Rosa26-YFP48 ，Rosa-TDOMATO49，K14CREER
，LGR5CREER（参考50），KraslSlg12d（参考51）和Trp53fl/fl（参考文献52）是从NCI小鼠重建库中获得的。Rhojfl/FL小鼠53是A. Uemura的礼物 。这项研究中使用的所有小鼠均由男性和具有混合遗传背景的女性组成。根据欧洲准则 ，将小鼠菌落维持在经过认证的动物设施中
。室温范围为20°C至25°C。小鼠笼中的相对环境湿度为55±15％ 。每个笼子都配有食物
，水和两种类型的筑巢材料
。使用了12 h – 12 h的光周期的半天然光周期。所有实验均由动物福利伦理委员会批准（委员会D’Ethique et du Bien etre Animal，Cebea ，Cebea
，医学院，Libre de Bruxelles大学医学院 ，参考号434n和663n） 。根据方案434N和663N确定涉及小鼠的实验的样本量
，指出在每个实验中可重复的结果后，应立即将用于实验的小鼠的数量降低至最小值
。 　　在葵花籽油（Sigma-Aldrich）中以25 mg ml-1稀释他莫昔芬。如前所述52,54 ，在腹膜内腹膜内腹膜内腹膜内4天进行4天的腹膜内4天进行4天的腹膜内4天 。 　　通过每日观察和触诊检测到肿瘤的外观和大小
。当肿瘤大小达到直径超过1 cm时
，或者当小鼠出现遇到迹象或按照我们的IACUC所允许的初始体重的15％以上时，将小鼠安乐死。在任何实验中 ，这些限制均未超过 。使用精确的调速器测量皮肤肿瘤，使我们能够区分大于0.1 mm的尺寸修饰
。在肿瘤出现的第一天测量肿瘤体积
，然后每周使用公式V = D×D×H×π/6，直到动物死亡 ，其中D是次要肿瘤轴
，D是主要的肿瘤轴，H是高度。在WT（LGR5CREERKRASG12DP53CKOROSA-YFP）或RHOJ-KO（lgr5creerkrasg12dp53ckorhojckorososa-yfp）中 ，未观察到宏观或微观肠道肿瘤 。 　　将FACS分离的肿瘤YFP+EPCAM+或YFP+EPCAM-细胞在六孔板中的γ辐射的3T3进料细胞上铺板。将细胞培养在补充有10％胎牛血清（FBS）
，0.4 mg ML -1氢化可的松，2×10-9 M T3的MEM培养基中 ，1％青霉素 - 链霉素和2 mM-谷氨酰胺
。使用PBS/EDTA（1毫米）去除馈线。将细胞与20％O2和5％CO2在37°C下孵育 。 　　MDA-MB-231细胞系（ATCC HTB-26）在Dulbecco改良的Eagle的培养基中生长
，并补充了10％FBS和1％青霉素 - 链霉素
。将细胞与20％O2和5％CO2在37°C下孵育。根据ICLAC注册版本，本研究中未使用普遍误识的细胞系 。所有细胞系均已测试对支原体污染的阴性
。 　　用每公斤3.5毫克的二氨基铂（顺铂）（Sigma-Aldrich ，p4394）和每公斤5FU（Sigma-Aldrich
，F6627）治疗小鼠。对于原发性小鼠模型的体内研究，根据其正确的基因型选择动物 。在出生后28-35天用他莫昔芬注射诱导小鼠 ，并在2-3个月内出现肿瘤，从而最大程度地减少了所使用的不同动物的年龄差异
。当肿瘤大小达到2-5 mm3时
，用化学疗法对腹膜内注射的化学疗法进行治疗。将它们的肿瘤与注射生理血清相同基因型的小鼠中发育的肿瘤进行了比较 。 　　将小鼠肿瘤细胞铺在六孔板上
。对于辐照，从137CS来源以2.34 Gy Min -1的剂量速率从137CS来源传递了10 Gy辐射。剂量给药后24小时收集细胞 。For the chemotherapy, cells were incubated with 8.5 µM cisplatin (Sigma-Aldrich, P4394), 15 µM 5FU (Sigma-Aldrich, F6627), 0.4 µM gemcitabine (Sigma-Aldrich, G6423), 200 nM paclitaxel (Sigma-Aldrich, T7402) and 0.25 µM阿霉素（Sigma-Aldrich ，D1515）
，1 µm拓扑替克（Sigma-Aldrich，T2705） ，25 µm依托泊苷（Sigma-Aldrich
，E1383）。对于抑制剂，将细胞与50 µM蚜虫（Santa Cruz ，SC-201535A）
，50 µm mirin（SelleckChem，S8096） ，1 µm VE-821抑制剂（SelleckChem
，S8007），5 µM Ku60019（SelleckChem ，SelleckChem，S1570
，S1570，S1570 ，S1570
，S1570）一起孵育（Sigma-Aldrich，L5288） ，5 µM Wiskostatin（Sigma-Aldrich
，W2270），50 µM CK666（Sigma-Aldrich ，SML0006）和50 µM Smifh2（Sigma-Aldrich
，S4826），在该图中指出
。在实验期间以及进行样品分析 ，成像和定量时
，研究人员对小鼠和细胞系基因型或治疗条件视而不见。 　　进行了刮擦测定，以评估Rhoj KD对Epcam-肿瘤细胞迁移的影响 。这些细胞在培养物中生长在48孔板中
。在汇合时 ，将细胞饥饿（1％FBS培养基）持续24小时，然后消除产生无细胞间隙的培养物插入。接下来
，用PBS将细胞洗涤两次，并在1％FBS培养基中重新孵育 。为了评估伤口闭合 ，使用ImageJ处理图片
。 　　为了进行增殖
，首先将细胞接种在96孔板中。孵育后，用PBS将细胞洗涤两次 ，并在图中所述的不同时间点上用1％的戊二醛固定 。然后使用0.2％晶体紫溶液对染色进行染色
，并使用Triton X-100透化细胞
。在微板读取器上，在570 nm的570 nm读取每个井的吸光度。通过在每个时间点的吸光度与井在第0天的平均吸光度的吸光度之比测量细胞生长 。 　　为了测试Rhoj-wt和Rhoj-ko Epcam-肿瘤细胞对化疗的长期反应 ，我们在4°C培养基中收集后
，皮下注射1,000个细胞在裸鼠中，并重悬于中等/一半的Matrigel中（E1270 ，970 mg ml-1; sigma-aldrich）
。当小鼠发生明显的肿瘤时
，每周用3.5 mg顺铂和每千克5FU进行治疗，如上所述。小鼠随后进行每日观察和体重测量 ，每周监测肿瘤的大小 。 　　使用标准方法对HA标记的RhoJ进行共免疫沉淀，并调整先前描述的方案55。In brief, after three washes in ice-cold Tris-buffered saline, cells were collected on ice by scraping in lysis buffer (150 mM NaCl, 50 mM HEPES pH 7.5, 2 mM EDTA, 10% glycerol, 1 mM β-mercaptoethanol, 1% Triton X-100, protease inhibitor cocktail (11836170001, Roche) and phosphatase抑制剂鸡尾酒2（Sigma-Aldrich
