在接受其原发性肿瘤手术切除的未接受治疗的患者同意后 ，获得了头和颈部鳞状细胞癌（HNSCC）组织样品
，从而确保免疫浸润不会受到先前的治疗干预措施（例如放疗）的影响 。从接受常规牙科手术的个体中获得了各种炎症性疾病（例如植入体炎，牙周炎或骨手术）的发炎OM组织活检
。如果可能的话 ，从每个组织供体中收集匹配的外周血样本。所有研究参与者都在纳入研究之前均签署了书面知情同意书
，并由弗雷德·哈钦森癌症研究中心（IRB＃6007-972和IRB＃8335）的机构审查委员会（IRB）批准协议 。补充表1中提供了样品和相关程序信息的详细列表，以及进行的面板和/或测序实验
。此外 ，通过HESTELL ARE CORTION CORTION（SAC（SAC））通过HIV疫苗（HIV疫苗）（HIV疫苗）（HIV）（HIV）（HIV）（HIV）（HIV）（HIV）（HIV vicel）（HIV vicel vicel fiftr）（long vitr）（HIV）（HIV）（long vitr）（HIV）（HIV）（PBMC）（pBMC）（pBMC）（long vitr fialtr）（HIV）（HIV）。对所有流式细胞仪的控制（数据未显示） 。获得了人类鳞状细胞癌系SCC-15并从ATCC验证（对支原体测试）
。 　　经过外科手术
，将新鲜组织样品立即放入具有完整培养基的50毫升圆锥管中（RP10：RPMI1640补充了青霉素，链霉素蛋白和10％胎儿牛血清（FBS） ，并保持在4°C下。根据参考文献改编的优化协议，在收集后的1-4小时内处理样品 。53。简而言之
，使用手术刀将组织块切成小块，并与胶原酶II（Sigma-Aldrich ，0.7 mg ML-1）和DNase（5 U ML-1）在RPMI1640中与7.5％FBS中的DNase（5 U ML-1）一起孵育
，根据样品尺寸，将30-45 FBS孵育
。随后 ，任何剩余的组织碎片都会通过重复重悬于30 ml注射器上
，并用大孔尖端（16×1.5钝）机械地破坏。使用70μm细胞滤网对细胞悬浮液进行过滤，并在RPMI1640中洗涤 ，并立即用于下游程序 。 　　根据制造商方案
，在ACD管中收集外周血样品（1-10 mL），然后使用隔离管（Stemcell Technologies ，85450）和淋巴管（Stemcell Technologies
，85450）（Stemcell Technologies，85450）（Stem Cell Technologies ，07851）收集
。简而言之，将全血样品在400g下离心10分钟
，并分别收集血浆上清液，并在-80°C立即冷冻。将剩余的细胞重悬于30 mL PBS中 ，并在坟墓管中的13.5 mL淋巴结杆上移液器 。在1,200克离心16分钟后
，将上清液中的单核细胞分数倒入新鲜的50毫升管中，用PBS洗涤 ，并立即用于下游程序
。对于来自牙科手术患者的血液样本
，使用ACK-赖以散热器缓冲液（Thermo Fisher，A10492-01）裂解红细胞 ，其余的白细胞直接用于下游染色。 　　如果需要
，使用90％FBS/10％DMSO混合物或细胞培养培养基（Gibco，12648010）将从组织样品或外周血中分离出来 ，并存储在液氮中
，直到用于下游程序 。 　　对于流式细胞仪分析，按照流式细胞仪的使用指南中概述了良好的实践54和数据分析的共识建议55
。直接在隔离或解冻后 ，将细胞与FC阻断试剂（Biolegend Trustain FCX，422302）和PBS（Gibco
，14190250）中的可固定UV Blue Live/Dead试剂（Thermofisher，L34961）一起孵育15分钟。此后 ，将细胞在室温下与50μl的总体积抗体大师混合物在亮染色缓冲液（BD Biosciences
，563794）中孵育20分钟，然后在荧光激活的细胞分选（FACS）缓冲液中进行两次洗涤（PBS为2％FBS） 。所有抗体均滴定并在最佳稀释度下使用 ，并在96孔圆底板中进行染色程序（用于在5-mL聚苯乙烯管中进行细胞分选）
。A detailed list of the main panels used, including fluorochromes, antibody catalogue numbers and final dilutions is provided in Supplementary Table 2 (panels designed according to best practices as described56) and Supplementary Table 3. For sorting, cells were immediately used after staining, and for analysis, the stained cells were fixed with 4% PFA (Cytofix/Cytoperm, BD Biosciences, 554722) for 20 min at room温度
