没有使用统计方法来预先确定样本量 。实验不是随机的 ，研究人员在实验和结果评估过程中并未对分配视而不见 。
对编码SARS-COV-2 MPRO（NC_045512）的全长基因进行了优化并合成用于大肠杆菌表达（Genewiz）。先前已经报道了生产正宗病毒MPRO的克隆策略10 。将表达质粒转化为大肠杆菌BL21（DE3）细胞 ，然后在37°C下含有100μg/ml氨苄青霉素的Luria肉汤培养基中培养 。当细胞在600 nm的0.6-0.8时生长至光密度时，将0.5 mM IPTG添加到细胞培养物中 ，以在16°C下诱导表达。10小时后 ，通过3,000克离心收集细胞 。将细胞颗粒重悬于裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.0，300 mm NaCl）中 ，通过高压均质化裂解 ，然后以25,000g离心40分钟 。将上清液加载到Ni-NTA亲和力柱（Qiagen）上，并在含有20 mM咪唑的重悬式缓冲液中洗涤。His标记的MPRO被切割缓冲液（50 mm Tris-HCl pH 7.0，150 mm NaCl）洗脱 ，包括300毫米咪唑。添加了人类鼻病毒3C蛋白酶以去除其标签的C端 。通过离子 - 交换色谱和尺寸排斥色谱进一步纯化MPRO 。冠状病毒MPRO作为溶液中的单体和二聚体的混合物存在33。纯化的MPRO存储在50 mM Tris-HCl pH 7.3 ，1 mm EDTA中 。
SARS-COV-2 MPRO与10 mM N3孵育30分钟，并通过在20°C下通过悬挂滴蒸气扩散法结晶络合物（5 mg/ml） 。最好的晶体是用井的缓冲液生长的 ，其中含有0.1 M MES pH 6.0 、2％聚乙烯乙二醇（PEG）6000 ，3％DMSO，1 mm DTT。冷冻保护剂溶液中包含0.1 M MES pH 6.0 ，30％PEG 400 。
使用Eiger X 16M图像板检测器 ，在100 K和1.07180Å的波长下，在上海同步辐射设施（SSRF）上收集X射线数据 。使用程序XIA234进行数据集成和缩放。该结构是通过使用SARS-COV MPRO（RCSP蛋白数据库代码（PDB）2H2Z）作为搜索模板在CCP436中用移相模块的分子替换来确定结构的 。随后 ，通过COOT37进行了手动模型调整的迭代周期 ，并用phenix38完成了手动模型调整的迭代循环 。抑制剂N3是根据省略地图构建的。扩展数据表1总结了相分和改进统计 。RWORW和RFRE值分别为0.202和0.235 。在拉马坎德兰地块最有利的地区，有97.3％的残留物 ，在不允许地区没有发现残基。
以前已经描述了酶活性测定10。简而言之 ，使用320 nm和405 nm的波长分别用于激发和发射，用底物MCA – AVLQ↓SGFR-K（DNP）K（DNP）K（GL Biochem）测量SARS-COV-2 MPRO的活性 。该测定最初是立即将0.2μMSARS-COV-2 MPRO与不同浓度的底物（2.5-100μm）混合 。使用设想多模板读取器（Perkin Elmer）监测荧光强度。通过将曲线的线性部分拟合到直线来获得初始速率 。动力学参数km和kCAT是从双向重点图计算得出的 。由于N3是SARS-COV-2 MPRO的一种基于机制的不可逆抑制剂，因此KOBS/[I]被用作伪秒速率常数的近似值 ，以评估抑制剂N3的抑制作用（参考文献12）。在这种情况下 ，用0.2μm的酶，20μM的底物和抑制剂以6种不同的浓度（0-1μM）进行测量 。
虚拟筛选是通过我们的内部数据库通过Glide（v.8.2）22在Maestro中（Schrödinger2019-1A）进行的 。数据库中的所有化合物均被认为在pH 7.4±0.2处 ，以使用程序EPIK39估算其质子化状态。它们的三维（3D）构象由大师的Ligprep模块产生 。SARS-COV-2 MPRO（PDB 6LU7）的结构用于生成用于对接模拟的受体网格 。根据N3在结构中的位置确定网格活性位点的中心。考虑了C145 ，S46和Y54的侧链中受体羟基和硫醇基的柔韧性 。一开始，我们使用滑行标准精度模型进行了相对较快但原始的筛选 ，并保留了顶部20％的化合物 。最后 ，通过分析预测的结合模式及其得分来挑选候选分子。
