除非另有说明，否则代表性图像描述了三个生物学重复之一。 　　除非另有说明 ，否则在37°C的LB培养基中常规生长大肠杆菌 。如前所述4
。 　　补充表2、3和4分别列出了引物
，菌株和质粒。在所有情况下，将质粒用作PCR模板时 ，将PCR样品在37°C下用DPNI处理1小时
，以消除转化之前的质粒模板 。将最终的DNA构建体转化为DH5α，并用Sanger和/或长阅读测序（Primordium）进行验证 ，然后转换为野生型MG1655背景
。对于噬菌体测定，CMDTAC操纵子存在于低拷贝PCD1（耐氯霉素耐药（CMR）
，PSC101复制的起源）中，并从其天然启动子（Pnative）表达。为了通过定点诱变构建变体PCV49（CMDT*AC） ，使用含有Y到突变的互补引物（CV109和CV110）用于用KAPA DNA聚合酶放大15个周期的PCD2 。PCV39是使用带有PCD4与质粒模板相同的引物集构建的。 　　使用引物CV127和CV128对低拷贝
，Pnative-CMDTANT-3×HAC（PCV43）进行了设计，以扩大PCD2 ，以使Amplicon末端位于CMDA起始密码子的下游
。然后
，Gibson组装将带有三个YPYDVPDYA密码子加上GGGSGGG接头密码子（3×HA标签，CV115）的合成DNA片段与PCR放大矢量互补的末端由Gibson组装与该矢量扩增的末端互补。Pnative-CMDTACNT-FLAG（PCV44）（nt标志表明N端标志标签）是通过放大PCD2构建的 ，PCD2的外向和5'-磷酸化引物CV120和CV122包括包括Dykdddk密码子
，其中包括Dykdddk Codons，然后是dykdddk codon ，然后是t4 dna dna dna dna dna ligase 。为了构建Pnative-CMDTCT-Flagac
，使用引物CD41和CD42扩增PCD2，并使用引物CD43和CD44用于从PCD10中扩增C端标记标记（CT-FLAG）CMDT序列（请参见下面的PCD10结构） ，然后使用GIBSON组装进行粘结
。为了构建Pnative-CMDTCT-FLAGANT-3×HACNT-HIS6（PCV42），首先
，使用Primers CV120和CV122，将编码的HIS6表位标签编码编码在PCD2的CMDC上。接下来 ，使用引物CD41和CD42扩增该质粒
，并使用引物CD43和CD44从PCD10放大CT-FLAG CMDT，然后使用Gibson组装组装 。最后 ，为了将三个串联HA标签插入CMDA的N末端
，使用CV123和CV124放大了此中间构建体，以使Amplicon端端位于CMDA ATG启动密码子的下游
。合成DNA片段CV115（HA TAG）用作带有引物CV125和CV126的PCR模板 ，然后由Gibson Assembly将其连接到矢量扩增子
，以产生PCV42。 　　为了构建用于删除Alt 。-3从T4中删除的PCV45，通过在50 mm NACL的情况下 ，从98°C的慢冷却从98°C降低了速度降温
，从而将免费的寡核苷酸CV118和CV119与PCAS9兼容的突出位点一起退火
。将PCAS9和退火的寡核苷酸与T4 DNA连接酶和BSAI-V2（NEB）一起在一锅反应中孵育。 　　对于PBAD30构建体（抗Kanamycin抗药性（KMR），中拷贝P15A来源） ，底漆CD5和CD6用于扩增和线性化PBAD30 。用相关引物（CD7-10，CD13-15
，CD20-21，CD30-33 ，CD38-40）使用T4基因组DNA
，质粒DNA或MG1655基因组DNA作为模板作为模板来扩增插入片段
。PBAD-CMDTNT-HISA（PCD19）是使用PCD4使用PRIMER CD45和CD46的PCR定向诱变创建的。PBAD-CMDTNT-HIS（∆CMDA，PCD9）是通过使用引物CV1和CV2（排除CMDA的开放式阅读框架）来放大PCD19创建的 。该PCR扩增子用T4 DNA连接酶在分子内结扎。在某些实验中 ，PAJM677（KMR
，p15a Origin）是PBAD的一种变体，用于表达CMDTA ，因为它在诱导了阿拉伯糖和更严格的抑制后表达较高的表达（PCV41）
。对于工程师PCV41
，PAJ677被放大并用引物CV113和CV114线性化。从PCD4和引物CV116和CV117放大了包含CMDTA的插入物 。吉布森组装将质粒和插入片段连接
。为了在这种情况下将3×HA标签添加到CMDA中，PCV41用作带有引物CV127和CV128的PCR模板 ，并且Gibson Assembly将此扩增子连接到CV115碎片。藻类诱导（PTET）PIF（耐碳纤维蛋白耐药（CBR）
