PDAC组织是从维罗纳大学的一般和胰腺手术单元获得的。从获得标本的获取之前的患者获得了书面知情同意 。根据综合大学医院信托基金（AOUI）伦理委员会（Comitato Etetato eetico Azienda opsedaliera Integrata）批准的一项研究收集了用于建立PDOS和相关临床和随访数据的新鲜组织：批准编号1911年（协议编号61413 ，2018年9月1911年）。根据AOUI伦理委员会批准的协议编号，收集了FFPE组织
，并从ARC-NET生物库中检索
。 　　根据先前发布的程序17建立了PDAC PDO。病理学家检查了用于生成PDOS的标本以确认肿瘤细胞的存在 。简而言之，将组织样品切碎并用胶原酶II（5 mg ML-1; Gibco）和分散I（1.25 mg Ml-1; Gibco）在人分裂培养基（HSM; Advanced Dulbecco修饰的型培养基培养基培养基（Gibco）（Gibco）（Gibco）（Gibco）（gibco）（10毫米）（10毫米）中的培养基（;在37°C下 ，Gibco）和原蛋白（1 mg ml-1; Invivogen）最多2小时
，然后在37°C下额外的15分钟消化，tryple（Gibco）
。消化的材料嵌入生长因子还原成生长凝胶（Corning）中 ，并与人类完整培养基（+WR；小鼠表皮生长因子（50 ng Ml-1; Gibco）
，B-27补充（1x; Gibco），烟酰胺（10 mM; Sigma-Aldrich） ，n-n-lin-actyliceylichcysemstemnicrich mmssemine; s.25 mmsemine; s.25 mmsse;FGF10（100 ng ml-1; peprotech）
，Y-27632二盐酸盐（10.5 µm; Sigma），胃蛋白（10 nm; Tocris） ，TGFβ受体抑制剂A83-01（500 nm; tocris; tocris）
，wnt3a调节媒体（500 nm；和小鼠Noggin（100 ng ml -1; peprotech））。媒体每3-4天刷新一次 。为了进行器官的传播，将融合的类器官从基质凝胶中去除 ，通过移液散发到小细胞中，并重悬于适当量的新鲜基质中
。所有器官模型均作为HCMI（https://ocg.cancer.gov/programs/hcmi）的一部分获得
，可从美国类型文化收藏（ATCC）访问。对于每个PDO，补充表1提供两个唯一的标识符（研究ID和HCMI ID） ，以及与相应情况相关的临床和后续数据 。可以在HCMI可搜索目录（https://hcmi-searchable-catalog.nci.nih.gov/）中查询HCMI ID
。在9个PDOS上评估了器官培养物对WNT3A和RSPO1的依赖性（VR01
，VR02，VR06 ，VR09
，VR09，VR20 ，VR21
，VR21，VR23 ，VR29
，VR29和VR32）。Organoid cultures were passaged once a week with a splitting ratio of 1:3 in +WR or human-depleted media (−WR; mouse epidermal growth factor (50 ng ml−1; Gibco), B-27 supplement (1X; Gibco), nicotinamide (10 mM; Sigma-Aldrich), N-acetylcysteine (1.25 mM; Sigma-Aldrich), FGF10（100 ng ml -1; peprotech）和胃蛋白（10 nm; tocris）） 。为了建立WRI PDO，将建立并在 +WR中建立和传播的类器可以保留在-WR中 ，直到WRI出现为止
。由于-WR诱导的细胞死亡，培养基每3天刷新一次
，每14天矩阵就不传播培养物，直到Wri Pdos的出现为止。通过绘制在-WR培养的不同日期 ，通过绘制DOM的数量（一个圆顶是指50μl的Matrigel）来获得WRI PDOS的生长曲线 。在收集中期扩散和蛋白质之前
，将WRI PDO重新引入 +WR或维持–WR（对照）的五个段落。为了获得“晚期” pdos，在 +WR培养基中建造40次器官
