没有使用统计方法来预先确定样本量。这些实验不是随机的 ，研究者在实验中没有对分配和结果评估视而不见
，除了生物信息学分析外 。 　　珊瑚水族馆建立在水箱中（Refer 450系统，红海）
。人造海水由Coral Pro Salt（红海）制成 ，首先与活岩一起孵育两个月，然后引入Xenia sp。
，其他珊瑚，鱼类 ，蜗牛和寄居蟹 。该水族馆保持在约80°F
，每1-2周变化约25％。该灯由Hydra 26 HD LED（Aqua Inlumination）提供，在10:00至19:00期间 ，功率为60％
。将鱼用鱼类颗粒（新寿命海洋鱼配方奶粉）和绿色海洋藻类（海洋营养）喂食。 　　Xenia sp 。是从当地一家名为CTE Aquatics的当地珊瑚水族馆商店获得的
。我们通过用引物（SYM_VAR_5.8S2
，GAATTGCAGAACTCCGTGAACC和SYM_VAR_REV，CGGGGTTCWCTTCWCTTGCTTGCTTGCTTGCTTGCTTGATGACTTCATGC）扩增了Symbiodiniaceae物种的IT2 rDNA区域进行分类分析。序列分析表明Xenia sp 。在我们的水族馆中 ，有多种甲虫属的共生性种类
。在我们的所有实验中
，从水族馆中随机选择了息肉或菌落的样品。我们选择了看起来完全长大的息肉，以及易于从附着地点脱离的菌落 。我们将分享我们的现场Xenia sp
。根据要求与任何研究人员一起。我们还将一些冷冻和固定的珊瑚菌落以及基因组DNA和总RNA存放在史密森尼国家自然历史博物馆（目录号 ，USNM 1613385）中 。 　　为了启用纳米孔DNA测序
，我们修改了允许分离长DNA片段的方案37
。对于每种DNA制备，一个或两个Xenia sp。从水储罐中收集了大约30个息肉的菌落 ，并用Ca2+ - 和Mg2+ - 无米人工海水洗涤3次（449 mm NACL，9 mm KCl
，33 mm Na2so4，2.15 mm Nahco3 ，2.15 mm Nahco3
，10 mm tris-Hcl，2.5 mm tris-hcl ，2.5 mm tris-hcl
，2.5 mm egta，ph 8.0） 。触手被切开 ，因为它们分泌了很多粘液（影响了孤立的DNA的质量）。将其余的茎和单个Xenia菌落的碱基放在100μlDnazol（Invitrogen）中
，在1.5 mL的微量离心管中
。剪刀将组织切成小块，使碎片大小约为原始大小的1/10。这些碎片是通过为1.5 ml微量离心管制成的小杵进一步切碎的（Fisher Scientific ，12-141-364） 。然后
，加入900μlDnazol，然后将样品涡流 ，然后转移到15毫升锥管中
。然后将四毫升的DNAZOL和50μL的10 mg/ml RNase A加入管中并混合，然后在37°C下孵育10分钟。然后
，加入25μl25μl的20 mg/ml蛋白酶K，混合并在37°C下再孵育10分钟 。将样品以5,000克离心10分钟
。将上清液转移到另一个15毫升管。加入2.5 mL乙醇后 ，通过倒数几次轻轻混合了管 。将管子在室温下静置3分钟
，然后在1,000克离心10分钟，以颗粒
。将上清液丢弃 ，并将DNA颗粒重悬于500μlTE中（10 mM Tris-HCl
，1 mm Disodium Edta，pH 8.0）。DNA溶解后 ，加入了500μl苯酚：氯仿：氯仿（25：24：1）
，并将管放在Intelli-Mixer RM-2S上，用于使用程序C1在35 rpm的情况下混合10分钟 。然后将混合物转移到2-ml相锁凝胶（Quantabio ，Cat
。2302820）中
，并在4下离心500 rpm 10分钟。将水相转移到新的2 ml管中，将200μl5 m乙酸铵和1.5 ml冰冷的乙醇加入 ，然后以10,000g离心10分钟，持续10分钟 。用1 ml 80％乙醇洗涤颗粒两次。去除尽可能多的乙醇后
，将DNA颗粒在42°C下干燥1分钟，然后重悬于50μlTE缓冲液中
。 　　根据制造商的手册 ，将类似于“ Xenia sp。从Xenia sp 。”中制成的基因组DNA被碎裂成约400 bp
，并用Thruplex DNA-Seq Kit（Takara）制成
。使用NextSeq 500/550高输出试剂墨盒V2（Illumina）的NexSeq500平台对这些库进行测序。 　　根据制造商的手册，基因组DNA用于使用连接测序试剂盒（SQK-LSK108 ，牛津纳米孔技术）构建纳米孔测序库 。在前三个运行中