，低拷贝PSC101起源）和PKVS45（CBR，P15A来源）构建体是通过使用Primers CD24和CD24和CD25和CD22和CD226-29 ，CD36，CD36
，CD36-37，通过PCR扩增的PCR扩增来构建的 。 　　为了构建GP23表达质粒PCD16 ，使用引物CD16和CD17或CD18和CD19分别从PUC19（PMB1* Origin）和PBAD30放大没有其来源的高拷贝起源
。这些片段是使用Gibson组装组装而成的
，以创建一个高拷贝诱导载体。随后，使用引物CD5和CD6和GP23通过PCR扩增了骨干 ，使用引物CD34和CD35从T4基因组DNA中扩增了骨架 。使用Gibson组件将这两个片段连接起来
。 　　将指示菌株的过夜培养物与融化的LB和0.5％琼脂混合
，然后在含有1.2％琼脂的LB的板上覆盖。对于通过诱导阿拉伯糖诱导的启动子进行的斑块测定，基本层板包含0.2％W/W阿拉伯糖 。将指示的噬菌体的十倍稀释系列被发现在板上 ，并在30°C下生长过夜
，并列举了斑块形成单位（PFU）
。log10（保护）（图1C）被测量为-LOG10 EOP，其中EOP是Pfuexperimentiment/pfucontrol的比例 ，其中下标表示条件。除非另有说明
，否则在生物学三份和代表性图像中进行实验 。 　　为了测量感染T4的菌株的存活，将隔夜培养物稀释至OD600 0.1。将培养物生长至OD600 0.3 ，然后在1.7 mL eppendorf管中调节至〜3×107菌落形成单元（CFU）
。将细胞在10个MOI下感染T4，并在37°C下与旋转一起孵育。感染后0分钟和18分钟
，将细胞颗粒并用PBS洗涤两次，以去除多余的噬菌体 。用氯霉素或卡纳米霉素和CFUS散布在LB琼脂板上 ，并定量一百颗十倍的稀释液和CFU
。在感染后18分钟
，在感染后0分钟，在感染后18分钟将存活率测量为CFU ML-1。为了对抗抑制CFU形成的空载体应变中的后代噬菌体 ，将所有样品用约107个氯霉素处理的
，氯霉素敏感的伴随板板（MG1655）铺板 。 　　通过将隔夜培养物稀释至20 ml lb的OD600 0.1进行ECOI分析
。培养物进行生长，直到它们达到OD600 0.3-0.4 ，此时它们以0.1的MOI感染T4。20分钟后
，将1毫升颗粒并用PBS洗涤两次 。将一百微米的十倍稀释液与50 µL指示剂应变和3 ml lb 0.5％琼脂混合，并叠加到LB板上
。为了控制未吸附的噬菌体 ，并行分析了∆OMPC菌株（OMPC是T4的受体）。列举CFU
，并将ECOI计算为含CMDTAC应变的PFU ML-1除在从每个值中减去∆OMPC控制实验的PFU ML-1之后，将含CMDTAC的应变除以PFU ML-1 。 　　为了确定爆发尺寸 ，在37°C的水浴中，在lb+20 µg ml-1氯霉素中生长了空载体和含有CMDTAC菌株的细胞培养物
，直到OD600的含量为0.5
。然后将tryptophan添加到每种培养物中的20 µg mL -1中，以帮助T4的吸附。将一百微透明液添加到每种培养基的9.9 ml中 ，并孵育2分钟以允许吸附 。接下来
，对于每种培养物，将来自该吸附烧瓶的100 µL T4感染培养物添加到9.9 ml lb+20 µg ML-1氯霉素（烧瓶A）中。再次将烧瓶A稀释到烧瓶B中 ，然后将1:10浸入烧瓶C中
。将烧瓶A的五百微米添加到200 µl冰冷的氯仿中并涡旋10 s。该氯仿处理样品的生存PFU代表未吸附的噬菌体（吸附控制） 。接下来
，将每个烧瓶A（时间0样品）或吸附控制与3.5 ml lb 0.5％琼脂混合在50°C下的100 µL，并将其添加到50 µL的指示菌株过夜培养物中
。将这种混合物短暂涡旋 ，并叠加到Lb + 20 µg ml -1氯霉素 + 1.2％琼脂板上。然后将所有烧瓶放在30°C的摇浴中孵化 。60分钟后
，将 +CMDTAC菌株的空载体应变和烧瓶A的烧瓶C的100 µl用琼脂板上的指示株覆盖
。在37°C的过夜孵育后，列举了斑块 ，并将其标准化为吸附控制。将爆发尺寸记录为每个板上的斑块数量乘以其稀释因子
，然后除以时间0时的斑块数量 。 　　为了测量T4感染期间的生长，将 +CMDTAC和空载体细胞的隔夜培养物在96孔板中以1：200进行了反稀释 ，并在指定的MOIS处被T4感染
。培养物在37°C下生长，在板读取器（Biotek）上摇晃培养6小时。对于用CMDTAC的GP23和GP31的异位表达
，在M9L + 0.2％W/W葡萄糖 + 100 ng ml-1半甲基环素（ATC）中，将过夜培养物回到0.05的OD600中 ，并在37°C下生长3 h he to-te-def-tof-tofe-defiper 。然后将培养物固定在0.05的OD600的新鲜M9L + 0.2％W/W葡萄糖 + 100 ng ml -1 ATC或M9L + 0.2％W/W葡萄糖 + 100 ng ml -1 ATC中