，洗涤，重悬于FACS缓冲液中 ，并在黑暗中储存在4°C
，直至采集。If necessary, intracellular (CD68, granzyme B (GZMB) or CTLA4) or intranuclear staining (FOXP3, KI67, TCF1, TOX, T-bet or EOMES) was performed following the appropriate manufacturer protocols (eBioscience FOXP3/Transcription Factor Staining Buffer Set, Thermo Fisher 00-5532-00). 　　使用抗体捕获珠（BD Biosciences抗小鼠（552843）或抗小鼠Plus以及在FACS缓冲液中稀释的抗鼠或抗鼠（552844））的抗体捕获珠（BD Biosciences抗小鼠（552843）或抗小鼠Plus（552844））在每个实验中制备单染色对照，或在活/死试剂中稀释 ，并与样品（包括固定程序）完全相同 。对于实验样品的每种染色
，将来自同一健康供体（SAC）的PBMC样品用与纵向参考对照相同的面板染色（数据未显示）。 　　所有样品均使用FACSymphony A5（BD Biosciences）获取，配备30探测器和355 nm（65 mW） ，405 nm（200 mW），488 nm（200 mW）
，532 nm（200 mW）（200 mW）（200 mW）和628 nm（200 mW）lasers and faceSdiva Ceceritiencentiences（200 mW）和faceSdiva Caperiatienciencences（bd bid）（BD）（BD）
。所用仪器的光学配置的完整详细信息如下所述。使用改良的电压滴定方法优化探测器电压57，并使用MFI目标值和6峰超彩虹珠56（Spherotec ，URCP-38-2K）每天标准化 。获取后
，以FCS 3.1格式导出数据，并使用FlowJo（版本10.6.x和10.7.x ，BD Biosciences）进行分析
。使用手动门控和计算分析方法的组合分析了样品55
，而Doublets被FSC-A与FSC-H门控排除。对于在T细胞或APC面板的不同实验日获得的新鲜样品，将文件作为补偿数据导出 ，并在新工作区中进行分析（请参阅www.flowrepository.org上的存储数据） 。在所有样品中
，除了种群的密度分布的变化清楚地表明需要特定于样本的调整，大门都保持不变
。对于APC面板 ，由于某些样品中高度自动荧光的髓样细胞的干扰或高变异性
，将PD-L1（V450通道）以及CD85K（V510通道）排除在分析之外。对于T细胞面板，颗粒酶B和TIM3染色显示强度特定的供体特异性转移 ，需要特定于样品的门 。 　　All cell sorting was performed either on a FACSAria III (BD Biosciences), equipped with 20 detectors and 405 nm, 488 nm, 532 nm and 628 nm lasers or on a FACSymphony S6 cell sorter (BD Biosciences), equipped with 50 detectors and 355 nm, 405 nm, 488 nm, 532 nm and 628 nm激光
。对于涉及髓样细胞的各种类型，使用了在45 psi鞘压力下操作的85μm喷嘴
，用于专门针对T细胞，使用70-μm喷嘴在70 psi鞘压力下。除非另有说明 ，否则将细胞分类为含有500-1,000μl完整rpmi的冷藏eppendorf管
，在PBS中洗一次，并立即用于随后的处理 。 　　使用10倍基因组铬单细胞3'试剂盒V2协议或V3方案或使用10倍基因组铬单细胞5'试剂盒V1方案生成cDNA文库（请参阅补充表1）