，基因组DNA并未分散，以产生长读数
。为了获得更多的读数 ，对于纳米孔测序的第四次运行
，基因组DNA被G-Tube（Covaris，520079）剪切至8-10千倍酶。在小奴才设备（牛津纳米孔技术）上的R9.4.1流细胞中对库进行了测序 。Minknow（v.1.7.3）用于收集原始信号 ，并使用Albacore（v.2.3.3）进行基础呼叫
。所有数据均合并为基因组组件。 　　在Xenia sp上执行HI-C 。组织
，我们修改了先前发表的核位原位Ligation13的方案，如详细描述
。 　　将八个息肉（约108个细胞）用4％多聚甲醛（PFA）固定过夜。用3.3×PBS38洗涤两次后 ，并使用7毫升玻璃液体组织研磨机（惠顿）将组织分离为2 ml 3.3×PBS，再增加3毫升3.3×PBS 。然后将混合物转移到15毫升锥形管中
，并以1,000g离心3分钟（Sorvall Lynx 6000离心机，Thermofisher Scientific）。用5 mL 3.3×PBS洗涤沉淀一次
。 　　将步骤1的沉淀重悬于10 ml冰冷的HI-C裂解缓冲液中（10 mM Tris ，pH 8.0
，10 mM NaCl，0.2％NP-40 ，1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche
，04693132001）），在4°C下旋转30分钟 ，在4°C下旋转3分钟。将沉淀重悬于1 ml冰冷的1.2×Neb3.1（120μlNeb3.1至880μLDDH2O）缓冲液中
，并转移至1.5 mL微切除管，然后在4°C下以1,000g的1,000克离心 。将沉淀再次用1 ml冰冷的1.2×Neb3.1洗涤 ，然后进行离心
。去除上清液后
，将400μl1.2×Neb3.1缓冲液和12μl的10％SDS添加到颗粒中。P200移液器尖端被用来彻底重新悬浮并解离颗粒 。然后将混合物在65°C下在950 rpm的Thermoxer（Eppendorf）中孵育10分钟
。冷却冰上混合5分钟后，将40μl20％Triton X-100添加到混合物中以中和SDS。通过用P200移液器尖端仔细混合并倒数几次 ，然后将混合物在37°C下在37°C下孵育60分钟，并在旋转（950 rpm）中在Thermomixer中孵育 。为了消化交联的基因组DNA
，将30μl的50 U/μLBGLII（NEB R0144M）添加到混合物中，并在37°C下在热杂球中以950 rpm旋转在37°C下孵育过夜
。 　　通过在27μLDDH2O中加入1 100 mM DatP ，DGTP和DTTP中的1μl
，将含有DATP，DGTP和DTTP的核苷酸混合物进行。从上述步骤2 ，4.5μl的核苷酸混合物
，15μL1 mm生物素16-DCTP（Axxora，JBS-NU-809-BIO16）和10μL5 U/μLKlenow（neb ，M0210L）contection（axxora
，jbs-nu-809-bio16）和nebe contecation in480.0μlBglii消化的核制剂 。使用Thermomixer每20 s后，在700 rpm的700 rpm处间歇性轻柔的摇动
。该试管也被取出 ，每15-20分钟倒下一次。孵育后
，将混合物放在冰上 。 　　将步骤3的混合物转移到50毫升的圆锥管中，然后加入750μl10×T4连接酶缓冲液（NEB B0202S ，无钉），75μl100×BSA（NEB）
，6,140μl水，25μl30 U/μLT4DNA LIGASE（TORMEN DNA LIGASE（THERMO SOCICAL）（EL0013）16333333333333333333333333333333333333333。 　　对步骤4的反应混合物 ，加入25μl20 mg/ml蛋白酶K（Invitrogen
，25530-049），并将混合物平均分为8×1.5 ml的微切离子管（每管约950μl）
。然后将管子在65°C下在热电混合物中以950 rpm的旋转为单位孵育过夜。第二天 ，将3μl20 mg/ml蛋白酶K添加到每个管中
，然后在热糖中混合在65°C下在65°C下孵育2小时 。将混合物组合成一个50毫升锥形管
。冷却至室温后，加入10毫升苯酚（pH 8.0）（Sigma） ，并通过涡流混合2分钟。然后将混合物以3,000克离心10分钟（Sorvall Lynx 6000离心机） 。将含有DNA的上清液与10 mL苯酚：氯仿（1：1）（预热至室温）