。对于WNT-C59实验 ，在Wnt-C59（100 nm; SelleckChem）的存在下
，每7天将基线和改编的类器官进行每7天的分裂比为1：3。在分裂的当天和培养3天后，将WNT-C59添加到培养物中 。通常 ，使用mycoalert支原体检测试剂盒（LONZA）对类器官进行了支原体污染的测试
。 　　在37°C的HSM（2 mg ml -1; dispase I溶液）中稀释有机体
，在37°C下稀释20分钟以消化基质。此后，使用Tryple（Gibco）在37°C中分离10分钟 ，在37°C下再孵育10分钟
，然后吸管以获得单细胞悬浮液 。 　　如前所述，将PDO分离为单个细胞 ，并在 +WR中的Matrigel（每个条件下有100,000个可行的细胞）中铺路
。在 +WR中的器官改革后，PDOS在HSM中饿了一夜之间。在收集和隔离RNA之前
，用 +WR，-WR或HSM刺激PDOS刺激PDO ，持续8小时 。 　　如前所述
，将器官分离为单细胞
。在96孔板中，将一千个活细胞铺在100 µL 10％矩阵/培养基中的100 µl/培养基中 ，一式三份。一旦改革类型器官
，镀金后40小时加入JQ1（500 nm; S7110，Selleckchem）或车辆 。治疗72小时后 ，按照制造商的说明
，使用CellTiter-GLO（Promega）评估细胞活力
。将结果标准化为每个PDO的车辆控制。同时，将20,000个活细胞每50μl矩阵铺板并补充培养基 。器官改革后 ，用JQ1（500 nm）或媒介物对照处理细胞
，RNA和中期扩散在72小时后收集。 　　为了过表达MYC，我们使用了一个带有MYC开放阅读框架的慢病毒矢量（MGFP标记； RC201611L4 ，Origene）
。慢病毒是通过转染含有MYC的质粒而产生的，以及X-Tremegene9（6365779001
，Roche Sigma-Aldrich）的包装质粒VSV-G在HEK293T细胞中产生。转染后48小时收集病毒上清液，并根据制造商的说明使用Lenti-XTM QRT – PCR滴定套件（Takara Bio）进行定量 。Plenti-C-Myc-DDK-P2A-PURO Lentiorf对照颗粒（PS100092V ，Origene）用作非靶向对照
。慢病毒条形码文库是通过转染质粒库和包装质粒PMD2.G和PSPAX2（来自D. Trono的礼物； Addgene质粒＃12259和Addgene质粒＃12260）来生成的。根据制造商的说明
，转染后48小时收集了病毒上清液，并用Lenti-X浓缩剂（Clontech）浓缩 。将病毒颗粒重悬于Opti-MEM（Life Technologies）中 ，使用荧光测定法滴定并存储在-80°C下
。为了感染
，将器官分解为单个细胞，重悬于感染培养基（DMEM； Gibco） ，5％胎牛血清（FBS； Gibco）和1％Penicillin -streptheptycin（Gibco）中
，并补充了1μgMl -1 -1多培养烯和溶植物颗粒。然后在室温下将细胞纺丝1小时，并在37°C下孵育16小时 。然后收集感染的细胞 ，嵌入基质中
，并用 +WR培养基覆盖
。使用2 µg mL -1紫霉素（Gibco）在感染后48小时开始选择抗生素。 　　对于条形码实验，我们在Pscribe4-RFP-Puro（Cellecta）套件中使用了Clonetracker XP 3M Barcode-3'库中的1M-Barcode池 。我们感染了5×105细胞 ，具有0.1感染病毒的多样性，以获得每个细胞单个条形码的细胞群
。感染后
，使用2 µg mL -1的嘌呤霉素（Gibco）对类器官进行抗生素选择。然后将条形码器官分为两个条件： +WR（对照）和-WR（选择性压力），每个条件至少重复两个 。收集了一块条形码器官的等分试样以进行DNA提取（P0）。在收集颗粒之前 ，将控制条件扩展了五个段落
，而在WR独立时出现时，在存在选择性压力的情况下重复的颗粒
。 　　在37°C的培养基中 ，在培养基中将类器官与Colcemid（1 µg ML -1; Gibco）一起孵育过夜。孵育后
，如先前所述，将器官分离为单细胞 。在室温下 ，将单细胞在低渗溶液（氯化钾0.56％和柠檬酸钠0.8％）中孵育20分钟