。培养物在37°C下生长
，轨道读取器上的轨道摇动12小时。 　　对 +CMDTAC和空载体细胞的过夜培养物进行了反降低，并在0.2至0.3之间在37°C至OD600之间生长 ，然后以10的MOI感染T4 。如前所述
，在感染后多个时间点从细胞中提取RNA，如前所述44。简而言之 ，将1 mL的细胞与1 mL沸腾的裂解缓冲液（SDS 2％
，4 mM EDTA pH 8）混合，并在100°C下孵育5分钟 ，然后在液氮中闪烁冷冻
。将两个加热至67°C的酸性苯酚溶液（pH 4.3
，Sigma）加热到解冻样品，涡旋 ，然后在67°C下孵育2分钟。样品以20,000克的速度向下旋转10分钟，并在收集的水层上重复进行热苯酚提取 。然后使用2 ml酸性缓冲酚 - 氯仿溶液（Ambion）进行第三次提取
。然后将最终提取的RNA在-20°C下至少1小时或-80°C下沉淀
，用1×体积异丙醇，1/10×体积3 M乙酸钠（pH 5.5 ，Thermo Fisher）和1/100×体积胶合物过夜。通过在4°C和20,000克离心30分钟通过离心颗粒 。用800毫升冰冷的70％乙醇洗涤两次
，并重悬于90μl无RNase H2O（Thermo Fisher）中
。 　　为了去除DNA，将10μl的10×涡轮DNase缓冲液（Amb）和2μL涡轮DNase I（Ambion）添加到每个样品中 ，并在37°C下孵育20分钟。然后加入另外2μL的涡轮DNase I
，并在37°C下再次孵育20分钟 。用3×体积乙醇，1/10×体积3 M乙酸钠（pH 5.5）和1/100×体积胶合线从此摘要中提取RNA
。颗粒和洗涤与上述相同。使用纳米体分光光度计验证RNA产量 。 　　生长细胞直至所需条件 ，然后将900μl培养物与100μl的停止溶液（5％酸苯酚
，95％乙醇）混合，并倒入混合
。然后以13,000克的速度向下旋转样品30 s ，去除上清液
，然后在液氮中冷冻颗粒。向每个颗粒中，加入400μl的Trizol试剂（Invitrogen）加热至65°C ，并在65°C和2,000 rpm的情况下使用Thermoxer进行10分钟，然后在-80°C下冷冻至少10分钟 。将样品解冻
，然后在4°C下以20,000克离心5分钟，以使任何碎屑颗粒 ，然后Trizol溶液移至新管。使用Direct-Zol RNA Miniprep试剂盒（Zymo Research）纯化RNA
，包括制造方案，包括可选的柱中DNase处理
。使用纳米体分光光度计验证RNA产量。 　　1×TBE缓冲液（Invitrogen）中的NOVEX 6％TBE-TEREA凝胶在样品加载前至少在180 V中进行至少50分钟 。将每个RNA样品与等体积的NOVEX 2×TBE-TBE-TEREA样品缓冲液（Invitrogen）混合 ，在90°C下加热10分钟
，然后在加载前将其放在冰上2-3分钟
。根据预期的产品长度，凝胶在180 V下以30-50分钟的速度运行。将凝胶从套管中取出 ，并在40 ml 1×TBE中孵育4μlSYBR金染色（Thermo Fisher）10分钟 。将凝胶成像为SYBR金成像的Chemidoc MP成像系统（Bio-RAD）
。通过在0.38 A的半干式转移90分钟
，将RNA从凝胶转移到Hybond-N+尼龙膜（Cytiva）。转移后，通过暴露于StratalInker UV交叉链接机中的120,000μJ紫外线辐射 ，将RNA与膜结合 。然后将膜在室温下在1×PBST中在0.2％Iblock（Invitrogen）中摇动
，在室温下或在4°C下过夜10分钟
。用聚/单ADP核糖兔抗体（细胞信号传导技术）在0.2％iBlock + 1×PBST中稀释的一抗抗体处理，或在室温下在4°C下在4°C下过夜。初级抗体处理后 ，将膜洗涤3次，每次用1×PBST洗涤10分钟 。对于二抗治疗
，将膜在室温下与山羊抗兔IgG（H + L）二级抗体，HRP（Invitrogen）在0.2％Iblock + 1×PBST中稀释1：1,000
。然后 ，将膜再次洗涤3次
，每次1×PBST将膜洗涤10分钟。信号是使用SuperSignal West Femto最大敏感性底物（Thermo Fisher）开发的，并在Chemidoc MP成像系统上成像用于化学发光检测 。除了在膜上发现250 ng DNA或1 µg RNA外 ，进行了点印迹。 　　对于琼脂糖免疫北方印迹
，将0.8 g的琼脂糖融化在66.7 mL的H2O中，并使其冷却至65°C