，并涡旋2分钟
。然后将整个混合物转移到50毫升最大高密度管（Qiagen，129073）中 ，并以1,500g离心5分钟（Sorvall Lynx 6000离心机）。将包含HI-C DNA的顶相转移到50 mL圆锥管上
，并根据需要将体积（通常约10 mL）调节至10 mL 。为了颗粒，DNA ，1 ml 3 m Na-乙酸盐，5μL15mg/ml糖布鲁（Invitrogen AM9515）
，将10 ml异丙醇添加到混合物中，并在-80°C下孵育> 1 h
。然后通过在4°C的17,000克离心45分钟（Sorvall Lynx 6000离心机）通过离心45分钟将DNA颗粒。将HI-C DNA颗粒重悬于450μL1×TE中 ，并转移到1.5 ml的微量离心管中
，然后添加500μl苯酚：氯仿（1：1） 。通过涡流混合后，将混合物在室温下以18,000克离心5分钟
。将顶部水层收集到另一个管中 ，然后加入40μl3m Na-乙酸盐
，1μl15mg/ml糖布鲁（Invitrogen AM9515，300μL）和1 ml冰冷的100％乙醇。在-80°C下孵育> 30分钟后 ，将DNA在4°C下以21,000g离心30分钟 。将DNA颗粒用新鲜制备的70％乙醇洗涤
，并风干， 然后溶解在45μlEB中（10mm Tris ，pH 8.0）。通过添加0.5μl10mg/ml rnAsea
，在37°C下孵育30分钟，从而消化了DNA制备中受污染的RNA
。 　　为了在游离DNA末端去除生物素 ，1.0μl10μl10 mg/ml BSA（NEB，100×）
，10μL10×10×NEB 2.1缓冲液，1μl10mM DatP ，1μL10mm DGTP和5μLT4 DNA聚合酶（NEB M0203S和42μl）添加到42μl（42μl）
，以从步骤5进行的DNA制备。将混合物分为两个等分试样在2个PCR管中，并在20°C下孵育4小时 。然后 ，将2μl的0.5 m EDTA添加到两个试管中的每一个中以停止反应
。然后使用清洁和浓缩器试剂盒（Zymo
，d4013）纯化HI-C DNA，然后用50μlEB洗脱。 　　简而言之 ，将60μl的dynabeads Myone链霉亲和素C1（Invitrogen）洗涤在1.5 ml非粘性微型离心管（Ambion）中
，其带有200μl2×2倍结合缓冲液（10 mM Tris，pH 8 ，8
，8，8 ，0,1 mm EDTA，2 m Nacl）
，2 m nacl），然后由bufferers bulders buffers in 50 melfersivers in 50 melfersive in 50 melfersive 。从步骤6中添加了50μLHI-C DNA ，然后在室温下使用Intelli-Mixer（ELMI）旋转30分钟
。使用磁台收集珠子
，并用100μL1×结合缓冲液洗涤，然后用100μL1×Neb4缓冲液洗涤两次 ，并重悬于50μL1×NEB4缓冲液中。使用1μl10u/μlAlui（NEB
，R0137S）在37°C下消化珠子上的DNA 60分钟 。将珠子收集在磁台上，然后用100μL1×结合缓冲液洗涤 ，然后用100μlEB洗涤
。将珠子重悬于30μlEB中。 　　将步骤7的30μl珠与5μlNEB缓冲液2、10μL1毫米Datp
，2μLH2O，3μLKlenow（3'-5'EXO-）（NEB M0212L）混合 ，并在37°C下孵育45分钟 。反应后
，通过磁台收集珠，然后用100μL1×结合缓冲液和100μlEB洗涤
。将珠子重悬于50μlEB中。 　　将步骤8的50μl珠与3.75μL测序衔接子（Truseq RNA样品预备套件V.2） ，10μL1×T4 DNA连接酶缓冲液，3μLT4DNA连接酶（30 U/μL）（30 U/μL）（Thermo Scientific
，EL0013），并在室温下以2 H的浓度启动 。通过磁台收集珠子 ，然后用400μL1×结合缓冲液洗涤两次
， + 0.05％Tween，200μl1×结合缓冲液 ，然后是100μLEB。将珠子重悬于40μLEB中
。为了从珠子中释放DNA
，将混合物在98°C下孵育10分钟，然后以500 rpm离心 ，以颗粒链球菌珠。 　　Truseq RNA库准备套件用于制作DNA测序库（使用了八个PCR周期）
，并通过NextSeq 500对DNA进行了测序 。 　　对于六个scrna-seq库的准备，1个息肉 ，8个触手和2个茎或2个Xenia sp的茎