。简而言之 ，使用铬控制器（10X基因组学）将分类单细胞与条形码凝胶珠和逆转录酶混合物分离为油乳液液滴。在这些液滴中产生cDNA
，然后分离液滴 。使用Dynabeads Myone硅烷磁珠（Thermofisher，370002d）纯化cDNA。使用PCR（10个循环）使用铬单细胞3'试剂试剂盒V2或V3（10x基因组）或VDJ和GEX试剂盒V1中的试剂进行cDNA扩增（请参阅补充表1中的样品列表）
。根据各自的方案 ，使用Spriselect磁珠（Beckman Coulter）纯化扩增的cDNA。在图书馆构造之前选择cDNA酶碎片
，并选择了大小 。图书馆是通过执行终端修复，A量表 ，适配器连接和PCR（12个周期）来构建的
。通过使用高灵敏度D5000屏幕截图（Agilent）的Agilent 2200贴纸来评估库的质量。通过使用Illumina Truseq（Biorad
，1863040）的数字液滴PCR（DDPCR）进行数字液滴PCR（DDPCR）评估库数量，或用DSDNA HS分析（Q32851）确定的Qubit 。将汇总的文库稀释至2 nm或3 nm ，并在HISEQ 2500（Illumina）或Novaseq 6000（Illumina）上使用S1或S2流动池进行了配对末端测序，靶向每个细胞的25,000–50,000次读取
。 　　如在详细信息中所述生成cDNA库58。In brief, after sorting, single cells were stained with Sample-Tag antibodies (if required, see Extended Data Fig. 8a) and or AbSeq antibodies (if required), washed three times, pooled and counted and subsequently loaded onto a nano-well cartridge (BD Rhapsody), lysed inside the wells followed by mRNA capture on cell capture beads according to manufacturer instructions58.在进行逆转录和用外切核酸酶进行逆转录和处理之前
，检索并洗涤细胞捕获珠 。使用人类免疫反应面板引物和定制补充面板进行了靶向扩增（补充表3中列出）（10–11循环）
。纯化PCR产物，并使用Spriselect磁珠（Beckman Coulter）将带有双面尺寸选择的样品标签（和ABSEQ）分离mRNA PCR产物。使用PCR（十个周期）进一步扩增mRNA和样品标签产物 。然后使用Spriselect磁珠纯化PCR产物
。PCR产物的质量是通过使用Fred Hutch Genomics共享资源实验室中具有高灵敏度D5000屏幕截图（Agilent）的Agilent 2200贴纸来确定的。PCR产物的量通过Qubit DsDNA HS分析（Q32851）确定 。将靶向的mRNA产物稀释至2.5ngμl -1 ，并将样品标签和ABSEQ PCR产物稀释至1ngμl -1以制备最终文库。最终文库使用PCR（6个周期）进行索引
。使用Spriselect磁珠纯化索引PCR产物。通过使用高灵敏度D5000屏幕截图的Agilent 2200挂接评估所有最终文库的质量
，并使用Qubit荧光计使用Qubit DSDNA HS Kit（Thermofisher）进行定量 。将最终文库稀释至3 nm，并使用S1和S2流细胞在Novaseq 6000（Illumina）上进行配对端（100 bp）测序
。对于基因表达库 ， 我们针对每个单元格的5,000–20,000个读取
，对于每个单元格的Abseq库10,000–15,000读，对于样本标签库 ，每个单元格500–2,000读。 　　如上所述
，从组织或血液中分离细胞 。对于某些刺激测定，在评估良好的细胞活力后使用了冷冻保存的细胞悬浮液
。在使用靶向转录组学的2小时短期刺激测定中（图4） ，使用BD FACSARIA II分离了CD3+ T细胞（Live CD45+ CD19-CD3+事件）。将五千个细胞放入具有200μl完整培养基的V底96孔板的每个孔中 。然后将细胞未经治疗（对照）或用IL-12
，IL-15和IL-18（每个在1 nm）或PMA（50 ng ml-1）和离子霉素（500 ng ml-1）在37°C下刺激细胞
。然后用1×PBS洗涤细胞，并制备用于靶向转录组学 ，并用寡核苷酸偶联的抗体进行染色，如所述58。对于为期1至3天的刺激测定（图4