，p5726）），涡旋3次30 s ，介于两者之间2分钟
，然后在13,000 rpm下离心15分钟
。我们使用Bradford分析评估了每个样品的总蛋白质含量，并在每种免疫沉淀中使用1 mg蛋白质。将抗体（6 µg;兔IgG对照芯片级 ，AB171870
，ABCAM；兔IPO9，A305-475A ，贝特基实验室）与1 mg的1 mg预溶液裂解液在4°C下在恒定旋转下在4°C下孵育过夜 。随后
，加入25μlDynabeads蛋白G（10003D，Thermo Fisher Scientific）并在4°C下旋转4 h
。在800 µL NetN缓冲液（20毫米Tris（pH 8） ，1 mM EDTA
，900 mM NaCl，0.5％CA-630）中洗涤Dynabeads ，在4°C下旋转5分钟。将洗涤物重复五次，最后用1 mL DPB冲洗Dynabeads
，然后在95°C下用40 µL 1×SDS凝胶加载缓冲液洗脱5分钟 。使用小鼠抗HA抗体（AB1424，ABCAM） ，使用26 µL洗脱样品进行蛋白质印迹
。 　　For analyses using liquid chromatography coupled with tandem MS (LC–MS/MS), the lysates were not precleared and the Dynabeads were washed once in wash buffer (150 mM NaCl, 50 mM HEPES pH 7.5, 2 mM EDTA, 10% glycerol, 1 mM β-mercaptoethanol, 0.1% Triton X-100, protease inhibitor cocktail and磷酸酶抑制剂鸡尾酒）随后在冷冻之前在MS兼容的缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.0
，2 mm CaCl2）中进行了三次洗涤。 　　为了使冷冻切片的免疫染色，将皮肤肿瘤嵌入最佳切割温度化合物（OCT ，樱花）中
，并使用CM3050S Leica低温固醇（Leica Microsystems）切成5 µm冷冻切片，在4％Paraformaldehyde中以4％的速度固定在4％的室温下 ，并在4％的室温下进行4％的perscrive
，并在室温下进行4％，并在4％的室温下 ，并在4％的时间内inccrive in Incrive in 4％
，并在pbs in in in Incrive in 4％ 。The sections were blocked using blocking buffer for 1 h (PBS, 5% horse serum, 1% BSA, Triton 0.1%) and then incubated with primary antibodies diluted in blocking buffer overnight at 4 °C, washed three times with PBS for 5 min, and then incubated with Hoechst solution and secondary antibodies diluted in blocking buffer for 1 h at room temperature.最后，将切片用PBS在室温下5分钟洗涤3次 ，并安装在补充2.5％Dabco（Sigma-Aldrich）的Dako安装培养基中
。在石蜡切片上进行了血竭蛋白和曙红染色，将5 µm的石蜡切片脱蜡并再合化。使用Safemount（Labonord）安装幻灯片 。为了对培养细胞进行免疫染色
，将细胞铺在盖玻片上，并在镀细胞后用4％多聚甲醛固定48小时48小时
。对于DDR核重点检测 ，将盖玻片用4％多聚甲醛固定5分钟
，在洗涤后，在70％乙醇中在-20°C下在70％乙醇中孵育20分钟 ，用于γ-H2AX和53BP1染色
，或在甲醇中，在-20°C下在-20°C下在甲醇中孵育20分钟。 　　通过在室温下用5％马血清 ，1％BSA和0.2％Triton X-100阻断非特异性抗体结合 。当使用小鼠初级抗体时
，使用M.O.M.进行非特异性抗原阻塞。根据制造商的指示，基本套件试剂（矢量实验室）
。然后将盖玻片在4°C的情况下孵育过夜 ，并在初级抗体的存在下孵育
，然后在室温下孵育1小时，然后在室温下孵育HOECHST溶液。使用补充2.5％Dabco（Sigma-Aldrich）的甘油（Dako）安装盖玻片 。对于F-肌动蛋白免疫荧光 ，对上述方案进行了以下修饰：将盖玻片与阻断溶液一起孵育30分钟，然后用杜鹃腓丁蛋白孵育30分钟
，并在洗涤后与Hoechst溶液一起孵育20分钟
。 　　使用Zeiss AxiooCam MRM相机进行免疫荧光和Zeiss Axiocam MRC5摄像机，在Zeiss Axio Imager M1（Thornwood）荧光显微镜上进行肿瘤组织的成像 ，使用Axiovision Release 4.6软件
，用于明亮场显微镜。使用ImageJ在每个肿瘤的四个不同场上进行KI-67阳性肿瘤细胞的定量 。使用×100物镜（alpha plan-fluar 1.4数值孔径油免疫物镜）提供的蔡司轴心成像仪获取细胞图片
。在整个核中以0.3 µM的间隔获取Z系列。使用Zen Blue 3.3（Zeiss）进行正交投影，以量化DNA破坏诱导的修复灶的数量 。使用ImageJ定量每个单元格中的焦点数
。为了确定RHOJ的核定位 ，使用Huygens Profordsion 22.04反卷积软件处理Z堆栈
，并使用全球交叉点系数来表征HA标记的Rhoj和Dapi信号之间的重叠程度。使用Photoshop CS6（Adobe）调整了亮度，对比度和图片大小 。 　　使用补充磷酸酶抑制剂（细胞信号 ，5870）的放射免疫沉淀试验制备总细胞裂解物
，在冰上持续15分钟，然后在14,000 rpm处离心15分钟
。使用布拉德福德测定法测量上清液的蛋白质浓度。将总蛋白质裂解物（30 µg）加载在凝胶上 。使用4–12％的Nupage Bis-Tris梯度凝胶（Invitrogen）进行凝胶电泳 ，转移到PVDF膜上。将膜在Tris缓冲盐水中阻塞1小时
，含有3％牛血清白蛋白（BSA）的0.1％Tween-20（TBST），然后在4°C的封闭缓冲液中与原代抗体孵育过夜
。在TBST洗涤后 ，将膜与二级抗体在阻塞缓冲液中孵育1小时。通过增强的化学发光（ECL）蛋白质印迹检测试剂（Amersham Biosciences）检测蛋白质 。 　　在37°C的2小时内在摇板上解剖，切碎并在胶原酶I（Sigma-Aldrich）中消化肿瘤
。通过添加EDTA（5 mM）阻止了胶原酶I活性
，然后将细胞在补充2％FBS的PBS中冲洗。在染色之前，将细胞在室温下在补充30％FBS的PBS中阻塞20分钟 。通过70 µM细胞过滤器（BD）过滤细胞悬浮液 ，然后通过40 µM细胞过滤器过滤
，以确保消除细胞碎屑和细胞团