对SARS-COV-2 MPRO的潜在抑制剂通过酶促抑制测定法进行筛选。当将不同的化合物添加到酶促反应混合物中时，计算初始速率的变化以评估其抑制作用 。五个药物库 - 批准的药物库（靶MOL） ，诊所化合物图书馆（Target Mol） ，FDA批准的药物图书馆（Selleck），天然产品图书馆（Selleck）和抗病毒药物图书馆（上海先进的Immunochemical研究研究所） - 使用了约10,000个化合物 。初步筛选反应混合物包括0.2μM蛋白 ，20μM底物和50μm化合物。感兴趣的化合物被定义为在没有抑制剂的情况下的反应中 ，抑制率超过60％的化合物 。使用0.2μM蛋白，20μM底物和11种不同抑制剂浓度测量7种药物铅的IC50值 。为了排除可能充当聚合器的抑制剂，通过在同一时间为反应中向反应中添加0.001％或0.01％的新鲜制成的Triton X-100来进行基于洗涤剂的控制。使用GraphPad Prism分析所有实验数据 。所有实验均以一式三份进行 。
为了了解这些分子与SARS-COV-2 MPRO的结合相互作用 ，使用了两种不同的分子对接方法（Glide（V.8.2）22和Ifitdock40）来预测其结合姿势。然后 ，使用3D分子相似性计算方法ShaftS41，通过与MPRO结构内N3分子与其他药物候选者之间的关键药物团和体积叠加匹配来列举分子比对源 。然后 ，使用这些分子获得的最佳叠加来评估从两种对接方法中的预测结合姿势的合理性 ，并且仅保留不同方法之间一致的结合方向来构建初始复合物 。最后，使用Schrödinger的MM-GBSA模块进一步优化并重新评估这些复合物 ，并完善了配体周围5Å以内的残基。
候选药物在VERO细胞上的体外抗病毒功效由QRT – PCR确定 。将约1×104的Vero细胞接种到96孔板中 ，并在37°C下孵育20-24 h 。所有感染实验均在BioSafety Level-3（BSL-3）上进行。用候选药物（10μM）预处理细胞1小时；随后添加SARS-COV-2（感染的多样性（MOI）为0.01），以允许感染2小时。然后 ，去除病毒 - 药物混合物 ，并用含新鲜药物的培养基进一步培养细胞 。感染后72小时，使用QIAAMP病毒RNA迷你试剂盒（Qiagen）从制造商的建议中从培养上清液中提取VRNA ，并使用SARS-COV-2特异性引物通过QRT-PCR分析检测到VRNA 。由于湿康蛋白在测试浓度下表现出细胞毒性 ，因此其抗病毒活性测定没有进一步进行。使用合成RNA片段确定每毫升vrna拷贝以扩增目标区域 。含有SARS-COV-2的S基因的线性化质粒进行体外转录 。纯化所得的RNA转录本，然后使用Nanodrop 2000（Thermo Fisher Scientific）上的分光光度法进行定量。使用无RNase水连续将纯化的RNA连续稀释，并使用QRT-PCR检测 。根据基因组等效拷贝数的对数 ，绘制了已知RNA浓度的阈值周期（CT）值 。最终的标准曲线用于确定样品中VRNA的基因组当量数量。检测极限的确定基于检测到VRNA并保持在标准曲线线性范围内的最低水平（CT值为38） 。SARS-COV-2的TAQMAN引物为5'-TCCTGGTGATTCTTCAGG-3'和5'-TCTGAGAGAGGGGGGGGGGTCAAGTGC-3' ，SARS-COV-2探头5'-FAM-AGAGCTGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCCAGCTGTGTCCACA-BHQ1-BHQ1-3' 。通过MTS细胞增殖分析（Promega）确定了在VERO细胞上测试药物的细胞毒性。将一千个细胞接种到96孔板中，并在37°C下孵育20-24 h 。之后 ，除去培养基 ，并将含有降低抗病毒浓度浓度的培养基添加到井中 。在37°C下孵育4天后，根据制造商的协议进行了MTS测定。所有实验均以一式三份进行。Vero细胞是从ATCC（美国型培养物收藏）获得身份验证服务的 。所有细胞系对支原体污染的阴性测试 。未使用普遍误识别的细胞系。