。将8 ml的0.2 m（10×）3-（N-甲氧磺酸）丙二硫酸（MOPS）缓冲液 ，5.4 mL甲醛和5 µl 10 mg ML-1溴化乙锭添加到琼脂糖中
，并施放14×12 cm凝胶并使其冷却14×12 cm。将4 µg RNA添加到17 µL样品缓冲液（2 µL 10×MOPS，4 µL甲醛 ，10 µL去离子甲酰胺和1 µL溴化乙啶）中
，并在80°C变性10分钟，然后在冰上冷却5分钟 。在采样加载之前 ，将在115 V下运行空凝胶5分钟
。将2 µL载荷染料（50％甘油，溴酚蓝和二甲醇）添加到每个RNA样品中。然后将样品在1×MOPS缓冲液中以100 V电泳80分钟 。在将H2O浸泡10分钟之前
，将凝胶可视化10分钟，然后在转移缓冲液（3 M NaCl ，0.01 N NaOH）中平衡20分钟
。通过在室温下向上转移75分钟
，将RNA转移到Hybond-N+尼龙膜上。如上所述进行免疫印迹 。所有免疫印迹实验均以至少生物学副本进行
。 　　收集细胞并按照上述感染细胞收集RNA。使用先前描述的核糖体RNA减法方法去除rRNA 。然后使用超声处理将缺乏RRNA的RNA碎片
。对于要超声处理的每个样品，将4μgRNA添加到100μL1×TE缓冲液（Sigma）中 ，在1.5 mL TPX微管（Diagonode）中
，并在冰上孵育15分钟。然后将试管放在300个超声量水浴中，将其冷却至4°C ，在30 s开环的60次循环中
，在高功率设置下30 s左右 。每十个循环试管在微量离心机中短暂旋转，以确保所有液体都保持在超声量的水线以下。然后 ，将每个样品用无RNase水的水将总量为200μl
，然后在-20°C下至少1小时或在-80°C下沉淀，用600μl100％乙醇 ，20μL乙酸钠（pH 5.5）和2μL糖布糖布
。通过在4°C和21,000克离心30分钟，将RNA固定。用800毫升冰冷的70％乙醇洗涤两次
，并重悬于90μl无RNase H2O中 。 　　ADP核糖RNA免疫沉淀基于低输入样品的甲基化RNA免疫沉淀测序（MERIP-SEQ）方案47
。将100微透明的Dynabeads蛋白G珠在IP缓冲液中洗涤3次（150 mM NaCl，10 mm pH 7.5 Tris-HCl ，0.1％NP-40替代品）。将十微晶的多/单-ADP核糖兔抗体（细胞信号传导技术）添加到洗涤的珠子中
，重悬于500μl的IP缓冲液中，然后在4°C下在端到端旋转的4°C中孵育过夜 。孵育后 ，用IP缓冲液两次洗涤抗体偶联的珠
，然后在500μl的IP缓冲液中重悬于500μl的IP缓冲液中，并用20μg碎片 ，rRNA耗尽的RNA和5μLSuperase-In酶-in酶RNase RNase抑制剂
，并在4°C下在4°C下进行末端旋转
。然后用1 mL IP缓冲液洗涤样品两次，用1 ml低盐水洗涤（50 mM NaCl ，10 mm pH 7.5 Tris-HCl
，0.1％NP-40替代品）和1 ml高盐水洗涤（500 mM NaCl，500 mM NaCl ，10 mm pH 7.5 Tris-HCl，0.1％NP-40 NP-40替代）。对于每种洗涤
，将珠子在4°C的端到端旋转下在4°C的洗涤溶液中孵育10分钟 。最终洗涤后，将珠子从Qiagen Rneasy套件的200μLRLT缓冲液中孵育2分钟 ，并端到端旋转
。使用磁架从珠子分离上清液
，转移到新管中，并与200μl的100％乙醇混合。该混合物通过在4°C下以20,000克离心1分钟通过rneasy minielute自旋柱 。然后用500μLRneasyRPE缓冲液洗涤自旋柱一次 ，然后用500μl80％乙醇洗涤一次
，每次自旋在4°C下进行20,000g进行1分钟
。然后以20,000克旋转列5分钟以去除残留的乙醇。将RNA从15μL无RNase H2O的色谱柱中洗脱，在4°C下自旋 ，在20,000g下旋转5分钟 。分别使用纳米体分光光度计和NOVEX 6％TBE-rea凝胶（Invitrogen）验证RNA的产量和完整性。 　　然后使用Nebnext Ulta ultra II RNA图书馆预备套件
，使用Nebnext Ultra II RNA库预备套件，用于Illumina ，遵循制造商的协议
，与RRRNA浸泡的福利蛋白纹状体固定，石质固定的 ，石质固定的rna一起使用Nebnext Ulta II RNA图书馆预备套件，使用Nebnext Ulta II RNA库预备试剂盒
，与Nebnext Ultra II RNA库预备套件一起制作RNA-Seq库
。库的配对末端测序是在MIT生物环境中的单数G4机器上进行的。然后将FASTQ文件映射到MG1655基因组（NC_00913.2），T4基因组（NC_000866）和质粒PKVS45-CMDTAC ，如前所述44,48 。 　　收集细胞并按照上述感染细胞收集RNA