。使用PE-偶联的抗CD45（30F11，1：100 ，eBioscience）
，Pe-偶联的抗CD31（MEC13.3; 1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：100，BD Pharmingen）和APC-Cy7-Cy7-偶联的抗EPCAM（g8.8; g8.8; g8.8; g8.1：1：100 ，Biolegend flund in 30 min）进行免疫染色。通过正向散射
，侧散射，双重歧视和Hoechst染料排除选择活肿瘤细胞 。根据YFP的表达和CD45 ，CD31（LIN-）的排除选择EPCAM+和EPCAM-肿瘤细胞
。对于Epcam-肿瘤细胞亚群的鉴定
，添加了亮紫色染色缓冲液（BD生物科学）（每个样品50 µL），并将细胞与PE偶联的抗CD51（大鼠 ，RMV-7，Biolegend 104106
，1：50），BV421-Conjugienianiience孵育（RMV-7 ，RMV-7
，RMV-7，Biolegend）。553345, 1:50), biotin-conjugated anti-CD106 (rat, 429 (MVCAM.A), BD Bioscience, 553331, 1:50), BV711-conjugated anti-EPCAM (rat, G8.8, BD Bioscience, 563134, 1:100, PerCPCy5.5 conjugated anti-CD45 (rat,30-F11 ，BD Bioscience
，550994，1：100）和Percpcy5.5偶联的抗CD31（大鼠 ，MEC13.3
，BD Bioscience，562861 ，1：100）在4°C下用2％FBS和pbs prectection pbs Bioscience洗过30分钟 。1：400）在4°C下进行30分钟
。。在培养基中收集分类的细胞进行细胞培养实验或裂解缓冲液进行RNA提取 。 　　在冷PBS中进行胰蛋白酶消化和洗涤一次后
，将细胞与APC-CY7偶联的抗EPMCAM（G8.8; 1：100，Biolegend）抗体在200 µL PBS中稀释 ，在200 µL PBS中稀释，在2％FBS中
，在固定步骤中，在固定步骤上 ，在摇摆不定的摇摆板上
，在4°C下在4°C下进行固定型静态蚂蚁，以进行固定的蚂蚁静脉内注射。为了检测细胞凋亡或双链DNA断裂 ，分别用PE抗活性caspase-3（BD Pharmingen
，550821，1:25）和PE抗H2AX（PS139）（BD Pharmingen ，562377
，1:20）使用PE抗活性caspase-3（BD Pharmingen，550821 ，1:25）标记
。制造商的协议并重悬于PBS中
，补充了2％FBS。为了进行细胞周期分布分析，将细胞与10 µM 5-Bromo-2'-脱氧尿苷（BRDU）孵育45分钟 。根据制造商的规程 ，使用BRDU流量试剂盒（BD Pharmigen，55789）
，将细胞与Alexa Fluor 647抗Brdu（BD Pharmingen，560209 ，1：50）抗体标记为抗体
，并根据制造商的方案进行了5分钟的20 µ-AAD，并在200 µl 7-aad中重悬于200 µl flbs中 ，以200 µl fbbs添加2％
。对于化学疗法敏感性测定
，将细胞在六孔板中以相等的密度播种。然后，播种后24小时 ，将细胞用化学疗法处理
，如图传说中所示 。接下来，在治疗开始后24小时和48小时 ，通过胰蛋白酶消化收集细胞
，并通过计算FACS的活细胞数量来量化细胞
。通过向前和侧散射以及Hoechst染料排除选择活细胞。FACS分析是使用Fortessa，FACSDIVA软件和Flowjo（BD Bioscience）进行的 。 　　For immunostaining, the following primary antibodies were used: goat GFP (Abcam, ab6673, 1:500), chicken K14 (Thermo Fisher Scientific, MA5-11599, 1:2,000), rabbit vimentin (Abcam, ab92547, 1:500), rabbit active caspase-3 (R&D, AF835, 1:600), rabbit 53bp1（Novus ，NB100-304，1：200）
，鼠标 - 磷酸 - 源H2A.X（SER139）（Millipore，05-636 ，1：500）
，鼠标RAD51（Santa-Cruz Biotechnology，SC-398587 ，1:50）
，1:50），RPA32/RPA32/RPA SIGNDAIN SIGNDAIN SIGNDAIN ，1：500
，2208（Thermo Fisher Scientific，Arg415 ，1：400）
，兔子HA（ABCAM，AB9110 ，1：1,000），大鼠磷酸含量HISTONE H3（S28）（S28）（ABCAM
，AB10543，1：2,000） ，Rabbit Ki-67（ABCAM
，ABCAM，ABCAM ，AB15580
，1：400）
。 　　For western blotting, the following primary antibodies were used: rabbit phospho-histone H2A.X (Ser139) (Cell Signaling, 2577, 1:800), rabbit histone H2A.X (Cell Signaling, 2595, 1:1,000), rabbit phosphorylated ATM/ATR substrate (Cell Signaling, 9607, 1:750), rabbit beta-actin (Abcam,ab8227, 1:2,000), mouse HA (Roche, 11583816001, 1:1,000), rabbit phosphorylated CDC2 (Tyr15) (Cell Signaling, 4539, 1:1,000), rabbit phosphorylated CDC2 (Thr161) (Cell Signaling, 9114, 1:1,000), rabbit CDC2 (Cell Signaling, 77055,1：1,000），兔子磷酸化的CDK2（THR160）（细胞信号 ，2561
，1：1,000），兔CDK2（细胞信号 ，18048
，1：1,000），亲和纯化的小鼠单氯隆抗体NB8-AD9（WB/ip）（WB/ip）对人类的phophlotal phophbit cdk4（1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1.2）56（1.2）56（1.2）（ABCAM ，AB199728，1：1,000）
，兔子CDK6（细胞信号，3136 ，1：1,000）
，兔子N-WASP（细胞信号，4848 ，1：1,000）
