通过将129S6/SVEVTAC雄性跨到C57BL/6J女性从Taconic（美国纽约州Germantown，USA）和Jackson Laboratory（Jax; Jax; Jax; Jax; Jax; Bar Harbour ，ME
，USA）进口的F1小鼠，分别将129S6/SVEVTAC雄性跨越129S6/SVEVTAC雄性跨越C57BL/6J女性获得了SCLC细胞的F1小鼠 。使用了9至19周之间的雄性和雌性小鼠 ，并将年龄
，垃圾和性别匹配的小鼠随机分配给实验组
。从杰克逊实验室获得了用于胞内注射SCLC细胞的NOD-SCID小鼠（PRKDCSCID； JAX菌株001303）。表达IPSAM4的细胞在7至11周龄的男性中注射 。年龄和垃圾匹配的小鼠被随机分配给实验组
。将配对的NE和非NE SCLC细胞注入8至12周大的动物中。年龄，垃圾和性别匹配的小鼠被随机分配给实验组 。用富含氧气的空气和3–3.5％异氟烷（Zoetis UK Ltd.）和超声引导（VEVO 3100; Fujifilm Visualsonics Inc.）的超声引导（fevo 3100;如先前所述42 ，进行了Dulbecco的PBS（DPB））。对于所有对癌细胞进行不同治疗的注射泛孢子症，该实验是由对实验组视而不见的研究人员进行的
。 　　为了在TTX预处理后移植SCLC NE细胞
，在注射前用1 µM TTX处理细胞24小时。注射后对肝脏进行25天（AF3062C）或34天（AD984LN_FL）采样 。注射前的基线体重对肝脏重量进行标准化
。称重后，将肝脏固定在10％中性缓冲福尔马林（NBF）中24-48小时。 　　自动SCLC肿瘤是从具有TRP53FL/FL ，RB1FL/FL
，RBL2FL/FL和GT（ROSA）26SORTM14（CAG-TDTOMATO）HZE等位基因（PRP130型号，如前所述）或TRP53FL/FL ，RB1FL/RB1FL
，RB1FL和RBL2FL和RBL2FL和RBL2FL和RBL2FL和RBL2FL和RBL2FL和RBL2FL和RBL2FL和RBL2FL和RB1FL，GT（ROSA）26SORTM1.1（CAG-TDOMATO/GCAMP6F）MDCAH/J等位基因（PRP130-SALSA6F型号） 。PRP130动物在混合的129S5/C57BL/6J背景下
。通过气管内给药AD5-CGRP-CRE腺病毒（每只动物2×108 pfu; VVC-Berns-1160;爱荷华大学载体核心；质粒来源：A。Berns和K. Sutherland） ，根据先前描述的方法诱导SCLC肿瘤形成 。通过常规计算机断层扫描（CT）扫描（量子GX2； Perkinelmer）监测肿瘤生长
，从病毒给药后5个月开始
。Animals that reached the humane end point (development of moderate breathing signs or weight loss below 15% of the maximum weight), typically in 7–10 months, were killed by an overdose of anaesthetic and processed for precision-cut lung slices or perfused transcardially with 20 ml of PBS containing 20 U ml−1 of heparin (H3400; Sigma-Aldrich) and 20 ml of 10% NBF.将解剖的肺在10％NBF中孵育24-48小时，然后在+4°C的PBS中储存在0.02％的叠氮化钠溶液中 ，直到使用。 　　来自PRM模型的SCLC肿瘤样品是从带有TRP53FL/FL
，RB1FL/FL和IGS2TM1（CAG-MYC*T58A/LUC）WREY等位基因（JAX菌株029971）的小鼠获得的 。SCLC肿瘤的形成是在11周龄时的气管内给药（每只动物1×108 pfu; VVC-Berns-1160）诱导的