。使用先前描述的核糖体RNA减法方法去除rRNA。然后使用Nebnext Ulta ultra II RNA库预备套件
，用于Illumina，遵循制造商的协议 ，用于与纯化的mRNA或RRNA耗尽的RNA
，使用Nebnext Ulta II RNA库预备套件，用于Illumina的Nebnext Ulta II RNA库准备套件 ，将每个耗尽RRNA的RNA样品的一百纳米图用于制作RNA-Seq库 。库的配对端测序是在MIT生物环境中的Illumina NextSeq 5000机器上进行的
。然后将FASTQ文件映射到MG1655基因组（NC_00913.2）
，T4基因组（NC_000866）和质粒PKVS45-CMDTAC，如前所述44,48。 　　将 +CMDTAC和 +CMDTA/FLAG-C或 +CMDT-FLAG/AC细胞的过夜培养物在250 ml lb中进行了反降 ，并在37°C下生长至0.3的OD600
，然后 +CMDTAC和 +CMDTA/FLAG-C的 +CMDTA/FLAG-C的 +CMDTA/Flag-C在MOI处感染了T4，供其 +CMDTA/FLAG-C +CMDTA/FLAG-C +10分钟 。+CMDTA/FLAG-C培养物64毫升样品通过以7,500克离心5分钟来固定样品
。将沉淀倒入1 ml的裂解缓冲液中（25 mM Tris-HCl ，150 mM NaCl，1 mM EDTA
，5％甘油，1％Triton X-100） ，补充了1μl-1 ML-1 ML-1 ML-1 Ready-Lysezyme（Fischer Scientific）
，1μl-ML-ML ML-ML ML ML ML ML-ML ML ML ML-ML ML ML-ML ML-ML ML-1-1-1-1 botsmal（s）鸡尾酒（Roche），然后在液氮中闪烁。将样品保存在液氮中 ，直到收集所有时间点 。将样品在液氮中进行两个冷冻循环
，以确保细胞的完全裂解
。根据需要将额外的裂解缓冲液添加到样品中，以使样品浓度通过OD600归一化。样品在20,000克旋转10分钟 ，在4°C下以任何碎屑颗粒 。对于每个样品
，将50μl的Pierce抗DykDDDDDK磁琼脂糖珠与450μl裂解缓冲液混合，然后使用磁架收集到管子的侧面。然后用500μL裂解缓冲液洗涤珠两次
。最后洗涤后 ，将珠与1 ml样品混合
，并在室温下在端到端转子上孵育20分钟。孵育后，将珠在洗涤缓冲液（1×PBS ，150 mm NaCl）中洗涤两次，然后用MILLIQ H2O洗涤一次 。 　　如前所述42
，MIT生物聚合物和蛋白质组学核心完成了珠子上的减少，胰蛋白酶消化和LC-MS/MS
。简而言之 ，在56°C下用10 mM二硫代醇（Sigma）降低蛋白质1小时
，然后在黑暗中用20 mm碘乙酰胺（Sigma）在黑暗中25°C烷基化1小时。用改良的胰蛋白酶（Promega）在100 mm中消化蛋白质，以1:50酶的pH 8 pH 8碳酸氢铵：底物比 。添加甲酸（99.9％ ，Sigma）以停止胰蛋白酶消化
。使用皮尔斯肽脱盐柱（热蛋白）然后冻干进行消化的肽。在90分钟内通过反向相HPLC（Thermo Ultimate 3000）在90分钟内将肽分离在纳米电喷雾之前
，带有Orbitrap Exploris 480质谱仪（Thermo） 。质谱仪运行以数据依赖性模式完成
。完整的扫描参数是在375–1600 m/z中的120,000分辨率和最大值25 ms。随后是MS/MS，对于在两个第二个周期中的许多前体离子 ，分辨率为30,000
，动态排除20 s，NCE为28 。检测到的肽被映射到MG1655 ，质粒和T4蛋白序列
，T4蛋白质序列以及蛋白质的丰度按蛋白质的数量估计，以估计蛋白质的蛋白质 ，以正常蛋白蛋白量
。在每个时间点，标志下拉与未标记的下拉之间的光谱计数的比率用于生成数据中的数据
，并在每个计数中添加了一个伪数。 　　根据制造商的方案，使用Purexpress试剂盒（NEB）进行了体外转录 - 翻译测定 ，并在37°C下孵育2小时 。用1 mM NAD+和蛋白质洗脱液补充了每种反应
，并用1 u µl -1 ruboguard rNase抑制剂（LGC BioSearch Technologies）补充。在提供mRNA作为翻译模板时，使用purexpress Control DHFR质粒的PCR扩增DHFR基因
。使用DNA清洁和浓缩器试剂盒（Zymogen）纯化PCR扩增子。然后 ，通过将300 ng DNA与200 U T7 RNA聚合酶
，0.5 mM NTPS和5 mM DTT一起在37°C的最终反应体积中孵育4.5 h 4.5 h，从而从PCR模板中合成mRNA 。使用RNA清洁和浓缩剂试剂盒（Zymogen）与柱上DNase I处理从反应中纯化所得的RNA