，兔子MCM2和兔子MCM361，小鼠Pold（Santa Cruz Cruz ，SC-373731）
，SC-373731），SC-373731） ，SCARE32
，SCANTASSATASSASTAN（SATCANASTAS，STARNESATARA（SATCANATAR）（SATRATANA）（SATRATANTA）信号传导 ，2208），兔磷酸化的RPA32 S4/S8（Bethyl
，A300-245a），兔CTCF（Millipore ，07-729）
，兔子H3（ABCAM，ABCAM ，AB1791）和小鼠α-纤维蛋白（Sigma-Aldrich
，sigma-Aldrich，T9026）。使用了以下二级抗体：ECL抗兔 ，抗鼠抗小鼠IgG与辣根过氧化物酶（GE Healthcare
，1：2,000或1：5,000）偶联 。 　　核肌动蛋白ChromobodytaGGFP质粒（PNACTAGGFP）购自Chromotek
。将细胞铺在无菌覆盖层上，并在24小时后用Lipofectamine 3000（Thermo Fischer Scientific）转染。转染后36小时加入化疗剂（顺铂/5FU） ，持续12和24小时 。PBS洗涤后
，在室温下用4％多聚甲醛固定样品5分钟，用Hoescht抗染色 ，然后用补充2.5％Dabco（Sigma-Aldrich）的甘油（Dako）安装。为了与P-H3和核肌动蛋白染色体– GFP共免疫染色，如图中所述处理了生长在圆形盖板上的细胞
，并在最后45分钟内与10μMEDU一起孵育
。然后将盖玻片用PBS洗涤3次，并在室温下用4％多聚甲醛固定5分钟。根据制造商的规程 ，使用Click-It Plus EDU细胞增殖试剂盒
，Alexa Fluor 647 Dye（Thermo Fischer Scientific，C10640）进行了通透性步骤和EDU的检测 。然后按P-H3和Hoescht对盖玻片进行染色 ，然后如前所述进行安装
。 　　嘌呤霉素选择后
，使用慢病毒PLKO/PUROR载体（Sigma-Aldrich）产生稳定的KD细胞系。KD通过RT – QPCR确认 。同时使用三个不同的shRNA来靶向相同的基因
。使用PLX302-EF1A慢病毒载体生成过表达的细胞系。PLX302-EF1A是Beronja实验室（Fred Huchinson Cancer Research Center）的礼物 。根据制造商的说明，使用Gateway Technology（Invitrogen）将N端3×HA标签的RhoJ结构克隆到PLX302-EF1A中
。对于病毒的产生 ，将5×106 HEK293T细胞播种成10 cm的菜肴
，并用感兴趣的载体和适当的包装质粒PSPAX2和PMD2.G（分别为12260和12259）转染。24小时后更改培养基，然后在48小时内收集上清液 ，并通过0.45 µm的滤波器 。在存在聚勃正（5 mg mL-1）的情况下
，将肿瘤上皮细胞或肿瘤间充质细胞铺在六孔板中，并在汇合的50％时与每毫升病毒40μl孵育
。24小时后更换培养基 ，并用紫霉素选择细胞至少1周。 　　使用以下shRNA（TRC ID，克隆名称）：MRHOJ：TRCN0000313500
，NM_023275.2，673S21C1;MRHOJ：TRCN0000313499 ，NM_023275.2
，713S21C1;MRHOJ：TRCN0000077567，NM_023275.1 ，690S1C1;MRHOQ：TRCN0000077513
，NM_145491.2，1732S1C1;MRHOQ：TRCN0000077515 ，NM_145491.2
，892S1C1;MRHOQ：TRCN0000077516，NM_145491.2 ，661S1C1;HRHOJ：TRCN0000047603
，NM_020663.2，878S1C1;HRHOJ：TRCN0000047604 ，NM_020663.2，1007S1C1;HRHOJ：TRCN0000047605
，NM_020663.2，647S1C1 。 　　根据制造商对DNase处理的建议 ，使用RNeasy微型试剂盒（Qiagen）从FACS分离的细胞中提取RNA。使用纳米体定量后
，使用Superscript II（Invitrogen）和随机六聚体（Roche）合成第一链cDNA，最终体积为50μL
。通过使用或没有逆转录酶执行相同的程序来测量每个样品的基因组污染的控制。使用1 ng的cDNA作为模板 ，SYBRGREEN混合（Applied Bioscience）和Light Cycler 96（Roche）实时PCR系统进行QPCR分析 。TBP管家基因用于小鼠RT -QPCR的归一化
，而Polr2A管家基因用于人RT – QPCR的归一化
。使用Roche Universal Probirary测定设计中心（https://lifescience.roche.com/webapp/wcs/wcs/stores/servlet/servlet/categorydisplay?tab = assay+ddesign+centerfier = universifier = universal+probe+probe+library＆langiD = 1）。使用Light Cycler 96（Roche）和TBP的ΔΔCT方法进行QPCR分析 。 　　用于RT – QPCR的引物的序列如下：（5'-3'）的MRHOJ：accactacgcagttaccgtg;MRHOJ REV（3'-5'）：TGCAACACCATTCTCCGACC；MRHOQ（5'-3'）：TTCGACCACTACGCAGTCAG;MRHOQ REV（3'-5'）：CCTGCAAACCGCGTATAAGG;MTBP（5'-3'）：TGTACCGCAGCTTCAAAAATATTGTAT;MTBP Rev（3'-5'）：AAATCAACGCAGTTGTCCGTG;MKRT14（5'-3'）：GCCCCCCTGGTGTGGAC;MKRT14 Rev（3'-5'）：GTGCGCCGGGCTCAGAAATC;（5'-3'）的mepcam：catttgctccaaactggcgt;MEPCAM REV（3'-5'）：TTGTTCTGGATCGCCCCTTC;MVIMFOR（5'-3'）：CCAACCTTTTTCTTCCCTGAAC;mvimrev（3'-5'）：ttgagtgggtgtgtcaaccaga;MZEB1（5'-3'）：attccccccaagtggcatataca;MZEB1 REV（3'-5'）：gagctagtgtcttgttctttcatcc;MZEB2（5'-3'）：accgcatatggcctataCctac;MZEB2 Rev（3'-5'）：TGCTCCATCCAGCAAGTCT;（5'-3'）的mprrx1：tgttgattcgagcgggaaga;MPRRX1 REV（3'-5'）：TCTAGCAGGTGACTGACGGA;MPDGFRA（5'-3'）：TGGAAGCTTGGGGCTTACTT;mpdgfra rev（3'-5'）：catagctcctgagaccttctcc;（5'-3'）的hrhoj：acaatgtcccaggaggaatggg;HRHOJ REV（3'-5'）：TGTGCTCCGATCGCTTTTG;HRHOQ（5'-3'）：aaagaggagtgggtaccgga;HRHOQ REV（5'-3'）：GCAGCATGCTCCTATCTCTT;HPOLR2A（5'-3'）：GCAAATTCCACAAGAGAGAGACG;和HPOLR2A REV（3'-5'）：CACGTCGACAGGAACATCAG