。通过常规计算机断层扫描（量子GX2）监测肿瘤生长，从病毒给药后46天开始。病毒施用后的第89天达到人道的终点后 ，这些动物被宫颈脱位以收集肿瘤 。 　　Pulmonary NE cells were labelled by intratracheal administration of Ad5-CGRP-Cre adenoviruses (2 × 108 pfu per animal; VVC-Berns-1160) in 8- to 10-week-old Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze homozygous mice (Ai14 allele; JAX strain 007908).腺病毒滴注后1周收集肺，要么用于精确切割肺切片
，也可以在心心灌注后进行免疫荧光。 　　在弗朗西斯·克里克研究所（Francis Crick Institute）的特定无病原体设施中，将小鼠在弗朗西斯·克里克研究所（Francis Crick Institute）的特定无病原体设施中进行分组室 ，以22±2°C的环境温度为单独通风的笼子（GM500； TECNIPLAST）
，相对湿度为55±10％和标准的12-H光线/12-H光线/12小时黑暗的黑暗周期
。这些动物接受了标准的啮齿动物食品（2018 Teklad Global; Envigo）和随意的水。在任何实验中，肿瘤研究中的动物中的人道终点（中等临床体征 ，痛苦/痛苦或体重损失超过15％的体重） 。所有程序均根据1986年英国动物（科学程序）法进行
，该法案获得了由机构动物福利和道德审查机构（Francis Crick Institute PPL审查委员会）批准的，该机构是在英国家庭办公室批准的PP4103600批准PP4103600批准并由马萨诸塞州技术研究所（MIT）批准的（MIT）Instrucational Anternal Care Care和Instrutional Care Care和使用委员会进行的
。 　　如先前所述42 ，以下细胞系衍生自GEMM。特别是
，AF1165源自PR的原发性肿瘤 。ROSA26LSL-TOM/+鼠标
。AF3062C源自雄性PR的肝转移。ROSA26LSL-TOM/+鼠标 。AF1281M1在PR中化学疗法后源自复发性肿瘤
。ROSA26LSL-TOM/+鼠标。TP2031T2源自原发性PR肿瘤 。AD984LN_FL/AD984LN_ADH源自PR鼠标62中的同一淋巴结转移
。AF3291LN_FL/AF3291LN_ADH也源自Prpten小鼠中同一淋巴结转移。 　　PRM2.1A细胞系是从TRP53FL/FL中的原发性肿瘤内部派生的 。rb1fl/fl;如前所述，myclsl-t58a/+（PRM）鼠标63。简而言之 ，解剖原发性肿瘤
，切成小块，并在37°C下在6 ml消化溶液中孵育30分钟（10％Tryple（12605010; Gibco） ，1 mg ml-1胶原酶IV（17104019; Gibco）和1 mg ml-1 mg ml-1 belasse II（D46993; s sigmadrich; s sigmadrich；（HBSS））
。通过在DMEM中添加4毫升冰冷的淬火培养基（10％FBS（11320033; Gibco）和18.75 µg ml-1，DNase I（DN25; Sigma-Aldrich）在DMEM中添加4 ml冰冷的淬火培养基（10％FBS（11320033; Gibco）和18.75 µg ml-1）
，消化反应被淬灭。细胞悬浮液通过18克针几次通过100 µm滤网过滤 。将细胞以800克离心5分钟，重悬于1×RBC裂解缓冲液（420301; Biolegend）中 ，并在37°C下孵育3分钟
。用冰冷的PBS洗涤后
，将细胞铺在组织处理的培养容器上的完整培养基中，选择生长为浮子聚集体的细胞。 　　用1×NEAA（11140050; Gibco） ，10％FBS（11320033; Gibco）和100 U ml-1 u ml-1的青霉素 - 链霉素（151401122; Gibco）在DMEM-F12中维持DMEM-F12（10565018; Gibco）
，10％FBS（11320033; Gibco）和100 U ML-1 。在HBSS中，将NE细胞生长为浮子骨料 ，或允许粘附在涂有50 µg ML-1的生长因子降低的Matrigel（356231; Corning）或Cultrex BME（3432-010-01; Bio-Techne）的培养容器中
。还将NE SCLC细胞在钙成像实验的基质液滴中生长3D插入。将非NE细胞培养在DMEM（10-013-CV; Corning）中