。were dissociated into single cells in 1 ml digestion buffer, containing 3.6 mg/ml dispase II (Sigma, D4693), 0.25 mg/ml liberase (Sigma, 5401119001), 4% -cysteine in Ca2+-free seawater (393.1 mM NaCl, 10.2 mM KCl, 15.7 mM MgSO4·7H2O,51.4毫米MGCL2·6H2O
，21.1 mm Na2SO4和3 mm Nahco3，pH 8.5） ，并在室温下孵育1小时。消化后，将胎牛血清添加到最终浓度为8％
，以阻止酶消化 。通过40μm细胞过滤器（Falcon）过滤细胞悬浮液
。只能用死细胞占用的低浓度（0.1μg/ml）的DAPI用于测量细胞活力。仅使用了不使用DAPI的90％以上细胞的细胞悬浮液 。通过血细胞计数计对细胞计数，并在消化缓冲液中使用的Ca2+无水海水中的相同4％半胱氨酸稀释为每μl1,000个细胞
。每个样品使用10倍基因组学平台 ，使用带有铬单细胞3'库和凝胶珠子Kit Kit Kit V.2（PN-12267）（V.2化学）或铬铬的下一个GEM单细胞3'Gem
，库和凝胶珠套件V.3.1（PN-1000121，PN 3'CHIT 3'CHIT 3'CHIT（PN 3） ，使用10倍基因组学平台进行单细胞文库制备。或Chromium Next Gem芯片G单细胞试剂盒（PN-1000127）和i7多路复用试剂盒（PN-1220262） 。对于SCRNA-Seq库的构建
，我们准确遵循10倍协议
。简而言之，对于V.2化学 ，将17.4μl细胞悬浮液和16.4μl无核酸酶的水与66.2μl逆转录主混合混合。在这种100μl的混合物中
，将90μL加载到单个单元格3'A芯片套件中提供的芯片中 。对于V.3化学，将16.5μl细胞悬浮液和26.7μl无核酸酶的水与31.8μl反转录主混合混合。在这种75μl的混合物中 ，将70μl加载到铬下一个宝石芯片G中
。条形码后
， 纯化cDNA并用11个PCR循环扩增。进一步纯化了放大的cDNA，并经过破碎 ，末端修复，A量表
，适配器连接和14个样品指数PCR的周期 。使用Illumina NextSeq 500对库进行了对配对读数的测序
。读取1是26 bp（V.2化学）或28 bp（v.3.1化学），读取2为98 bp。 　　In our initial scRNA-seq using the 10x Genomics v.2 chemistry, we obtained fewer unique molecular identifiers (UMIs) (median number, 801) and genes (median number, 467) per Xenia cell compared to other model organisms, such as the mouse thymus39 (median UMI 5,802 and median gene number 2,178), but higher than in Nematostella18 (median UMI541和中位基因编号278） 。新的和改进的V.3化学基本上改善了我们的SCRNA-SEQ
。我们捕获了每个库的更多单元（V.3 7,874对V.2 2,883） ，每个细胞中位基因的数量较高（V.3 943对V.2 467）和每个细胞中位UMI（V.3 2,027对v.2 801）。我们的v.3数据集的质量低于小鼠胸腺胸腺39和hydra40 scrna-seq数据集的质量（补充表1） 。这表明
，即使使用V.3化学，海水和/或Xenia-Sp.特定特征的存在也可能有助于降低的SCRNA-SEQ质量
。 　　我们注意到V.3中的映射速率低于V.2化学。我们对V.3库进行了更多读取 ，因为V.3捕获了每个细胞的总细胞和更多的RNA分子 。尽管我们对V.3库进行了更多测序
，但我们获得了较低的序列饱和度（平均为v.3库中的79.6％，v.2库中的92.6％）
。由于V.2和V.3试剂含量是专有信息 ，因此我们很难评估这两种方法给出不同结果的原因。关于我们的图书馆准备