。然后将核固定在冰冷的甲醇 - 乙酸中（3：1）
，用甲醇 - 乙酸洗涤（2：1），并在粘附显微镜幻灯片上掉落。 　　使用Zytolight Spec Myc/Cen8双色鱼探针（Zytovision）进行DNA鱼 。在杂交之前 ，将组织脱蜡和再水化
，在85°C下用0.1柠檬酸盐缓冲液（pH 6）溶液预处理30分钟，然后在37°C下进行胃蛋白酶处理（4 mg ml-1 in 0.9％NaCl ，pH 1.5）4分钟
。对于组织和PDOS，将探针应用于载玻片上并用橡胶水泥密封
，并在80°C的加湿气氛（热燃料系统）中孵育10分钟，以使探针和DNA靶标变性。然后将载玻片在37°C下孵育过夜 ，以允许杂交 。然后除去橡胶水泥和盖玻片
，并在室温下以2x SSC/0.3％NP-40在2x SSC/0.3％NP-40中洗涤载玻片，然后在72°C下持续2分钟
。杂交后洗涤后 ，将载玻片用DAPI1μgml-1（Kreatech
，Leica）对抗。对于组织和嵌入的类器官，在FV4000共聚焦显微镜（Olympus Life Science）上获得了图像 。以蓝色（DAPI）获取并可视化细胞核
。对于PDO ，用Leica TCS SP5荧光显微镜获取图像。如前所述6
，使用Find插件最大化函数用FIGH（ImageJ2 v2.9.0/1.53T）对每个核的每个探针的荧光信号数量，均用fiji（ImageJ2 v2.9.0/1.53T）量化 。6。如Hung等人28所述 ，通过自相关函数来量化相间的ECDNA聚类
。 　　为了进行组织病理学分析
，如先前所述，使用分配I溶液从Matrigel释放了器官 ，并用10％中性缓冲的福尔马林固定20分钟，并嵌入Histogel加工凝胶中（Fisher Scientific）。根据常规的组织学程序处理组织凝胶包裹的类器官
，并嵌入石蜡中 。为了说明介质的效果，将 +WR PDOS放入-WR 24小时之前 ，然后嵌入和固定
。按照所报道的原始抗体（MyC
，MyC，Ali415G7 ，生物保健
，生物保健），对FFPE组织和类器官的切片进行了血久毒素和曙红（H＆E）染色和免疫染色 ，并在FFPE组织和器官的切片上进行了降血病和曙光。1：500）
，GATA6（多克隆； AF1700，IHC的R＆D系统 ，稀释1：200）
，ΔNP63（克隆BC28，PA0163 ，for IHC），CK5
，CK5（克隆XM26，PA0468 ，NOVACASTRA
，NOVACASTRA，for IHC ，cR53
，CR53和CLUTURITION 1：100）和CLITURE 1：100）和CLECH 2：2：2：1：100）和γH2（cl5）（2：2：2：1：100）（2：1：1：1：1：1：1：1：1：1：2：14-9865-82，免疫荧光的Ebioscience ，稀释1：500） 。对于免疫荧光
，我们使用以下二级抗体：Alexa Fluor 488驴抗小鼠（A21202，Lot 1423052 ，Invitrogen
，Invitrogen，稀释1：500） ，Alexa Fluor Plus555山羊抗兔（A32732，A32732
，lot vc297826，Invitorgen ，dimution
，dimution，dimution ，a32732
，lot
。然后，使用Aperio扫描范围XT幻灯片扫描仪（Aperio Technologies）对免疫组织化学载玻片进行扫描和数字化。在组织中 ，在每个组织的20个区域对MYC染色进行定量
，并报告为H得分 。在类器官中，使用Aperio ImageScope将MYC和GATA6染色定量为每个器官的阳性核的百分比
。对于免疫荧光 ，通过FV4000共聚焦显微镜（Olympus Life Science）获取图像
，并使用ImageJ（https://imagej.nih.gov/）进行量化。 　　如前所述，从基线PDOS获得了单细胞悬浮液 ，然后使用cytospin 4 cytecentrifuge在载玻片上以1,000 rpm的速度旋转5分钟，并由4％多聚甲醛（PFA）固定15分钟 。在PBS洗涤后
，将细胞用0.4％Triton透化10分钟，并在阻断溶液中孵育1小时（5％BSA ，5％山羊血清和0.1％Triton）