。 　　使用生物分析仪（Agilent）检查RNA质量。对于从肿瘤上皮细胞或肿瘤间质细胞中提取的RNA，根据制造商的建议 ，使用Truseq绞合的mRNA样品预备试剂盒（Illumina）获得了索引cDNA库 。加载了多路复用的库（11 pm）
，并使用Hiseq 1500（Illumina）系统上的HISEQ PE CLUSTER KIT V4和TRUSEQ SBS KIT V3-HS（250个周期）生成序列
。使用Star软件对每个样品的小鼠参考基因组（GRCM38.P4/MM10）映射了大约800万个配对末端读数，以生成每个样品的读取比对。注释mus_musculus.grcm38.84.gtf从https://ftp.ensembl.org/获得 。在组装转录本后 ，使用HTSEQ获得基因级计数
，并标准化为2000万个对齐的读数
。折叠变化（FC）值是根据条件之间的这些值计算的。本文报告的RNA-Seq的登录号为GEO：GSE205985 。 　　用50μMCLDU（20分钟； Sigma-Aldrich，C6891）将指数生长的细胞标记为脉冲标记 ，然后用250μm的IDU（20分钟； Sigma-Aldrich，I7125）。收集标记的细胞
，并在含有0.5％SDS，200 mM Tris pH 7.4和50 mM EDTA的缓冲液中扩散DNA纤维 ，如前所述57
。为了进行标记的轨道的免疫检测
，将纤维与一抗纤维（对于Cldu，Rat抗Brdu ，AB6326 ABCAM；对于IDU
，Mouse Anti-Brdu，347580 BD生物科学） ，在室温下孵育1 hAF488
，A-21121;全部来自分子探针）在室温下30分钟。小鼠抗SSDNA抗体用于评估纤维完整性（MAB3034，Millipore ，二级抗体抗小鼠IgG2A AF647
，A-21241分子探针） 。如前所述58，用Leica DM6000 B显微镜检查了载玻片
。所使用的转换因子为1 µm = 2.59 kb（参考文献59）。在每种测定中 ，测量了250多个轨道以估计叉速，并分析了500多个轨道
，以估计原点射击的频率（第一个标签起源 - 绿色 - 红绿色 - 显示为所有红色（cldu标记）轨道的百分比）60 。为了估计不对称性，测量了从原点发出的两个叉子（每个实验中每个条件的100个起源） ，并计算了长/短的比率
。当长/短叉比大于1.4时
，原点被认为是不对称的。 　　为了分析染色质结合的蛋白，如先前所述进行了生化分馏 。61
。In brief, cells were resuspended at 107 cells per ml in buffer A (10 mM HEPES pH 7.9, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.34 M sucrose, 10% glycerol, 1 mM DTT, 1× protease inhibitor cocktail; bimake.com), and incubated on ice for 5 min in the presence of 0.1% Triton X-100.低速离心（在600g和4°C下进行4分钟）使胞质馏分（上清液）和核（Pellet）的分离。洗涤核并在缓冲液B（3 mM EDTA ，0.2 mM EGTA
，1 mM DTT，1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒）中进行低渗裂解30分钟 。离心后分离核质和染色质级分（在600g和4°C下4分钟）
。将染色质重悬于Laemmli样品缓冲液中。通过在Laemli样品缓冲液中的细胞重悬（每毫升107个细胞）中 ，制备全细胞提取物（WCE） 。WCE和染色质在15％的振幅下两次超声检查15 s
，并在95°C煮沸5分钟。然后，将10μLWCE（相当于105个细胞）和20μL染色质（2×105个细胞）加载到4–20％定制梯度凝胶上
。将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上 ，在室温下用TBST中的5％非脂肪牛奶阻塞1小时
，并在4°C下孵育过夜。在室温下与继发抗体一起孵育1小时，并使用西方ECL（Advansa）检测蛋白质 。 　　如图所述 ，对生长在圆形盖玻片上的细胞进行处理，并在最后30分钟内与25μmEDU孵育
。然后将盖玻片用PBS洗涤两次
，并用CSK缓冲液（10 mM Pipes pH 7，0.1 m NaCl ，0.3 M蔗糖
，3 mM MGCL2）预先提取5分钟4°C。用甲醛在室温下固定10分钟后，在盖玻片上进行咔嗒声反应（100 mm Tris pH 8 ，10 mm cuso4
，2 mm na-na- scorbate，50μm生物素 - 氮杂-AZIDE-AF488）在37°C下持续1.5 h 。然后 ，将盖玻片用PBS洗涤
，并在室温下用DAPI（1 mg ml -1 in PBS中的1 mg ml -1）染色10分钟，用延长的金抗铁（Thermo Fisher Scientific）安装 ，并在荧光显微镜下可视化
，并以HCX PL Apo 40 0.75 NA的目标可视化
。使用Cell-Profiler（v.3.1.9），每个条件下 ，每个条件中至少在250个EDU阳性核中评估EDU强度。 　　为了定义RhoJ对EMT肿瘤细胞中蛋白质表达的影响，总共准备了24个样品进行LC -MS/MS分析
，对应于3个复制的Epcam+肿瘤细胞的3个复制，Epcam-肿瘤细胞的3个复制 ，3个复制酸盐
，用于EPCAM -RHOJ SHRNA肿瘤细胞的复制和与EPCAM -EPCAM -5复制或对CASS的shrna shrna或24 hhna sherna kernna hyna kernna hyna k.车辆控制（DMSO） 。通过在冰上的Tris缓冲盐水中手动刮擦收集细胞，并作为干颗粒闪烁
。将含有9 m尿素 ，20 mM HEPES pH 8.0的尿素裂解缓冲液和磷酸酶抑制剂抑制剂鸡尾酒（Roche
，每10 mL缓冲液1片剂）裂解，将细胞颗粒（每颗1500万细胞）裂解。使用3 mM探针在20％的振幅下以3张脉冲的3脉冲对样品进行超声检查 ，并在脉冲之间在冰上孵育1分钟 。在室温下在20,000克离心15分钟以去除不溶性组件后
，通过添加5 mM DTT降低蛋白质，并在55°C下孵育30分钟 ，然后通过在黑暗的室温下添加10 mm iodoacetamide和10 mM iodoacetamide和15分钟的烷基化