。然后将纯mRNA用CMDT或对照模拟纯化的蛋白在1×ADPR缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.0和150 mm NaCl）中用1 mm NAD+和1 mM NAD+和1 U µL-1 Riboguard在37°C下处理2小时。RNA再次像以前一样纯化 ，并在37°C下在Purexpress反应中提供1 µg 。从该反应中
，将2.5 µL在Laemmli缓冲液中变性，并通过SDS-PAGE在8–16％的聚丙烯酰胺凝胶上运行 ，并用亮蓝R250或Coomassie Fluor Orange（分子探针）染色
，并在Bio-Rad ChemIdoc MP Imaker上可视化
。 　　在含有适当的抗生素的新鲜LB中，将细胞培养物生长过夜 ，并稀释1：200。培养物在37°C至指定期中期生长，然后用T4在10个MOI或10个实验指示的适当诱导剂中处理 。在各种时间点
，将细胞颗粒，闪光冷冻 ，然后在Laemmli缓冲液中重悬于Laemmli缓冲液中
，并在标准化为培养浊度（100 µL OD600-1 ml-1）的体积中，2.5％2-甲醇
。样品由标准SDS -PAGE在12％聚丙烯酰胺凝胶上运行。CMDA – HA在90 V时转移到0.2 µM PVDF膜上 ，否则在100 V进行60分钟进行 。在室温下以0.05％TWEEN-20（TBST）和5％的非脂肪牛奶在Tris缓冲盐水中阻塞膜
，并在室温下60分钟，并与原代单克隆抗体（1：1,000兔抗Flag或抗HA ，抗HA
，细胞信号技术）孵育，在4°C下在4°C中播放
。用TBST洗涤膜 ，并与HRP偶联的山羊抗兔IgG（Invitrogen）在室温下阻止缓冲液中60分钟。在Bio-Rad Chemidoc MP成像仪上暴露之前
，再次将膜再次洗涤并与超信号西Femto最大敏感性底物（Thermo Scientific）一起孵育 。用亮蓝色R250染色膜作为装载控制。为了量化频带强度，我们在ImageJ中使用了凝胶分析工具
。将抗体信号的像素强度标准化为总蛋白质染色的像素强度。 　　对于免疫印迹 ，直接成像膜化学发光，然后成像预先染色的分子量标记物 。如图1所示
，将图像对齐，以将化学发光带与分子量标记物相关联 ，如主要图所示
。 　　通过用缓冲液组成的裂解细胞由50％BPER-II（Thermo Scientific）
，0.1 mg ML-1溶菌酶，完整的蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich） ，6 U DNase I（NEB）和3 µL RNase A（NEB）（NEB）（NEB）组成
，在沃尔姆（NEB）中，在沃尔姆（NEB）中 ，在沃尔布斯中均具有量量的600。将样品在室温下孵化直至清除
，然后在桌面离心机中以最大速度旋转5分钟，以颗粒不溶性材料 。将天然加载染料（6×; 600 mM Tris-HCl ，50％甘油
，0.02％Bromophenol Blue）添加到样品中，并将其加载到12％聚丙烯酰胺迷你蛋白酶TGX TGX Pre-Cast Pre-Cast Pre-Cast凝胶（Bio-Rad ，不包含SDS）
。将样品在25毫米Tris中电泳，192毫米甘氨酸在75 V下运行缓冲液90分钟。如本节在100 V时所述
，在4°C下进行1小时，将转移在0.2 µM PVDF膜上进行 。如上所述处理印迹
。显示的印迹是至少两个生物学重复的代表性图像。 　　如先前所述49 ，在四轮中所述进行T4对CMDTAC细胞的演变
，从而导致ALT 。-3 C末端扩展
。为了产生Alt。-3突变体用于进化进化实验，将T4储备叠加到包含CAS9的菌株和针对Alt.-3或没有垫片的对照质粒的菌株（ML4233和ML4234） 。比较了在隔离菌株上形成的斑块与对照的数量 ，以确定垫片是否施加了任何选择。尽管尝试使用八个潜在的垫片
，但仍未观察到选择
。为了减轻这种情况，我们在大肠杆菌∆MCRA ∆MCRBC背景上重复了T4 ∆AGT ∆BGT（DNA包含非葡萄糖基化的5-羟基甲基胞嘧啶）的实验。在Alt 。-3间隔物存在下 ，该T4形成较少的斑块
，这表明在这种情况下对Alt
。-3突变体进行了选择。Alt.-3区域通过PCR进行扩增，Sanger从能够在含有间隔者菌株上形成的斑块进行测序 。在这些斑块中 ，我们隔离了一个菌株
，该菌株含有一个突变，几乎包含了alt.-3的整个开放式阅读框架
。在垫片存在下将T4 ∆Alt.-3应变传播 ，并在4°C下存储为储备。该T4菌株对含CMDTAC的细胞的演变与以前相同，在17发子弹中