，扩展数据），CD4+CD25+CD127-IL1R1+和IL1R1- TREG细胞从血液和HNSCC组织中分离出Facsymymphony s6 Sorter（BD Biosciences）（BD Biosciencence） ，并与RP10单独培养
，并与Anti-Cd3/cdi-cd3 dydane一起培养 。11161D, used at a 1:1 bead-to-cell ratio) or with anti-CD3/CD28/CD2 beads (Miltenyi, 130-092-909, Treg Suppression Inspector, also used at a 1:1 bead-to-cell ratio), either with or without recombinant IL-1β (Peprotech, 200-01B) at 50 ng ml−1.对于某些实验，随后对培养细胞进行染色 ，并在BD S6分散器上对250-500个活细胞进行排序
，然后使用SMART-SEQ V4 KIT（TAKARA）（TAKARA）进行散装RNA - 序列（RNA-SEQ）分析，如下所述
。 　　为了抑制测定 ，将IL1R1+和IL1R1 -CD4+CD25+CD127-调节性T细胞和CD4+CD25-和CD8+TRESP细胞从冷冻保存的HNSCC样品中分类。对于某些实验
，包括匹配的外周血 。根据制造商的说明（Thermo Fisher，C34571） ，将侵入细胞用细胞痕量紫罗兰（CTV）标记。简而言之
，排序后用PBS洗涤106个排序的侵入细胞，然后在含有最终浓度的5 µM新鲜稀释CTV的预热PBS中孵育15分钟
。用预热的RP10淬灭反应。在Biorad TC20细胞计数器上对Tresp和Treg细胞进行了两次计数 。单独培养10,000个CTV标记的侵入细胞 ，或在37°C的96孔圆底板中与10,000个Treg细胞（或滴定量的Treg细胞）一起培养4天，持续4天
，以及抗CD3/CD28/CD2珠（Miltenyi，130-092-92-92-92-92-90909 ，TREG SESSICTOR）
。每个实验都包括一个未刺激的控制井。在指示的情况下
，添加重组IL-1β（Peprotech，200-01b）以达到50 ng ml-1的最终浓度 。在读出的那天 ，收集上清液并在-80°C下冷冻
，并用14色读数面板染色，包括活/死试剂（补充表2） ，固定并在BD Facsymphony A5上获得并获得
。通过使用FlowJo 10.7（BD生物科学）中的增殖平台评估细胞增殖
，其中分裂的细胞（建模，不是门控）作为主要读数。通过弗雷德·哈钦森癌症研究中心的免疫监测核心处理上清液进行Luminex分析 。 　　对组织的裂解物进行了Luminex分析
。为了从肿瘤组织中获得裂解物 ，将2×2 mm的碎片在PBS/0.1％Tween中孵育一分钟。孵育后
，将组织块切碎在缓冲液中，然后以10,000 rpm离心5分钟 。收集上清液 ，立即在干冰上闪烁
。Luminex的处理是由Fred Hutchinson Cancer Research Center的免疫监测核心进行的。 　　小鼠方案通过弗雷德·哈钦森癌症研究中心的IACUC的伦理法规批准并遵守 。所有动物均维持在特定的无病原体设施中，并根据机构方案进行安乐死。我们从雄性FOX3EGFP-CRE-CRE-ERT2小鼠（≥8周）（来自J. Lund）（来自J. Lund）的胸腺
，脾和淋巴结（LN），并通过70-M滤波器机械解散的胸腺 ，脾或淋巴结
。为了富含脾淋巴结单细胞悬浮液中的T细胞
，我们使用了基于T细胞阴性的磁富集（Stemcell Technologies）。对于TCR刺激，我们通过将96孔V底组织培养板与100 µL的1 µg ML-1抗CD3（克隆：145-2C11）和2 µg ML-ML-1抗CD28（克隆37.51）中的1 µg Ml-1抗CD3（克隆：145-2C11）和1×PPBS孵育 ，制备了板块结合的抗CD3和抗CD28 。我们在96孔V底组织培养板中倒下并洗涤了残留的抗CD3/抗CD28溶液
，并将每个孔中的1×106个分离的T细胞铺平
。我们在修饰的RP10培养基中培养细胞（RPMI1640，补充了10％FBS ，2mm-谷氨酰胺
，100 U ML-1青霉素 - 链霉素，1 mM丙酮酸钠 ，0.05 mMβ-苯甲醇和1 mM Hepes）。我们收集了在0-、1-和2天的时间点进行流动细胞术分析的细胞进行流动分析