。使用Bradford分析（Bio-Rad）测量蛋白质浓度
，并从每个样品中使用1 mg蛋白继续该方案。将样品用20 mM HEPES pH 8.0进一步稀释至最终的尿素浓度为4 m，并用10 µg LYSC（WAKO）（1/100 ，W/W）在37°C下消化蛋白质4小时 。再次将样品再次稀释至2 M尿素，并用10 µg胰蛋白酶（Promega）（1/100
，w/w）在37°C中过夜过夜。通过添加1％三氟乙酸，所得的肽混合物被酸酸 ，并在冰上孵化15分钟后
，在15分钟内孵育，在15分钟内 ，在1.80卢比的温度下进行了15分钟的固定液
，将其切除
。接下来，将肽纯化在Sampliq SPE C18墨盒（Agilent）上。首先用1毫升100％乙腈洗涤色谱柱 ，并用3 ml溶剂A进行预衡 （在将样品加载到色谱柱上之前
，水/乙腈中的0.1％三氟乙酸（98：2，v/v）） 。肽结合后 ，用2 mL溶剂A再次洗涤色谱柱
，并用750 µL洗脱缓冲液（0.1％三氟乙酸在水/乙腈中（20:80，V/V）洗脱两次肽）
。然后 ，将75 µL洗脱器完全干燥在Speedvac真空集中器中进行shot弹枪分析。 　　将纯化的肽重新溶解在30 µL溶剂A中，并将每个样品的一半注入LC-MS/MS分析
，以分析最终3000 RSLCNANO系统，并在线连接到配备了纳米喷雾flex source（Thermo Fisher Scientific）的Q精确HF质谱仪 。Trapping was performed at 10 μl min−1 for 4 min in loading solvent A on a 20 mm trapping column (custom made, 100 μm internal diameter, 5 μm beads, C18 Reprosil-HD, Dr Maisch) and the sample was loaded onto a reverse-phase column (custom made, 75 μm inner diameter × 400 mm, 1.9 μm beads C18 Reprosil-HD, DrMaisch）
。通过在145分钟内以250 nl min-1的恒定流速为145分钟 ，通过非线性从2％增加到56％溶剂B（0.1％甲酸B（0.1％甲酸B（20:80
，v/v））洗脱肽，然后以10分钟的冲洗达到99％的溶剂B ，并重新溶于99％的溶剂含量（0.1％）酸（0.1％％％）
，以250 nl min-1的恒定流速为250 nl min-1（随后量）。柱温度在50°C下保持恒定（Cocontrol v.3.3.05，Sonation） 。 　　质谱仪以数据依赖性模式运行 ，每次MS频谱的16个最丰富的离子峰在MS和MS/MS采集之间自动切换
。在累积目标价值3,000,000后
，在Orbitrap分析仪中以60,000的分辨率获得了全扫描MS光谱（375至1,500 m/z）。在以100,000的目标值为100,000的目标值填充陷阱后，最大80毫秒的目标值后 ，以归一化碰撞能量为28％的碎片分离为13,000的阈值16个最强烈的离子 。MS/MS Spectra（200至2,000 m/z）在Orbitrap分析仪中以15,000的分辨率获取
。S型镜头RF水平设置为55
，我们从碎片选择中排除了具有单个和未分配的电荷状态的前体离子。QCloud62用于控制项目期间的仪器纵向性能 。 　　使用MaxQuant（V.1.5.8.3）使用默罗梅达搜索引擎进行默认搜索设置，包括在肽和蛋白质级别上设置为1％的false-discovery速率 ，对shot弹枪数据进行了数据分析。搜索光谱，以针对瑞士蛋白数据库中的小鼠蛋白（2017年9月的数据库发行版本包含16,931个小鼠蛋白序列； http://www.uniprot.org）
。在主要搜索过程中
，前体和片段离子的质量公差分别设置为4.5和20 ppm。将酶的特异性设置为精氨酸和赖氨酸的C末端，也允许在脯氨酸键处进行裂解 ，最多丢失了两种裂解 。将可变的修饰设置为蛋氨酸残基的氧化
，蛋白N末端的乙酰化以及丝氨酸，苏氨酸或酪氨酸残基的磷酸化 ，而半胱氨酸残基的氨基甲基化则将其视为固定的修饰
。匹配之间的匹配已启用
，匹配的时间窗口为0.7分钟，对齐时间窗口为20分钟。仅保留至少一种独特或剃须肽的蛋白质 ，才能鉴定出5,354种蛋白质 。通过集成在Maxquant软件中的MAXLFQ算法来量化蛋白质
。需要两个独特或剃须刀肽的最低比率进行定量。 　　在加载Maxquant的蛋白质组文件后
，使用Perseus软件（V.1.5.5.3）对shot弹枪结果进行了进一步的数据分析 。反向数据库命中，仅通过位点识别的潜在污染物和命中量被删除 ，LFQ强度被log2转换
，并将复制样品分组
。在至少一组中，删除了一个有效值少于三个有效值的蛋白质是从检测极限周围的正态分布中估算出的 ，导致4,239个量化蛋白质列表，该蛋白用于进一步的数据分析。为了揭示在不同条件之间显着调节表达水平的蛋白质
，根据治疗（对照组对照）和RhoJ表达（与无RHOJ相比）定义样品组，并进行了双向ANOVA测试 。对于每种蛋白质 ，该测试计算了用于处理的P值（ - 持续变形的P值）
，RHOJ表达的P值和处理和RhoJ表达之间相互作用的P值
。带有p的蛋白质< 0.05 in at least one of these three conditions were considered to be significantly regulated. A total of 99 proteins of interest were selected, the log2 transformed intensities of these proteins were Z-scored and these values were plotted in a heat map after non-supervised hierarchical clustering. 　　The MS proteomics data have been deposited at the ProteomeXchange Consortium through the PRIDE63 partner repository under dataset identifier PXD025737. 　　