，具有10％FBS，2 mM谷氨酸（35050038; Thermo Fisher Scientific）和100 U ML-1的青霉素 - 链霉菌素 。 　　NCI-H889, NCI-H82, COR-L47, COR-L279 (purchased from ATCC), NCI-H69_fl and NCI-H69_adh (a gift from J. Minna) cell lines were cultured in DMEM-F12 with GlutaMAX, 1× NEAA, 10% FBS and 100 U ml−1 of penicillin–streptomycin. 　　如先前所述42所述 ，KP1233和KP1234源自KP小鼠的原发性肿瘤（KRASLSLSL-G12D/+和TRP53FL/FL）
，并在DMEM（10-013-CV; Corning）中培养为10％FBS和100 U ML-ML-ML-ML-ML-ML-ML-ML-ML-1
。 　　MDM1402先前是源自雌性KPC小鼠的原发性肿瘤（KRASLSL-G12D/+，TRP53LSL-R172H/+ ，ROSA26LSL-TOM/+和PDX1-CRE+）;MDM1403先前是雄性KPC小鼠（KRASLSL-G12D/+，TRP53FL/+
，ROSA26LSL-TOM/+和PDX1-CRE+）42的原发性肿瘤，并在DMEM中培养 ，并在DMEM（10-013-CV; Corning）中培养
，具有10％fbs和100 U ml-ml-mlin-scrimlin- and。 　　小鼠βTC-B6围池细胞系先前是从RIP1-TAG2小鼠模型中得出的，并在DMEM（10-013-CV; Corning）中培养为10％FBS和100 U ML-1的青霉素 - 链霉菌素1,64 。 　　HEK293T细胞由弗朗西斯·克里克研究所（Francis Crick Institute）的细胞服务设施提供 ，并在DMEM（11995073; Gibco）中培养
，其中10％FBS和100 U ML -1的青霉素 - 链霉素1
。 　　所有细胞系经常在标准条件下（在37°C下加湿的5％CO2大气）进行定期培养，并经常对支原体污染进行测试 ，并通过短串联重复（STR）分析对其进行身份验证。对于所有有条件的培养基实验和代谢测定
，与不同类型的癌细胞进行比较，使用了相同的培养基 ，主要是无丙酮酸DMEM（10-017-CV; Corning）
，除非另有规定，否则使用了2％或10％的透析FBS 。 　　PDX型MGH1505-1A是从从患者MG1505分离的循环的肿瘤细胞中建立的 ，该患者MG1505是一个59岁的SCLC27的男性。如下260天，从该PDX模型得出了两种具有不同形态的细胞系（扩展数据图1）
。将MGH1505-1A异种移植的片段植入了NSG-GFP小鼠的右侧（JAX菌株021937）
，其中所有小鼠细胞表达GFP。当异种移植物达到1,500 mm3时，将NSG-GFP小鼠安乐死 ，并切除异种移植物并在冰冷的PBS中手动解离 。通过在室温下以15毫升圆锥形管的连续重力沉积分离活细胞簇
，并定期评估上清液，以鉴定含有最高比例的活细胞簇与细胞碎片的分数
。使用ACK裂解缓冲液（A1049201; Gibco）裂解红细胞。将富集的细胞簇生长在修改后的HITES培养基中（DMEM-F12 ，带有谷氨酸
，5％FBS，1×NEAA ，1×ITS -G补充剂（Gibco
，41400045），10 nm氢皮质酮（07925; Stemcell Technologies; stemcell Technologies; segcell Technologies; sevel; semcell Technologies; s27925; s275 and-e275 and-e2758888888888888888888888888888888888888888 。青霉素 - 链霉素） ，每周两到三次监测培养物
。粘附的GFP+小鼠成纤维细胞在分离后的3天内开始增殖
，并且在最初的8周内培养生长模式是动态的，初始悬浮簇过渡到与GFP+鼠类伴随GFP+ Murine细胞与成纤维细胞伴有成纤维细胞形式的密切相关肿瘤细胞的混合物（杂种细胞）。为了耗尽鼠类细胞 ，我们利用了功能性RB1的缺乏，因此缺乏CDK4/6的依赖性
，这些依赖性表征了大多数SCLC，包括MGH1505-1A 。我们用CDK4/6抑制剂palbociclib（10 µm）（508548; Thermo Fisher Scientific）治疗了MGH1505-1A培养