，v.3方法的总体积的22％来自无CA2+的无用海水中的细胞悬浮液，而在第v.2方法中 ，总数的17.4％来自无CA2+-Fre-Fre-Fre-Fre-Fre-Fre-Fre-Fre-Fre-Fre-Fre-Fre-Fre-Fre-Fre-Fre-Fre-Fre-Fre-ff-Fre-Fre-Fre-Fre-Fre-Fre-Fre-Fre-Fre-Fre-fir-Fre-fr-fif-fir-Fre-Fre-File-fir-fir-fir-fir-fir-fir-Fre-fir-Fre-File-File-File-Files uspension 。因此
，我们知道这两种方法之间的一个区别是，V.3库中的盐音乐会高于v.2库准备中的盐协调。V.3中较高的盐浓度可能会导致V.3文库制备中的RNA提取效率较高 ，这可能有助于我们的V，2-和V
，基于3的SCRNA-SEQ之间的差异
。尽管10倍平台在Xenia sp。运行良好 。我们在这里研究了，重要的是要记住 ，对于其他海洋cnidarians来说
，成功的Scrna-Seq可能需要修改
。 　　为了量化Xenia的内共生细胞百分比，我们首先采用了基于显微镜的策略。通过对标记所有核的1μg/ml DAPI染色的冷冻保存的组织切片 ，我们通过计算Xenia细胞核的数量来确定每个部分的Xenia细胞总数：当与AutofluoreSence信号重叠时
，这些核很容易与Alga Nuclei区分开 。通过计算被Xenia组织包围的藻类数量来估计含有藻类的Xenia细胞的数量
。该方法的估计百分比平均为2-6％，具体取决于部分是从茎或触手中取出的（扩展数据图4D）。这种方法的局限性是 ，某些似乎位于组织内部的藻类可能位于Xenia细胞之间
，而不是在细胞内部 。因此，该估计值可以代表含藻类Xenia细胞百分比的上限
。 　　在第二种方法中 ，我们使用FACS分离Xenia细胞内包含的自由藻类和藻类。用与“ scrna-seq ”相同的制备方法将Xenia息肉分离为单细胞悬浮液 。将细胞用1％（终浓度）甲醛在冰上固定1小时
，然后用0.2％Triton X-100透化和1μg/ml DAPI染色固定
。我们首先根据CY5.5通道中的藻类自动荧光分离了自由藻类和含藻类的Xenia细胞。Xenia细胞内部的游离藻类和藻类应具有不同的正向散射（FSC）和侧散射（SSC）信号，因为Xenia细胞内部的藻类被Xenia细胞内部的藻类包围 。因此 ，我们使用FSC和SSC将藻类的总群体进一步进入两个亚群。显微镜分析表明，这种门控分离了自由藻类和含藻类的Xenia细胞
。为了确定总Xenia细胞数
，根据DAPI阳性信号，将Xenia细胞与藻类细胞一起门控 ，然后使用CY5.5信号门控。将总Xenia细胞计算为无藻类的Xenia细胞以及含藻类的Xenia细胞 。根据这些FACS分析
，我们能够估计Xenia息肉中含有藻类的Xenia细胞的百分比约为总Xenia细胞的2％
。该FACS排序的说明可以在扩展数据中找到图7b – g。由于单细胞解离的过程可能会导致含藻类的Xenia细胞失去其藻类，因此通过FACS方法获得的含藻类的Xenia细胞的大约2％可能表示低估 。因此 ，我们估计含藻类的Xenia细胞的比例约为2-6％
。 　　Rneasy Plus Mini Kit（Qiagen）从3个息肉
，32个触角或6个茎中分离总RNA。为了从不同的细胞类型中获得其他转录组，我们根据先前发表的方法41将珊瑚组织分解为单个细胞 ，并将解离细胞与基于OptiPREP的细胞分离42 。将具有不同密度的细胞分为四层
，并用Rneasy Plus Mini Kit（Qiagen）从每层分离RNA
。对于FACS分离的含藻类和无藻类细胞的转录组，将三个息肉与SCRNA-SEQ中使用的相同方案分离 ，并将解离的细胞对FACS进行。Cy5.5阳性和阴性细胞分别作为含藻类和无藻类细胞收集
，并用于上述总RNA提取 。cDNA库是根据Truseq搁浅的mRNA库预备套件（Illumina）建造的，并受到Illumina NextSeq 500进行测序
。对于基因注释 ，使用了每端的75 bp的配对末端测序。对于FACS分离的散装细胞转录组，使用了75 bp的单端测序 。 　　Xenia sp。将息肉放入来自我们水储罐中的1 ml人造海水的24孔细胞培养板（Corning）的孔中
。将息肉允许在井中定居5-7天
，然后切除触手。切割后，有很多藻类释放到海水中 ，与生活在珊瑚腔内的自由藻类一起可以用作藻类的藻类
，以便在再生过程中吸收藻类 。 　　对于BRDU标记实验，在采集样品之前 ，将0.5 mg/ml BRDU添加到2 d中