。After incubation with primary (MYC; ab32072, Abcam, dilution 1:500) and secondary (Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit; A-21245, lot 2833435, Invitrogen, dilution 1:500) antibodies, cells were fixed again with 4% PFA for 10 min and washed with 2X SSC buffer.如前所述
，应用了Zytolight Spec Myc/Cen8双色鱼探针（Zytovision）。使用FV4000共聚焦显微镜（Olympus Life Science）获取图像，并使用ImageJ（https://imagej.nih.gov/）量化图像 。 　　在 +WR和-WR中培养基线和WRI器官3天。在第3天 ，将带有EDU（​​10μM）的新鲜培养基添加1小时
，然后再收集器官和分离为单细胞悬浮液
。细胞在载玻片上旋转，用4％PFA固定 ，并在PBS中用3％BSA洗涤。按照制造商的说明进行EDU检测（Click-It EDU成像套件Alexa Fluor 555
，C10338，Invitrogen） ，然后第二次使用4％PFA固定10分钟 。如前所述
，使用Zytolight Spec Myc/Cen8双色鱼探针（Zytovision）进行鱼类
。使用FV4000共聚焦显微镜（Olympus Life Science）获取图像，并使用ImageJ（https://imagej.nih.gov/）量化图像。 　　按照制造商的说明 ，使用RNASCOPE多重荧光试剂盒V2（323100，Bio-Techne）进行嵌入式器官的MYC mRNA原位检测 。使用靶探针HS-MYC-C2（311761-C2
，Bio-Techne）以及Opal 570荧光团
。使用DAPI荧光染料对核进行了反染色并观察。使用FV4000共聚焦显微镜（Olympus Life Science）获取图像，并使用ImageJ（https://imagej.nih.gov/）量化图像 。 　　使用补充蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma）和磷酸酶抑制剂磷酸磷酸酯（Roche）的细胞裂解缓冲液（细胞信号技术）制备蛋白质
。Protein lysates were separated on 4–12% Bis-Tris NuPAGE gels (Life technologies), transferred to a PDVF membrane (Millipore) and then incubated with the reported antibodies: MYC (clone Y69, ab32072, lot 1012026-1, Abcam, dilution 1:1,000), γH2AX (clone EP854(2)Y,AB81299 ，批次GR3203642-4
，ABCAM，稀释1：1,000） ，GFP（克隆D5.1
，2956，Lot 6 ，lot 6
，细胞信号技术，稀释1：1,000） ，GAPDH（克隆D16H11
，5174，Lot 6 ，Lot 6，Cell Signaling Technologies
，blot Sindignogies，polution tirution ，polution 1：5,000）和历史悠久33（5,000）。2698469
，Sigma-Aldrich，稀释1：5,000）初级抗体和过氧化物酶偶联的伴有驴抗兔（Polyclonal ，711-035-152
，Jackson Immunoresearch Laboratories）二级抗体 。为了说明介质的效果，在收集细胞沉淀之前将 +WR PDOS放入-WR 24小时
。有关凝胶源数据 ，请参见补充图1。 　　使用TRIZOL试剂（Life Technologies）分离来自类器官的RNA