，如上所述 。使用了以下面板：抗TCRγδ-PERCPE710（克隆EBIOGL3），抗CD4 – BV786（克隆GK1.5） ，抗CD8A – V500（克隆53-6.7），抗CD44-AF700（抗CD44-AF700）anti-PD-1–BV605 (clone 28F.1A12), anti-ICOS–AF647 (clone C398.4A), anti-IL1R1–PE (clone 35F5), anti-IL1R2–BV421 (clone 4E2), anti-CD3–BUV805 (clone 17A2) and anti-FOXP3–FITC (cloneFJK-16
，核内固定后）
。 　　先前报道了Mistrg小鼠（M-CSFH/HIL-3/GM-CSFH/HSIRPαH/MTPOH/HRAG2 - / - IL2Rγ - / - ）。所有动物实验均由Fred Hutchinson癌症研究中心的机构动物护理和使用委员会（协议50941）批准 。先进的生物科学资源通过捐助者的知情同意而获得的鉴定的人类胎儿肝组织，由弗雷德·哈奇（Fred Hutch）的机构审查委员会（6007-827）确定为非人类学科研究
。将胎儿肝脏切成小片段 ，在37°C下用胶原酶D（Roche
，100 ng ml-1）处理45分钟，并制备单细胞悬浮液。通过在淋巴细胞分离培养基（MP生物医学）中通过密度梯度离心富含造血细胞 ，然后使用抗人CD34微粒（Miltenyi Biotec）进行阳性免疫磁磁选择 。通过流式细胞仪证实纯度（> 90％CD34+细胞）
，并在含有10％DMSO的FBS中冷冻细胞在-80°C下冷冻
。新生儿Mistrg小鼠（第1-3天）在caesium-137辐射器中被辐照（80 CGY Gamma射线），在20μlPBS中 ，用22-auge针（Hamilton Company）将20μlPBS中的20,000 CD34+细胞注射到肝脏中。植入水平被测量为血液中总（小鼠和人组合）CD45+细胞中人类CD45+细胞的百分比 。 　　获得了人类鳞状细胞癌系SCC-15并从ATCC验证。在补充有12.5 mM-谷氨酰胺
，15 mM肝素，0.5 mM丙酮酸钠和400 ng ML -1氢化可的松的DMEM/F12中 ，细胞的汇合度生长至80％
。将每只小鼠大约50万个细胞重悬于75 µL PBS中
，与25 µL生长因素减少的Matrigel（Corning，354230）混合 ，然后在人性化小鼠侧面的麻醉下皮下注射。每周用卡尺测量肿瘤的大小7周 。如上所述，对SCC15肿瘤组织进行了白细胞分离
。 　　在250种排序纯化的IL1R1+和IL1-R1- treg细胞上进行大量RNA-SEQ在没有刺激的情况下培养后
，培养后，从冷冻保存的血液或HNSCC组织样品中得出的抗CD3/CD28/CD2珠刺激 ，并用抗CD3/CD28/CD28/CD2 BEADS刺激（5）
，总共进行了88个样品，每个条件至少由3个或更多的生物学重复表示。 　　将细胞直接从Smart-Seq V4超低输入RNA试剂盒中直接分类为裂解缓冲液进行测序（Takara） ，立即在干冰上冻结
，并转移至-80°C的存储空间，直到加工到cDNA中 。将所有样品解冻 ，裂解细胞
，并根据制造商的指导合成并放大cDNA
。放大后，使用具有独特的双索引（Illumina）的Nexteraxt DNA样品制备试剂盒构建了测序文库 ，以生成兼容Illumina兼容的条形码库。使用量子荧光计（Life Technologies）汇总并量化库 。使用NextSeq P2测序试剂盒（Illumina）
，在NextSeq 2000 Suequencer（Illumina）上进行了合并库的测序，其目标深度为500万个读取
。 　　将基本呼叫处理到Basespace（Illumina）上的FASTQ ，并应用了基本的呼叫质量调整步骤，以从读取的末端从读取端删除低信任基础呼叫。使用Galaxy平台上管理的工作流程处理读数 。在3'端将读数通过1个底座修剪
，然后从两端修剪直到基本调用的最低质量得分至少为30
。为了使修剪的读数对齐，将Star Aligner（v2.4.2a）与GRCH38参考基因组和Ensembl版本发行91的基因注释一起使用。使用HTSEQ-Count（V0.4.1）生成基因计数 。质量指标是根据PICARD（V1.134） ，FASTQC（v0.11.3）
，Samtools（v1.2）和HTSEQ-Count（V0.4.1）编辑的。 　　将质量过滤器应用于保留库中，其中与总FASTQ读数相比 ，所检查的对齐读数的一部分> 70％