。BRDU标记的茎由4％PFA固定过夜
，然后用PBST（PBS+0.1％Tween 20）洗涤两次，持续10分钟。然后用30％的蔗糖过夜 ，将茎与茎嵌入OCT
，冷冻在乙醇浸入干冰中并进行冷冻剖面 。每次用PBS洗涤载玻片3次5分钟，然后在室温下用含有0.5％Triton X-100的2 M HCl处理30分钟
。然后将载玻片与PBST（PBS中的0.2％Triton X-100）在5次中孵育3次 ，然后用10％的山羊血清阻塞
，然后在4°C中与小鼠抗BRDU抗体（Zymed，18-0103 ，11013，1：200山羊血清中的山羊血清中的1：200稀释）孵育。将载玻片用PBST洗涤3次
，每个载玻片，每个载玻片 ，然后在室温下与二抗（Invitrogen）一起孵育1小时
，并用PBST洗涤3次，持续3次10分钟 。用Hoechst 33342对核进行了染色 ，并使用共聚焦显微镜（Leica）可视化信号
。由Hoechst标记的细胞核中的明显BRDU信号被计为BRDU+细胞。如果将Xenia brdu+核并置与藻类并置
，则将其算作含有藻类的BRDU+ Xenia细胞 。 　　对于EDU脉冲训练实验，在第3天和第4天和第4天 ，将重生的Xenia茎与1 mm Edu孵育
。清洗Edu后
，将珊瑚与人工海水一起孵育，并在7 、9
、11、11 、13、15
、17、17和19的再生中收集了人造海水 ，并在重新生成的第7 、9
、15、15 、17和19次。如“ scrna-seq
”中所述的4°C过夜 。将固定的细胞在800g下颗粒5分钟
，并用4％PFA进一步固定两天，以阻止488 nm通道中的自动荧光。然后 ，根据制造商的协议，使用Click-IT Edu细胞增殖试剂盒（Invitrogen
，C10337）进行了EDU Click Chemistry
。将细胞用DAPI进一步染色，然后如图7所述的FACS分析 ，并通过显微镜和FACS对内共生Xenia细胞进行定量。 　　为了在Xenia上执行RNA ISH
，我们修改了Zebrafish43的整个安装RNA ISH协议 。 　　为了制作基因特异性的理性或反义探针，我们将引物（补充表7）设计到PCR感兴趣的基因上 ，以扩大Xenia sp的基因片段
。cDNA。将T3启动子序列添加到反向引物的5'中
，以便可以通过T3 RNA聚合酶（Promega，p2083）直接使用PCR产物来合成抗渗透RNA探针（Roche ，11277073910） 。DIG-labelled RNA probes were purified by RNA Clean and Concentrator-5 (ZYMO), heated to 80 °C for 10 min, immediately transferred on ice for 1 min, and then diluted in Prehyb+ buffer (50% formamide, 5× saline–sodium citrate buffer (SSC, 0.75M NaCl, 0.075M sodium citrate), 50 μg/ml heparin, 2.5%Tween 20
，50μg/ml单链DNA（Sigma，d1626）至最终浓度为0.5μg/ml ，并将其存储在-20°C下直至使用
。 　　将Xenia息肉放松在Ca2+的无水海水中30分钟
，然后在4°C的Ca2+无海水中固定在4％PFA中。用PBST洗涤固定的息肉（PBS 0.1％Tween 20），每次两次 ，然后在-20°C下在100％甲醇中孵育过夜 。第二天，将组织在75％
，50％，50％和25％甲醇中依次洗涤5分钟 ，然后在PBST中洗涤10分钟
。然后将它们用50μg/ml蛋白酶K在PBST中处理20分钟
，然后在PBST中进行短暂洗涤。将组织在室温下在4％PFA中固定20分钟，然后用PBST洗涤2次 ，持续2分钟10分钟 。在68°C的prehhb+中进行杂交2小时
，然后在68°C下与Prehhb+探针孵育过夜
。为了探测胃皮标记，添加了2％SDS（终浓度） ，以帮助探针穿透组织。除去探针后
，将样品依次在2×SSC（0.3 m NaCl和0.03 M柠檬酸钠）中含50％甲酰胺两次两次，2×SSC含有25％甲酰胺 ，持续20分钟
，2×SSC，2×SSC 20分钟 ，持续20分钟，两次两次
，和0.2×SSC 30分钟3次3倍，每个3倍 ，每个68倍 。然后