，然后是基于柱的Purelink RNA迷你试剂盒（Thermo Fisher Scientific） 。使用TAQMAN逆转录试剂（Applied Biosystems）进行1 µg RNA的逆转录，并在PCR中使用20 ng的cDNA。使用以下Taqman探针HPRT1（HS02800695_M1）和LGR5（HS00173664_M1）
。以下引物（EUROFINS）与SYBR Green PCR Master Mix（Thermo Fisher）一起使用：Myc Forward：CCTGGTGCTCCATGAGGAGAG；MYC反向：cagactctgacttttgccag;GAPDH前进：Acagttgccatgtagacc;gapdh反向：tttttggttgagcacagg。 　　使用序列检测系统软件v1.9.1（Applied Biosystems）使用ΔΔCT方法进行相对基因表达定量 。 　　在4°C下在细胞回收溶液（Corning）中孵育30分钟以去除基质凝胶 ，并通过在4°C下以10,000g离心5分钟来消除基质
。对于组织
，通过病理学家评估了鼻虫冻结PDAC组织的切片的肿瘤性细胞百分比，并且仅使用了肿瘤细胞超过20％的组织。对于WGS和面板DNA测序 ，使用Dneasy血液和组织试剂盒（Qiagen）进行DNA分离 。对于圆形序列，使用MagAttract HMW DNA试剂盒（Qiagen）提取高分子量DNA
。 　　DNF-467基因组DNA 50 kb试剂盒在生物分析仪2100（Agilent）上评估了DNA质量。使用Novaseq 6000 S4试剂盒V1.5（300个循环）以15倍覆盖范围制备并测序库
，每个样品的1.6亿读 。 　　预先处理测序数据，并使用NF核/SAREK管道（v3.0.2）51映射到参考基因组
。In brief, Fastp (v0.23.2)52 removed low-quality bases and adapters, BWA Mem (v0.7.17-r1188)53 mapped trimmed reads to the reference genome GRCh38 (v1.4.4), provided by the Genome Reference Consortium (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/grc), mapped reads were marked for使用PICARD MAXDUPLICATES（v4.2.6.1）进行了重复 ，并使用GATK BASERECALIBRIBITATOR（v4.2.6.1）重新校准了读取基本质量得分
，并且GATK Applip applipbqsr（v4.2.6.1）54。 　　使用NF核/CircDNA（v1.0.1; https：//github.com/nf-core/circdna）管道分支“ AmplicOnArchitect ”来定义每个WGS样本中的扩增子类 。NF核/CircDNA使用CNVKIT（v0.9.9）55调用复制号码，并通过利用AmpliconSuite-Pipeline的功能（https://github.com/jluebeck/jluebeck/ampleconsuite-pipeline）来准备放大段 ，副本编号大于4.5的副本编号大于4.5
。在对齐的读取和放大种子上运行扩增的（V1.3_R1）20
，以描绘扩增子结构。然后，使用扩增子（V0.4.11）56将鉴定的扩增子分类为圆形（ECDNA） ，线性（线性扩增子）
，复杂（复杂扩增子）或BFB（带有断裂融合式桥梁签名）的复杂（复杂扩增子）或BFB（amplicon） 。至少包含一个圆形扩增子（ECDNA）的样品称为“ eCDNA+”，而没有eCDNA扩增子的样品称为“ eCDNA-
”。样品还分为“圆形” ，“线性 ”
，“复杂
”，“ bfb”或“ no-fscna ”（未检测到的无焦粒体拷贝数放大） ，由它们所包含的扩增子类型（请参见Kim等人，请参见Kim等人21）
。基于优先级最高的扩增子对具有多个扩增子的样品进行了分类。优先级是：循环> BFB>复合物>线性 。如Luebeck等56所述
，根据扩增子区域和断点重叠计算了扩增子相似性评分及其P值
。 　　WGS样本的副本号码由CNVKIT（v0.9.9）55生成。然后将确定的片段归类为增益（拷贝数≥3），损失（拷贝数≤1）或深度损失（拷贝数≤0.25） 。 　　使用R包装CinsignatureQuantification 25评估了WGS拷贝数曲线的评估染色体不稳定性特征 ，包括CX9复制应力特征