To identify the proteins interacting with RHOJ, a total of 12 samples were prepared for LC–MS/MS analysis corresponding to 3 replicates of HA-tagged-RHOJ-transfected EPCAM− tumour cells and 3 control empty vector EPCAM− tumour cells treated for 12 h with cisplatin/5FU or with vehicle control (DMSO). Immunoprecipitation of HA-tagged RHOJ was performed as follows. After three washes in ice-cold Tris-buffered saline, cells were collected on ice by scraping in lysis buffer (150 mM NaCl, 50 mM HEPES pH 7.5, 2 mM EDTA, 10% glycerol, 1 mM β-mercaptoethanol, 1% Triton X-100, protease inhibitor cocktail (11836170001, Roche) and phosphatase inhibitor cocktail 2 (Sigma-Aldrich, P5726)), vortexed three times for 30 s with a 2 min pause in between and then centrifuged for 15 min at 13,000 rpm. The total protein content of each sample was evaluated using the Bradford assay and 1 mg of protein was used in every immunoprecipitation. A total of 6 µg of antibodies (rabbit HA tag Chip grade, ab9110, Abcam) were incubated with 1 mg of lysate at 4 °C under constant rotation overnight. Subsequently, 25 μl Dynabeads Protein G (10003D, Thermo Fisher Scientific) was added and rotated at 4 °C for 4 h. The Dynabeads were washed once in wash buffer (150 mM NaCl, 50 mM HEPES pH 7.5, 2 mM EDTA, 10% glycerol, 1 mM β-mercaptoethanol, 0.1% Triton X-100, protease inhibitor cocktail and phosphatase inhibitor cocktail) followed by three washes in MS-compatible buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 2 mM CaCl2). Washed beads were resuspended in 150 µl trypsin digestion buffer and incubated for 4 h with 1 µg trypsin (Promega) at 37° C. Beads were removed, another 1 µg of trypsin was added and proteins were further digested overnight at 37° C. Peptides were purified on Omix C18 tips (Agilent) and dried completely in a rotary evaporator. 　　Peptides were redissolved in 20 µl loading solvent A (0.1% trifluoroacetic acid in water/acetonitrile (98:2, v/v)) of which 2 µl was injected for LC–MS/MS analysis on the Ultimate 3000 RSLCnano system in-line connected to a Q Exactive HF mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific). Trapping was performed at 10 μl min−1 for 2 min in loading solvent A on a 5 mm trapping column (Thermo Fisher Scientific, 300 μm internal diameter, 5 μm beads). The peptides were separated on a 250 mm Waters nanoEase M/Z HSS T3 Column, 100 Å, 1.8 µm, 75 µm inner diameter (Waters Corporation) kept at a constant temperature of 45 °C. Peptides were eluted by a non-linear gradient starting at 1% MS solvent B reaching 33% MS solvent B (0.1% formic acid in water/acetonitrile (2:8, v/v)) in 60 min, 55% MS solvent B (0.1% formic acid in water/acetonitrile (2:8, v/v)) in 75 min, 99% MS solvent B in 90 min followed by a 10 min wash at 99% MS solvent B and re-equilibration with MS solvent A (0.1% formic acid in water). The mass spectrometer was operated in data-dependent mode, automatically switching between MS and MS/MS acquisition for the 12 most abundant ion peaks per MS spectrum. Full-scan MS spectra (375–1,500 m/z) were acquired at a resolution of 60,000 in the Orbitrap analyzer after accumulation to a target value of 3,000,000. The 12 most intense ions above a threshold value of 15,000 were isolated with a width of 1.5 m/z for fragmentation at a normalized collision energy of 30% after filling the trap at a target value of 100,000 for maximum 80 ms. MS/MS spectra (200–2,000 m/z) were acquired at a resolution of 15,000 in the Orbitrap analyzer. 　　