 　　在感染之前，将HEK293T细胞具有稳定的人ACE2表达 ，affinis ace2的瞬时表达或未转导为表达ACE2的瞬时表达一次用DMEM洗涤一次
，然后用归一化的假病毒在DMEM中镀术 。在60–80％汇合（人ACE2-293T）或80–90％汇合（R. affinis ace2-293t）之间，在DMEM中感染了2.5 h ，然后分别加入FBS和青霉素 - 链霉素
，分别为10％和1％。感染24小时后，将单GLO-EX（Promega）添加到细胞中 ，并在黑暗中孵育5分钟，然后在协同H1混合杂种多模式读取器（Biotek）上阅读
。在不同天（生物学重复）中产生的假病毒的归一化细胞入口水平在GraphPad Prism中绘制为单个点
，并将跨生物重复的平均细胞进入计算为几何平均值。 　　将上述细胞输入测定法的BTKY72 S父母和突变体假病毒颗粒输入标准化为使用蛋白质印迹定量的尖峰掺入 。使用小鼠单克隆抗FLAG M2抗体（Sigma-Aldrich，F3165）和Alexa Fluor 680 affinipure山羊抗小鼠IgG进行检测S进行S进行检测
。使用抗VSV-M [23H12]抗体（Kerafast ，EB0011）和Alexa Fluor 680 affinipure山羊抗小鼠IgG
，轻型链特异性（Jackson Immunoresearch Labs 115-625-174）进行VSV主链检测。在扩展数据中显示了代表性印迹图3C 。affinis ace2等位基因的表达未量化或归一化
。 　　我们表征了SARBECOVIRUS RBD的人ACE2结合，并确定了增加一些RBD亲和力的点突变体。这项工作包括从东南亚以外的SARBECOVIRUS RBD鉴定可以自然结合到人ACE2（来自俄罗斯的Khosta-2 RBD）或适应与人类ACE2的结合 ，而只有几个突变（来自肯尼亚的BTKY72 RBD） 。我们使用非复制性尖峰型VSV颗粒验证了后者的发现
。我们的实验均不构成生物安全风险
，因为它们仅涉及RBD蛋白（纯化或表达酵母）或非复制性假型VSV病毒颗粒，而不涉及活病毒。但是 ，另一位研究人员有可能对我们描述的RBD进行实际S​​ARBecovirus进行实验
，并且此类实验可能会带来风险 。反对可能的信息滥用，我们权衡了我们研究传达的信息的以下好处：（1）如讨论的结论段落所述 ，我们使用安全的方法来强调在对SARBECOVIRASS进行采样时需要进行护理的需求
，包括来自东南亚以外的人；（2）我们确定了更广泛的峰值蛋白质，这些尖峰蛋白应包括在生化研究中 ，以进行工程的对策（例如宽抗体64,65或稳定的尖峰免疫原）；（3）我们表征了可以使人ACE2亲和力降低的更安全的小鼠适应实验室菌株的突变（图8C）；（4）我们提供可以改善基于序列的表型预测的数据
。我们强调的是，我们的研究表明
，使用任何新的SARBecovirus的实时病毒实验应涉及仔细考虑风险，因为人ACE2结合可能会广泛。SARBECOVIRUS感染人类的​​实际能力不仅取决于其ACE2亲和力 ，还取决于其他特性
，包括Spike Protein66的蛋白水解激活，先天免疫和其他知识较差的因素 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。