。 　　使用紫色（v3.8.1）57得出样品倍虫
，该57分别使用读取深度比和肿瘤B等位基因频率（v3.9）和Amber（v1.14）（https://github.com/github.com/hartwigmedical/hmftools）来估算拷贝数和倍曲。钴，琥珀和紫色仅使用其默认参数以仅肿瘤模式使用 。值得注意的是 ，使用紫色的纯参数值的纯度值将所有样品的纯度设置为1
，从而确保了分析中的一致性
。 　　为了富含圆形DNA进行测序，将每个DNA样品连续7天消化 ，用ATP依赖性质粒 - 安全DNase（Lucigen）去除线性/染色体DNA。每天加入20个单位的酶和4 µL 25 mM ATP溶液 。7天后
，将DNase在70°C下热灭活30分钟
。线性DNA中的倍数变化通过靶向染色体基因HBB和线粒体基因MT-CO1的QPCR评估。如Koche等人58所述，用PHI29聚合酶进行了圆形DNA的扩增 。然后准备放大的圆形DNA进行测序。简而言之 ，将大约550 ng的DNA剪切至平均长度约为400-450 bp
，并使用Nebnext Ulta II DNA库库准备Illumina（NEB）进行库准备，其中包括添加了测序适配器和放大
。使用Agencourt Ampure XP磁珠进行DNA清理。使用Illumina NextSeq500对所有准备好的库进行了测序 ，其中NextSeq 500/550中输出套件v2.5（300个周期），每样品中生成约1000万个配对端150 bp读数 。 　　使用castadapt（v3.4）59对质量和适配器序列进行了测序读数
。使用BWA MEM（V0.7.17-R1188）53将修剪读数与GRCH38参考基因组对齐。 　　使用默认值的DeepTools“ BamCoverage
”（v3.5.1）60计算每个50 bp bin的测序读取覆盖范围 。为了可视化
，将50 bp的读取覆盖值合并为10,000 bp bin，使用基因组化的“ scorematrixbin”（v1.2.6）r package61组合
。 　　VR01和VR06断点序列是通过扩增结构来推断的 ，用于设计以下引物：VR01向前（5'> 3'）：Tacatgggggggtctctgctcctcctgc;VR01反向（5'> 3'）：agcctgtcctttttcccacccca;VR06向前（5'> 3'）：TGCCTGCTTGTGTGTGAACTTGGCT;VR06反向（5'> 3'）：Aggtgggggggcctaaaa。 　　通过含有30 ng的GDNA
，2.5μl缓冲液（Quantabio），0.5μl10 mM NTP混合物（Thermo Fisher Scientific） ，1μL引物和0.25μL的Certart II TAQ DNA聚合酶（Quantabio）的PCR扩增断点区域 。PCR扩增的循环条件为95°C 2分钟
，然后在95°C的35个循环中持续30 s，65°C 30 s ，在72°C下进行30 s
，最后一步在72°C下进行5分钟
。使用5300碎片分析仪（Agilent）对PCR产物进行了验证，并使用ExoSap-It PCR产品清理试剂（Thermo Fisher Scientific）纯化 ，并使用BigDye Terminator v3.1（Thermo Fisher Scientific）对应用生物系统3500DX Genetic Analister（Thermo Fisher Sciention）（Thermo Fisher Scientific）对毛细管电泳进行测序。使用引物爆裂物将测序数据与人基因组DNA排列 。 　　DDPCR是在QX200 DDPCR系统（Bio-Rad Laboratories）上进行的
。对于VR01和VR06