，而没有观察到增加斑块能力的突变 。 　　+CMDTAC和 +CMDT*AC细胞的过夜培养物在LB +20 µg ml-1氯霉素中进行了反降，并在37°C生长至0.2和0.3之间的OD600
。每种培养物的等分试样是在T4感染之前以10的MOI感染收集的 ，并在每个指示的时间点再次收集（感染后T = 10 、20
、30、40分钟）。将每个收集的样品与EasyTag Express-35S蛋白标记混合物（Perkin Elmer）在37°C下孵育2分钟 。用未标记的半胱氨酸/蛋氨酸混合物以5 mm的速度追逐标记
，然后在13％w/v冰冷的TCA中沉淀出样品
。通过以16,000g离心在4°C下以1分钟的速度进行样品，用500 µL冰冷的丙酮洗涤两次 ，然后重悬于重悬浮缓冲液中（100 mM Tris pH 11.0
，3％W/V SDS）。在4–20％SDS-PAGE凝胶（Bio-Rad）上运行样品，在凝胶干燥溶液中孵育10分钟 ，然后在80°C下在真空凝胶干衣机上干燥2小时 。干凝胶在一夜之间暴露于磷光体筛网中
，然后在阿默瑟姆台风成像仪上成像。 　　ML4207和ML4232的五毫升培养物在37°C的LB+0.2％葡萄糖中生长过夜
。第二天，每种培养物用葡萄糖洗涤两次 ，并用于接种495 ml lb+25 µg ml -1 kanamycin。额外生长1小时后
，将阿拉伯糖添加到最终浓度为0.2％ 。再种植培养物，再种植95分钟 ，沉淀，用H2O洗涤
，再次颗粒，并在液体N2中冷冻
。第二天 ，将细胞颗粒重悬于4毫升裂解缓冲液中（50 mM Tris pH 7.5 、500 mM NaCl
，0.05％Tween-20，无EDTA无蛋白酶抑制剂 ，0.5 mM PMSF
，0.5 mg MG ML-1-1 Lysozyme，5mm Imidazole ，5％imidazole
，和5％glyazole，和5％Glycerol）。然后 ，通过在Bioruptor 300中超声处理裂解细胞
，每次10个循环，高设置 ，30 s ON/30 s折叠 。在裂解缓冲液中平衡了一个Ni-NTA琼脂糖树脂（Qiagen，0.5 mL床体积）的毫升
。通过离心阐明细胞裂解液
，然后在4°C下与Ni树脂一起在4°C下孵育1小时。在4°C下进行以下步骤 。然后将树脂通过10 mL色谱柱，然后用2.5 mL洗涤缓冲液（与裂解缓冲液相同 ，但没有溶菌酶
，并以20 mm的速度洗涤）
。然后将蛋白质用2.5 mL洗脱缓冲液（以300毫米为单位的咪唑浓度洗涤缓冲液）洗脱蛋白质。使用微生物旋转色谱柱（Bio-Rad）将洗脱蛋白交换为TRIS pH 7.4，并使用Amicon Ultra Ultra 0.5 mL离心滤器浓缩 ，并具有3 kDa截止 。 　　如下所示
，将典型的反应组装在冰上
。在由20 mM Tris-HCl pH 8.0和150 mM NaCl组成的缓冲液中，我们添加了1 U µL-1 Riboguard RNase抑制剂 ，1 mM NAD+（NEB）
，4 µg DNA或RNA寡核苷酸或RNA寡核苷酸，以及浓度指示的蛋白质。然后将反应在37°C的热环生中孵育 。为了停止反应 ，加入了相等的2×6 M尿素样品缓冲液（NOVEX）。将RNA在95°C变性10分钟
，然后立即放在冰上
。然后，将一微克RNA样品在180 V的15％聚丙烯酰胺TBE-TEREA凝胶中进行75分钟。用SYBR金染色凝胶 ，并在0.1×TBE缓冲液中使用0.2％亚甲基蓝的浓缩溶液染色15分钟，并用H2O的几种变化和成像进行染色 。 　　如上所述
，在37°C下用0.25 mm 6-生物素17-NAD+（Cayman Chemical）（Cayman Chemical）（CAYMAN CHEMICAL）在37°C下用0.25 mm 6-生物素17-NAD+（CAYMAN CHEMICAL），将20微克的总RNA与CMDT进行了ADP-核糖基化 ，然后在4°C下继续过夜
。除了使用模拟纯化的蛋白质或标准NAD+代替6-Biotin-17-NAD+的标准NAD+外
，两种控制反应相同。将10微克的每个反应保持在-80°C，作为前粉样样品 。根据制造商的协议 ，将其余10 µg与链霉亲和素共轭的超级磁珠（Dynabeads Myone tretpavidin C1）一起孵育
。通过添加0.5 mL Trizol从珠子中剥离RNA
，并在25°C下在1,000 rpm的热晶中孵育15分钟。然后用磁体沉淀珠，并加入100 µL氯仿 。通过以14,000克离心15分钟将相分开
。最后 ，使用RNA清洁和浓缩试剂盒（Zymogen）纯化水相。将粉末和后样品样品在6％TBE-TEREA凝胶上电泳45分钟