对于抗病毒测定 ，在VERO E6细胞中传播了SARS-COV-23的临床分离株 ，并如前所述确定病毒滴度43 。所有感染实验均在BSL-3上进行 。用不同浓度的cinanserin预处理1小时，将preseed的Vero E6细胞（每孔5×104个细胞）预处理 ，然后加入病毒（MOI为0.05） ，以使感染2小时。然后，去除病毒 - 药物混合物 ，并用含新鲜药物的培养基进一步培养细胞 。感染后24小时 ，收集细胞上清液，并对上清液中的VRNA进行QRT -PCR分析 。对于细胞毒性测定，将Vero E6细胞悬浮在96孔板的生长培养基中。第二天 ，将适当的cinanserin浓度添加到培养基中 。24小时后 ，根据制造商的说明，通过CCK8（Beyotime）测定法测量幸存细胞的相对数量 。所有实验均以一式三份进行。Vero E6细胞是从ATCC获得认证服务的 。所有细胞系对支原体污染的阴性测试 。未使用普遍误识别的细胞系。
将十万个E6细胞接种在24孔板中 ，并用不同剂量的抑制剂处理。所有感染实验均在BSL-3上进行 。将具有不同稀释浓度的抑制剂与SARS-COV-2（100个斑块形成单位）混合 ，并将200μl混合物接种到单层E6细胞上1小时 。去除上清液后，用DMEM培养基两次洗涤板 ，将细胞与含有适当浓度抑制剂的0.9％琼脂糖孵育。在感染后4天将覆盖层丢弃 ，并将细胞固定在4％的聚氧甲基中，并用晶体紫罗兰色工作溶液染色 。确定牙菌斑形成单位 。所有实验均在四个生物学重复中进行。
简而言之 ，将2.5μl化合物（DMSO中的10 mM）添加到50μLSARS-COV-2 MPRO（10 mg/ml）中 。将混合物保持在室温下30分钟 。液相色谱 - 质谱分析以正式离子模式进行 ，并使用四极时间质谱仪（Agilent 6550），以及高性能液态色谱仪（HPLC ，Agilent 1260） ，以检测完整蛋白的分子量。将样品从木星C4300ÅLC柱（2×150 mm，5μm）中洗脱，在15分钟的梯度上 ，从5％到100％乙腈 ，含有0.1％甲酸的乙酸以0.5 mL/min的流速为单位 。用双敏捷喷气流电喷射电压在正离子模式下的采集方法使用的毛细管温度为250°C，175 V的片段和3,000 V的毛细管电压 。使用Agilent MassHunter质量分析B.06.00软件与BioConfirm Workflow进行了质量解卷。
将样品沉淀并通过8 m尿素重新溶解 ，然后在25°C下通过胰凝乳蛋白酶以1:50（w/w）的酶与基底比以25°C消化16小时 。将消化的肽脱盐并加载到自制的30厘米长的拉头分析柱（reprosil-pur C18 aq 1.9-μm粒径 ，Maisch Dr Maisch，75μm内径×360-μm外直径） ，可连接到易于NLC1200 UHPLC（Hexterific）的易热科学分析 。用于肽分离的洗脱梯度和流动相构成如下：0-1分钟 ，4–8％B；1–96分钟，8–35％b;96–104分钟 ，35–60％b;105–120分钟 ，60–100％B（流动相位A：水中的0.1％甲酸；流动相B：80％乙腈中的0.1％甲酸）的流量为300 nl/min。从液相色谱柱中洗脱的肽通过应用远端1.8 kV喷射电压直接将电源涂到质谱仪中。在Orbitrap分析仪（Q Exprive，Thermo Fisher Scientific）中获得了调查全扫描质谱（从M/z 300–1,800） ，分辨率为M/z 400 ，分辨率为r =70,000 。前20个串联质谱（MS/MS）事件是顺序生成的，并从30％正常化的正常化符合度正常化的质量分配能量中进行了顺序生成并选择 。动态排除时间设置为10 s。一个采集循环包括一个全扫描MAS频谱，然后是前20毫秒/MS事件 ，在第一个到第一个最强烈的离子以28％的归一化碰撞能量中选择了第一个从全质量谱中选择的最激烈的离子 。使用Uniprotkb E. Coli数据库（2016年11月11日发布的数据库）和SARS-COV-2 NSP5分析了获得的MS/MS数据 ，使用Protein Discoverer 2.1分析 。为了准确估计肽概率和错误发现率， 我们使用了一个诱饵数据库 ，该数据库包含附加到目标数据库的所有蛋白质的反向序列。错误分辨率设置为0.01 。前体离子的质量公差设置为20 ppm 。辣椒蛋白被定义为裂解酶 ，而错过的切割位点的最大数量设置为四个。蛋白质N末端乙酰化，蛋氨酸氧化和共价结合物被视为可变修饰 。手动检查并标记了修饰的肽 。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。
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