，覆盖范围的中位数差异小于0.85，并且该库至少有100万个读数
。所有测序样品都通过了这些质量过滤器。在少于10％的样品中以每百万分的少于1计的非蛋白质编码基因和基因被过滤掉 。使用TMM算法对表达计数进行标准化
。对于差异基因表达分析 ，使用了VOOM转换后的微阵列数据（Limma）R包的线性模型；这种方法要么胜过表现
，要么与其他已发表的方法一致。生成线性模型，并将捐赠者身份作为随机效应包括在内 。对于差异基因表达比较 ，假发现率（FDR）小于0.1且绝对表达折叠变化大于1的基因被认为是差异表达的
。 　　将原始基础调用（BCL）文件解开以使用Cell Ranger MKFASTQ管道（10倍基因组学）中的Cell Ranger MKFASTQ管道生成FASTQ文件。使用标准单元格ranger管道（10倍基因组学）在Cell Ranger 2.1.1或Cell Ranger 3.0.2中处理全转录FASTQ文件 。简而言之
，细胞游舱计数执行读取，过滤 ，条形码和唯一分子标识符（UMI）计数，并确定推定细胞
。然后
，使用如下所述的包装Seurat60,61（3.0）在R中分析了细胞游舱（每个细胞计数矩阵的分子）的最终输出。对于有针对性的转录组学数据，FASTQ文件是通过七个桥梁（www.sevenbridges.com）上的标准狂想曲分析管道（BD Biosciences）处理的 。简而言之 ，在读取过滤后
，将读取与参考基因组和注释，对条形码和UMIS进行计数 ，然后确定推定的细胞
。如下所述
，还使用SEURAT60,61（版本3.0）在R中分析了最终输出（每个细胞计数矩阵）。对于5'VDJ测序实验，使用Loupe VDJ浏览器V3（10X基因组学）分析了细胞Ranger VDJ后的输出 。对于Smart-Seq V4实验 ，如上所述
，将FASTQ文件与GRCH38参考基因组对齐。 　　R软件包SEURAT60,61用于所有下游分析，并根据以下一般指南进行自定义脚本 ，用于分析SCRNA-SEQ DATA62
。 　　简而言之
，对于全转录组数据，只有至少具有200个基因（V2套件）或800个基因（V3试剂盒）的细胞 ，并且根据样品分布小于7-15％的线粒体基因的细胞被包括在分析中。将所有获得的样品合并为一个单一的seurat对象，然后使用10,000的比例因子
，使用VST方法确定可变基因的自然对数归一化，以及z得分缩放 。主成分分析用于生成75个主要组件 ，然后使用Harmony30进行数据集成
。和谐产生的降低降低用于计算UMAP
，并以0.2和0.6的分辨率为基础聚类。对于细胞注释，我们将Singler应用于纯粹的数据驱动的方法32 ，并使用典型谱系转录本的表达来验证细胞标记注释 。对于所有随后的分析步骤
，将集成的seurat对象分别分成两个包含所有T单元或所有APC的对象，并重复了UMAP计算以及聚类步骤
。 　　对于靶向转录组学数据36 ，合并了与同一实验的单独墨盒（如果适用的话）
，并且只有至少30个基因的细胞包含在下游分析中。在生成seurat对象后，使用10,000的比例因子进行了自然对数归一化 ，然后使用VST方法确定可变基因
，并进行z得分缩放 。主成分分析用于生成75个主要组件，然后使用Harmony30进行数据集成
。和谐降低的尺寸降低用于随后的UMAP计算和基于图的聚类 ，并通过调整分辨率进行了集群。如Seurat教程中所述，蛋白质表型数据存储在一个单独的插槽中
，用于Cite-Seq数据，并使用中心对数比（CLR）方法进行标准化 。对于某些数字 ，计数矩阵使用软件包Prepessa作为FCS文件导出
，然后进口到FlowJo 10.7.x.以通道特异性的方式应用了适当的Arcsinh转换，并使用二维图绘制并定量转录本或蛋白质表达
。 　　对于所有差异基因表达分析 ，我们利用了Model34中桅杆（基于模型的基于模型的单细胞转录组分析）的SEURAT实现（基于模型的单细胞转录组分析）
，其数量为协变量（代理细胞检测率（CDR））。为了计算T辅助得分（扩展数据图5F，G） ，我们使用了Seurat的AddModulesCore函数（请参阅https://github.com/mairflo/tumflo/tumor_vs_inflame/blob/blob/main/main/main/om_hhnscc_scrnaseq_scrnaseq_harmony上的github脚本） 。所使用的基因如下：TH1：IFNG