，使用Bio-Rad Laboratories软件（https://www.bio-rad.com/digital-com/digital-ashays-assays-assays-assays-assays-assays-create/cnd），在每个ECDNA的互连断点上设计了针对拷贝数变化（CNV）的探针。以前通过扩增结构来推断这些断点 ，并通过Sanger测序验证（扩展数据图1H） 。使用的其他探针可在商业上获得（Bio-Rad实验室）：MYC（FAM DHSACP2500322），EPHA3（FAM DHSACP52506272）和TTC5（HEX DHSACP2506733）作为VR01和VR01和VR06和VR06的参考基因（FAMSAC272227222722252525252525252525252525252525252525）。（十六进制DHSACP2506723）作为VR23的参考基因
。按照制造商的说明（Bio-Rad Laboratories）
，使用DDPCR Supermix进行探针进行扩增。每个反应在20μl的体积中使用1 ng的基因组DNA，其中包含探针（来自20倍库存）和限制酶（来自5UμL -1） 。根据制造商的协议（Bio-Rad Laboratories） ，自动液滴发生器将反应分为大约20,000滴
。然后将液滴转移到96孔PCR板上
，并使用PX1 PCR密封剂（Bio-Rad Laboratories）进行热密封。PCR扩增的循环条件为95°C，持续10分钟 ，然后在94°C的40次循环中持续30 s和60°C 60 s
，最后一步在98°C持续10分钟 。热循环后，使用QX200液滴数字PCR系统（Bio-Rad Laboratories）扫描每个液滴
。每个荧光振幅（HEX和FAM）中的正和负液滴是根据荧光振幅区分的 ，使用由负液滴的不完善的荧光探针引起的最小固有荧光信号所设定的全局阈值
，与液滴探针中的不完善的荧光探针在液滴信号中，与液滴探针中的液滴信号相比 ，与液滴信号相比
，与液滴探针（或具有amppleified amplified splyplate）（或触发）（均为脉冲）。Quantasoft（v1.3.2.0） 软件用于分析CNV 。 　　如前所述分离基因组DNA，并使用Qubit 4荧光计（Thermo Fisher Scientific）进行定量
。我们从Clonetracker XP库中扩增了条形码 ，并添加了Illumina适配器以及使用NGS Prep Kit用于pscribe（LNGS-300）中的条形码库的独特样品索引序列进行多重测序。使用25 ng基因组DNA和以下循环条件进行第一个PCR：95°C和65°C的30个循环均为30 s，持续30 s
，持续68°C 2分钟 。首轮PCR的5μL等分试样用于在以下循环条件下进行的第二轮PCR：12个95°C和65°C的12个循环均为30 s和68°C，持续2分钟
。通过片段分析仪进行高灵敏度NGS试剂盒（安捷伦技术）进行定量后 ，我们首先将每个样品中的PCR产物以相同的量组合在一起
，然后我们使用QIAGEN QIAGEN QIAQUICK PCR PCR纯化套件根据制造商的协议纯化并浓缩了池。我们使用Nanodrop分光光度计（Thermo Fisher Scientific）对库池进行了量化，然后在NextSeq2000（Illumina）上使用自定义读取和索引引物进行测序 ，以每样品的深度为500万个读取
，生成150 bp的配对读数 。在尖刺的phix控制中，通过在自定义读取中添加标准的Illumina底漆来测序10％。 　　使用BWA（V0.7.18）和RSubread软件包（v2.18.0）的特征（v2.18.0）对基因组DNA测序的条形码进行了定量
。首先是从Cellecta提供的条形码池生成的FASTA参考文件。然后 ，使用BWA-MEM（V0.7.17-R1188）算法将测序读数与参考对齐 。随后
，由R Package RSubRead中实现的功能功能，随后使用所得的BAM文件来量化条形码丰度
。为了确定主要条形码的存在 ，我们选择了在每个条件下频率超过总条形码频率的10％的人。 　　使用SureSelectxt HS目标富集系统（Agilent）进行库制备 。在NextSeq 550（Illumina）上进行了面板配对2×150测序
。在补充表3中报道了面板中存在的基因。 　　使用TRIZOL试剂（Life Technologies）分离来自类器官的RNA