，将样品在室温下在PBST中洗涤10分钟，并在挖掘阻尼缓冲液中孵育（1％ISH阻塞试剂（Roche ，11096176001）
，用甲基酸缓冲液（0.1 M Maleic Acid，0.1M Maleic Acid ，0.15 M NaCl
，NaCl，pH 7.5）在室温下1小时 ，然后在室温下进行1小时
，随后在抗体抗体中（Roch-Dig-Digigig）（Roch-dig-digox（ROCH）（ROCH）（ROCH）（ROCH）（ROCH）（ROCH）（ROCH）（ROCH）（ROCH）（ROCH）（ROCH）（ROCH）11093274910）在4°C的挖掘缓冲液中的1：5,000稀释度，在室温下每人在PBST中每次洗涤10分钟3次 ，然后在9.5T的缓冲液中（100 mm Tris-HCl）（100 mm Tris-HCl）通过在BCIP/NBT缓冲液中孵育（1 Sigmafast BCIP/NBT片剂（Sigma，B5655）
，在10 ml H2O）中在4°C下孵育，直到棕色 - 波纹颜色充分深色为止。对于这项研究 ， 颜色开发花费了48小时
。然后将样品在PBST中两次洗涤10分钟。将样品在4％PFA中固定在4°C下过夜
，然后在PBST中两次洗涤10分钟，然后在室温下在甲醇中洗涤3小时 。将组织保存在PBS中 ，并在环光系统（Fibre-Lite）下使用SMZ1500显微镜（Nikon）成像
。对于茎的横截面
，如“ Xenia再生，BRDU标记和Edu Pulse – Chase”中所述 ，对整个安装样品进行了冷冻截面的处理。 　　为了可视化内共生细胞中的RNA表达
，我们使用了超敏感的RNASCOPE ISH方法（晚期细胞诊断（ACD）） 。从ACD中订购了Lepin-或Granulin-1特异性寡核苷酸探针（有关更多信息，请参见补充表7）
。荧光RNASCOPE分析是根据制造商的协议由RNASCOPE多重荧光试剂盒（ACD）进行的。根据制造商的协议 ，通过RNASCOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPE（ACD）进行发色测定法 。这两种测定法使用了根据制造商协议制备的固定Xenia息肉的冷冻剖面
。 　　来自纳米孔的测序数据用于启动CANU（V.1.7）44的基因组组装。组装的基因组通过Nanopolish（V.0.9.2
，https：//github.com/jts/nanopolish）进一步抛光，并用5个循环进行了抛光 ，这导致了二倍体基因组的1,482高质量重叠群 。将二倍体基因组组装分离为单倍体245
。单倍体基因组组装进一步由3D DE NOVO组装管道，Juicer（V.1.5）14进行HI-C辅助支架。通过将所有Illumina基因组测序数据与组装基因组对齐
，我们在Xenia sp的整个组装基因组中发现了0.45％的单核苷酸多态性（SNP） 。 　　使用FunAnnotate基因组注释管道（V.1.3.3，https：//github.com/nextgenusfs/funannotate）用于注释Xenia sp。基因组
。简而言之 ，转录组数据由Trinity（v.2.6.6）46组装
，并用于基于Pasapipeline（v.2.3.2）47的mRNA的存在而生成基因模型。这些基因模型被用作奥古斯都（V.3.2.3）48和Genemark-es Suite（V.4.32）49的训练集来执行从头基因预测 。将Pasapipeline，Augustus和Genemark预测的所有基因模型合并 ，并受到EvidenceModeller的结合
，以生成组合的基因模型50
。如果超过90％的序列与repotmasker和repotmodeler（http://www.repeatmasker.org）确定的重复元素重叠，则预测基因被过滤掉。PASA进一步用于将3'和5'非翻译区域序列添加到其余预测的基因中 。PFAM（v.31.0） ，InterPro（V.67.0）
，Uniprot（V.2018_03），BusCO（v.1.0）51个数据库和蛋酒 - 映射器（v.1.3）52用于注释这些基因模型的功能
。在所有预测的基因中 ，转录组数据支持23,939（82.5％）的基因模型
，因为它们具有可检测的读数（读数> 0）。在这些模型中，有20,397个读数> 5 。 　　我们使用矫形器（v.2.2.7）根据列出的13种物种的蛋白质序列从不同物种中找到直系同源物 ，并推断了树木53,54