，TBX21，IL12RB1和IL12RB2；TH2：TNFSF11 ，GATA3和IL4；TH17：RORC
，CCR6，IL17A ，IL17F，IL23R
，IL22，AHR ，IL26
，CCL20;TC：CD8B，CD8A ，TNF
，IFNG，IL2 ，GZMB
，PRF1，GZMA和FAS。TEX：TCF7 ，TOX
，HAVCR2，PDCD1和LAG3；Treg：Foxp3 ，CTLA4，IL2RA
，IL2RB和ENTPD1
。 　　Nichenet分析是根据https://github.com/saeyslab/nichenetr35所述的小插图进行了改编的。简而言之，将包含APC的单独的seurat对象（如上所述）被子集仅包含HNSCC衍生的细胞 ，而仅包含T细胞的Seurat对象仅包含HNSCC和OM衍生的细胞 。在多个单独的NICHENET运行中
，将不同的T细胞子集设置为“接收器 ”（即CD4非Treg簇0和2，CD8 T细胞簇1 、3和4和Treg cluster 5; Treg cluster 5;扩展数据图5A）和所有髓样细胞簇（PDC和MAST Cell cluster;除了PDC和Mast Cell;图2B;图2B;图2B;图2B;图2B;图2B）as senderer'spersivates》中
。对于接收器细胞群 ，进行了一次DEG测试
，以找到富含HNSCC与OM样品的基因，其关键参数设置为如下：基因在至少10％的T细胞簇的细胞中表达 ，并且在各自的T细胞簇的细胞中表达
，并且在调整后的p值折叠的调整p值小于0.05和平均0.05和平均0.05和0.05和0.25的调整测试后进行过滤。对于发送细胞群，考虑了在相应APC簇中至少5％的细胞中表达的所有配体 。基于小插图进行NICHENET分析以推断受体 ，过滤以进行记录的链接
，并为各个细胞种群生成顶部配体 - 受体相互作用的马戏团图
。如Nichenet小插图中所述，预测目标的评分基于Pearson相关系数。如Vignette35中所述 ，生成了Circos图，以可视化APC上的配体和T细胞子集的受体之间的联系 。 　　对于T细胞面板
，使用浮士德在22个样品（11 HNSCC和11 OM）中发现和注释表型
。浮士德应用于通过手动门鉴定的CD45+活淋巴细胞。MR1 – Tetramer，CD45和Live/Dead Marker被排除在浮士德分析之外 ，以说明手动分析 。调整后
，浮士德选择了标记CD8，CD4 ，CD3
，CD45RA，CD27 ，CD19
，CD19，CD69 ，CD69
，CD28，HLADR ，GZMB，PD-1
，CD25，ICOS ，ICOS
，TCRγδ，CD38和TIM3 ，用于发现和注释现象的发现和注释
。使用具有受试者水平随机效应的二项式通用线性混合效应模型测试了标记为CD3+和CD19-的发现的表型的计数。在FDR调整的0.05水平下
，五十种表型与组织类型有关 。 　　对于APC面板，浮士德被用来发现和注释32个样品（16 HNSCC和16 OM）中的表型。Faust应用于通过手动门控鉴定的CD45+ Live CD19 -CD3-细胞
。标记CD3 ，CD19
，CD45，PD-L2和CD85K以及Live/Dead Marker被排除在FAST分析中 ，以说明手动分析
，并在用于PD-L2和CD85K的检测器中观察到的自动荧光。After tuning, FAUST selected the markers CD1c, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD32, CD38, CD40, CD68, CD80, CD86, CD123, CD141, CD163, CD206, CX3CR1, HLADR, PDL1 and SIRPA for discovery and annotation of phenotypes.使用具有受试者水平随机效应的二项式通用线性混合效应模型，对被注释为HLADR+的发现的表型的计数与组织类型进行了测试 。在FDR调整的0.05水平下 ，21种表型与组织类型相关
。 　　除非另有说明，否则所有数据均表示为平均值±S.D。使用Tukey的多重比较测试
，使用单向方差分析进行了血液，OM和HNSCC样品之间的统计分析 。p值完全显示 ，除非小于0.0001
。使用GraphPad Prism（V9）进行统计分析。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得 。