，用SYBR金染色并成像 。如本节所述，来自包含6-生物素17-NAD+和CMDT的之前和后脉后反应的样品受RNA-SEQ的约束 ，但没有RRNA耗竭
。 　　如上所述
，对NO-U和NO-C RNA寡核苷酸（图4D）的10微克（图4D）进行了ADP-核糖基化。包括对照，其中纯化的CMDT被模拟纯化代替 ，或者省略了NAD+ 。接下来，将样品分割
，并用100 U核酸酶P1（NEB）和10 U南极磷酸酶处理，或者与来自Adamanteus venom的1 U磷酸二酯酶I I相同（SVPD ，Millipore Sigma）。将反应在37°C下的消化缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.6
、50 mM NaCl2、1 mM ZnCl2和10 mM MGCL2）中孵育3.5小时
，总体积为110 µl
。将一百微米的消化和去磷酸化的核苷（10 µg）注入Vydac C18 4.6×250 mm反相硅柱（218TP54），用90％缓冲液A平衡（0.1 M triethylymonymonymonium acthymonium acthymonium acthymonium actea a actea actea）乙腈 ，pH 7.0）。HPLC的流动相梯度由缓冲液A和B组成
，从1-21分钟和60–97％B组成，从21-26分钟 ，流速为1 ml min -1 。在A254测量分析物
。在重复运行中
，收集了未经SVPD处理的样品，作为分数和相关分数冻干的样品。然后将样品重悬于消化缓冲液中 ，并再次与10 U南极磷酸酶和1 U SVPD孵育3.5小时
，并如上所述通过HPLC分析 。 　　从HPLC分析中收集的分数在速度VAC中干燥，并在0.1％甲酸中重悬于200 µL的50％乙腈中
。由注射器泵直接注入带有API源的热Q和电喷雾电离探针以5 µL min -1的流速直接注入热量。该仪器以正离子模式运行 。MS/MS在25和40 CE的碰撞能量上进行
。仪器参数如下：喷雾电压 ，3.8 kV；毛细管温度，280°C；鞘气
，20；辅助气体，5；扫气5。 　　CMDT序列徽标是使用skylign.org从defensefinder50的CMDT HMM文件生成的 。 　　从Defictfinder50下载了CMDT和CMDC的隐藏Markov模型配置文件 ，并使用HMMSCAN和默认参数搜索了RefSeq非冗余蛋白质数据库
。然后在所有可用的REFSEQ细菌基因组中鉴定蛋白质命中
，如果CMDT和CMDC都存在于基因组中的两个蛋白质中，则称为CMDTAC。CMDA不包括在呼叫中 ，因为它既具有较高的序列可变性
，又在明显同源系统中通常没有被宣布 。所有数据集于2023年7月下载。创建并过滤了RefSeq基因组的完整分类谱系，以包括当前感兴趣的细菌（属的属 ，大于1,000个测序基因组）
。这些属与NCBI共同树产生了分类关系
，并从CMDT/C HMMSCAN的分类学概况中记录了存在/不存在。 　　使用HHPRED51评估蛋白质同源性 。使用Alphafold252和降低的数据库上的多聚机模块和默认参数对单个组件和CMDTAC作为复合物的结构进行预测，并使用每个模型生成1个预测
。基于CMDT和CMDC的AlphaFold2预测结构的结构同源性搜索是使用FoldSeek53进行的 ，并且用于随后分析的每项搜索的最高点击。使用Chimerax中的库仑功能进行静电建模 。所有预测的结构可视化均使用Chimerax进行
。 　　使用Casadapt54（版本1.15）对每个样本的FASTQ文件进行修剪
，然后映射到大肠杆菌MG1655基因组（NC_00913.2），T4基因组（NC_000866） ，质粒PKVS45 -CMDTAC使用Bowtie255（2.3.4.1.3.4.1）与以下30 grastie -degry -plasmid pkvs45 -cmdtac进行了 - -dry -plastie -degry -egry -plastie -plasmid pkvs45 -cmdtac。-n 0，-l 20
，-i s，1,0.50 。然后 ，使用SamTools56（1.7版）将Bowtie2映射生成的SAM文件转换为BAM文件
，然后使用GenOmearray3 Python Library57进一步转换为Numpy阵列57用于下游分析
。对于体内RIP – Seq分析，仅使用了由带有RNA TPM的转录本确定的两种复制的转录本 ，使用了大于或等于任何T4转录本的最小平均TPM。为了进行RNA类型之间TPM比的统计比较
，使用了Welch的t检验 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得
。