。简而言之，使用“ Orthofinder -s钻石-t 22 -m MSA -F FastA_Files ”来生成结果。Diamond（V.0.9.21）用于序列搜索
，将Orthofinder分组为308,348个基因（总计83.8％），分为19,244个正通群 。根据先前报道的方法55 ，一千六百个正凝群使用了至少10种具有单拷贝基因的物种
，用于推断该物种树
。通过MAFFT（v.7.407）对这些正型群进行多个序列比对，并修剪了八个以上缝隙的列。使用73.6％的数据占用率的修剪对齐（请参见图1D的源数据） ，以推断FastTree（v.2.1.10）的最大可能性无根树
，并在Orthofinder中使用默认配置 。该物种树进一步植根于步幅算法，该算法已被证明可以正确地植根于跨越各种时间尺度和分类学组的物种56。 　　原始的单细胞测序数据被删除并通过Illumina Bcl2fastAQ（V.2.20.0）软件转换为FastAQ格式
。Cell Ranger（v.3.1.0 ，https：//support.10xgenomics.com/single-cell-gene-gene-expression/software/software/overview/welcome）用于删除莫尔特普莱克样品样本
，过程条形码和计数基因表达。将序列与带注释的Xenia sp 。对齐
。基因组以及只有自诚的映射和非PCR重复读数用于使用“ CellRanger Count”命令为每个库生成基因表达矩阵。从每个文库中读取细胞环识别的细胞的表达矩阵，并用seurat进一步分析（v.3.0.2）57 。UMI数小于400的细胞或线粒体基因表达> 0.2％的总读数的0.2％被排除在下游分析
。为了进一步删除异常值 ，我们计算了每个单元格中检测到的UMI数量分布
，并在最高的1％分位数中删除了细胞。为了删除批处理效应并集成了来自不同库的数据，我们应用了Seurat v.3数据集成方法57 。对于每个数据集 ，我们确定了分散剂最高的前1000个基因
。我们在非再生样品中使用了前1,000个基因作为锚点特征来识别不同非再生数据集之间的锚点。前20个维度用于生成集成数据 。在集成数据上进行了尺寸降低，并用于进一步的聚类分析
。Seurat v.3进一步进行了非再生条件下的聚类和标记基因鉴定。用Seurat v.3中的标签转移方法鉴定了再生样品中的细胞簇 。所有小提琴图都是使用Seurat VLNPLOT函数生成的。 　　将FACS分离的含藻类或无藻类Xenia细胞的大量转录组数据比对与Xenia sp
。Star（V.2.5.3a）的基因组58。通过RSEM计算每个样品的单个基因表达（每千键酶的读数
，每百万映射读数）（v.1.3.0）59 。比较了使用SCRNA-SEQ鉴定的每个细胞簇中的每个基因中的平均UMI数量，将每个大量facs分离细胞的每个大量RNA-seq的基因表达水平与计算得出的基因表达水平进行了比较
。为每个比较计算了Pearson相关系数。 　　为了推断内共生Xenia细胞的轨迹 ，我们使用Seurat v.3整合了再生和非再生样品的SCRNA-SEQ数据 。所有属于内共生细胞簇（簇16
，总计382个细胞）的细胞均经过单片（v.2.10.1）29分析
。为了在这些单元格中找到可变基因进行下游分析，我们将这些单元格分为三个子集群 ，具有单欧集群函数（大多数参数的默认设置
，除了num_clusters = 4，生成了3个群集）。这三个子截面中的每一个都包含247
、53或82个细胞 。这三个子集群之间的前1,000个差异表达的基因用作订购基因 ，以通过DDRTREE算法构建轨迹
。使用单片中的差分函数检测到沿假期的差异表达基因。五个预测的内共生细胞状态中的每个细胞数为状态1 = 36
，状态2 = 109，状态3 = 155 ，状态4 = 45和状态5 = 37 。 　　根据说明30
，使用Velocyto.r程序（http://velocyto.org，v.0.6）进行RNA速度估计
。简而言之 ，赛车节使用再生样品的原始数据来计算每个基因的剪接（mRNA）和未贴花内含子读取以生成.loom文件。使用read.loom.matrices函数将此.Loom文件加载到R（v.3.6.1）中，并用于生成RNA速度图 。RNA速度图被投影到Seurat确定的T-SNE空间中。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得
。