，然后是基于柱的Purelink RNA迷你试剂盒（Thermo Fisher Scientific） 。使用Bioanalyzer 2100（Agilent）上的RNA 6000纳米试剂盒评估纯化的RNA质量，仅使用了大于9的RNA完整性数的RNA
。使用Trueseq绞合的mRNA库预备套件（Illumina）的poly（a）富集获得RNA测序库。在基线时从PDOS获得的库（n = 14；图1中显示的分析）被测序为3000万片段的深度和150 bp的配对末端读数 ，上面是Illumina NextSeq 500 Suequern 。为了比较 +WR和WRI PDOS，在RNA收集之前
，将 +WR PDOS放入-WR 24小时，以解释介质的效果
。在Illumina NextSeq 500 Sequencer上 ，将所得的库被测序为1100万个片段的片段和75 bp配对的读数。 　　使用Star（v2.7）将读取与GRCH38基因组对齐
，并用RSEM（v1.3.3）对转录本进行定量 。对于下游分析，使用DESEQ2 R软件包的“ RLOG ”函数将原始计数归一化。在归一化之前 ，除去所有PDO的总数少于20个计数的基因
。为了比较跨扩增子类型的基因表达值
，将标准化的基因值归一化。 　　如前所述62，使用ICGC（n = 50）和PDOS（n = 14）的肿瘤肿瘤的肿瘤纯度（如前所述62） 。 　　使用“ DESEQ2
”（V1.34.0）63进行了差异基因表达分析
。使用“ ASHR”方法64中DESEQ2中的“ LFCSHRINK ”功能应用Log2折叠变化收缩。使用“ FGSEA
” R软件包（v1.20.0）65进行基因集富集分析 ，并使用“ MSIGDBR” R软件包（v7.5.1）提供的Hallmark Pathways数据库66进行 。 　　根据Raghavan Signatures41对样品进行了亚型
，具有基因集变异分析功能（V1.42.0），并根据哪些签名（基础或经典）获得最高分数
。 　　对适应器官进行了融合分析 ，以排除重新激活Wnt途径的嵌合蛋白的存在。NF核/RNAFusion（v3.0.0）管道用于评估我们的RNA测序数据中的基因融合；该管道使用提供的所有融合检测工具（arriba
，fusionCatcher，bizzly ，squid，starfusion和stringtie）在默认参数下运行 。至少两个工具检测到的融合被认为是自信的
。 　　使用人多组织和癌症面板（377个基因）以及一个37个基因的自定义面板（补充表6）
，将四个患者FFPE组织（ECDNA+ n = 2和ECDNA-N = 2）表征为原位空间转录组学（10倍基因组学）的位置空间转录组学。根据制造商的协议对FFPE样品进行处理和分析，没有任何修改 。如Xenium方案中所述进行了Xenium h＆e染色
。我们总共获得了807,253个细胞 ，平均为100 µm2的解码转录本的平均值
，转录本的质量高（PHRED质量得分≥20）以上92％。质量控制后，我们保留了805,966个细胞进行后续分析 。在Seurat（v5.1.0）中进口原始的Xenium数据 ，并使用倒数主成分分析集成以删除批处理效应校正。用莱顿聚类以0.2的分辨率鉴定细胞簇
，并用R package Presto（v1.0.0）鉴定簇标记
。Seurat簇注释在Xenium Explorer（10x Genomics，v3.1.0）中导入 ，以与H＆E图像进行可视化和集成。 　　所有统计分析均使用R（v4.1.2）或GraphPaDism（v9.5.1）进行 。Fisher的精确测试和卡方检验用于评估应急表中的重要性
。Wilcoxon秩和测试用于两组比较
，并使用Pearson相关性测量了两个定量变量之间的关系。进行的其他统计检验在图或图传说中描述 。 　　ICGC PACA-CA和PACA-AU WGS样品的扩增信息来自Kim等人21
。从ICGC数据门户（https://dcc.icgc.org/releases/pcawg）中检索了其他匹配的拼字数据。特别是专门研究PDAC，仅具有组织学类型的“ 8500/3 ” ，“ 8560/3”
，“ 8140/3
”，“ 8140/3” ，“腺泡癌 ”和“胰腺导管腺癌
”的PDAC肿瘤用于下游分析 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得
。