Analysis of the MS data was performed in MaxQuant (v.2.0.3.0) with mainly the default search settings, including a false-discovery rate set at 1% at the peptide-to-spectrum match, peptide and protein level. Spectra were searched against the mouse proteins in the Reference proteins database (UP000000589, database release version of January 2022 containing 21,986 mouse protein sequences; http://www.uniprot.org). The mass tolerance for precursor and fragment ions was set to 4.5 and 20 ppm, respectively, during the main search. Enzyme specificity was set as C terminal to arginine and lysine, also allowing cleavage at proline bonds with a maximum of two missed cleavages. Variable modifications were set to oxidation of methionine residues, acetylation of protein N termini. Matching between runs was enabled with a matching time window of 0.7 min and an alignment time window of 20 min. Only proteins with at least one unique or razor peptide were retained. Proteins were quantified using the MaxLFQ algorithm integrated in the MaxQuant software. A minimum ratio count of two unique or razor peptides was required for quantification. A total of 126,976 peptide-to-spectrum matches was performed, resulting in 14,501 identified unique peptides, corresponding to 2,091 identified proteins. Further data analysis of the AP–MS results was performed using a custom R script, using the proteinGroups output table from MaxQuant. Reverse database hits were removed, LFQ intensities were log2-transformed and the replicate samples were grouped. Proteins with less than three valid values in at least one group were removed and missing values were imputed from a normal distribution centred around the detection limit (package DEP64), leading to a list of 1,381 quantified proteins in the experiment, used for further data analysis. To compare protein abundance between pairs of sample groups (RhoJHAuntreatedIP versus EVuntreatedIP, RhoJHAtreated12hchemoIP versus EVtreated12hchemoIP sample groups), statistical testing for differences between two group means was performed, using the package limma65. Statistical significance for differential regulation was set to a false-discovery rate of <0.05 and a fold change of >2倍或<0.5倍（| log2fc | = 1）。MS蛋白质组学数据已通过DataSet标识符PXD038278在Pride合作库中存放在ProteOmeXchange联盟中 。 　　使用IBM-SPSS v.28.0（IBM，发布2021； Windows IBM SPSS统计信息 ，v.28.0）
，Medcalc v.20（Medcalc统计软件v.20.20.109; Medcalc软件; Medcalc软件; Https:/https:/https://wwwwwww.medc.org; 2022222222222222222222222222222222）连续变量通过其手段和S.E.M.以及定性变量作为数字和百分比来总结。在小组之间使用非参数测试的样本量（n少于30左右）比较了连续变量的差异，包括曼恩 - 惠特尼测试 ，在两组中进行
，而Kruskal -Wallis测试进行了，随后进行了曼恩 - 惠特尼测试 ，对Bonferroni校正进行了多次比较
，而Bonferroni校正了多个组
。当样本量足够大时（n超过30个）时，使用参数测试 ，包括经典的学生的t检验或韦尔奇的t检验在方差不平等的情况下，当有两个样本和ANOVA
，然后是Sidak Test或Dunnett T3测试的情况下，就多于两个样品而言。P <0.05被认为具有统计学意义 。所有统计检验均两侧
。相应图的传说中提到了所使用的每个测试。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。