。 导致GFP+细胞的大量耗竭以及浮动肿瘤簇和粘附肿瘤细胞的混合培养。在没有palbociclib的情况下 ，将粘附和悬浮成分分开并独立培养 。然而
，在4周后在两种培养物中都观察到残留的GFP+细胞（扩展数据图1C，D） ，促使其他4周的palbociclib处理
。在此处理过程中
，悬浮簇通过轻柔的移液量解离，并使用Tryple消化两次将粘附的细胞解散 ，以将GFP+细胞暴露于该药物中。在PALBOCICLIB处理后
，悬浮液（MGH1505-1A_FL）和粘附（MGH1505-1A_ADH）培养物以低密度生长，并每周两次对GFP+细胞进行手动筛选 ，以确认小鼠细胞的完全消耗（图1E
，F） 。260天的总培养时间超过了50个人口双倍，以确立具有一致和稳定形态的细胞系。通过与患者种系基因组DNA进行比较证实了来自患者MGH1505的两种细胞系的起源
。 　　CHR2编码序列是从FCK-CHR2-GFP（Addgene Plasmid 15814 ，E。Boyden的礼物）中扩增的65，并在框架中以P2A-PUROR CASSETTE66的框架中的cag启动子克隆到PiggyBac Transfer质粒中
，以生成质粒PPB CAG2-P2-P2-P2A-P2A-P2A-P2A-PUROR 。使用lipofectamine 3000（Invitrogen）或Transit-LT1（Mirus Bio）与PPB CAG CAG CHR2-P2A-PUROR和质粒编码的质粒（PCMV Hahepbase and and cart and conty carty carty carty carty，sclc ，luad和PDAC小鼠细胞系反向转染
。选择嘌呤霉素后
，建立了稳定的表达CHR2细胞。 　　GCaMP6m coding sequence was PCR amplified from pGP-CMV-GCaMP6m (Addgene plasmid 40754, a gift from D. Kim and GENIE Project)29 and cloned into a lentiviral transfer plasmid under the constitutive EFS promoter in frame with a P2A-PuroR cassette to generate the plasmid pLenti EFS GCaMP6m-P2A-PuroR.产生慢病毒颗粒并用于传递小鼠SCLC NE细胞系，如下所述 。 　　从PUC57 LBNOX（Addgene Plasmid 75285 ，V
。Mootha的礼物）44中将FLAG标记的LBNOX编码序列放大了PCR
，并将其克隆到一个多功能性强力lientiviral诱导病毒载体中，以产生PTL LBNOX-FLAG质粒。将LBNOX-FLAG序列克隆在PTL慢病毒主链中的紧密TRE启动子下 ，该主链也包含一个在本构EF1A启动子下表达puror-p2a-rtta的盒式盒子 。如下所述
，慢病毒颗粒是由PTL LBNOX-FLAG产生的，用于传递AD984LN_FL和AF3062C细胞
。 　　The coding sequence of the inhibitory chemogenetic receptor PSAM4-GlyR (iPSAM4) was PCR amplified from pCAG PSAM4 GlyR IRES EGFP (Addgene plasmid 119739, a gift from S. Sternson)55 and cloned in frame with a cassette containing the T2A linker, firefly luciferase coding sequence linked through P2A to PuroR.Gibson组装用于生成PiggyBac转移质粒PPB CAG PSAM4-GLYR T2A LUC P2A PUROR。通过克隆萤火虫荧光素酶编码序列 ，通过P2A连接到同一PiggyBac主链中的纯puror来组装对照质粒（PPB CAG LUC P2A PUROR） 。用含IPSAM4的PIGGYBAC转移质粒（与PCMV HAHYPBASE； 4：1比例）用Transit-LT1（Mirus Bio）（Mirus Bio）将AD984LN_FL细胞反向转染
。选择尿霉素后建立工程细胞。 　　HEK293T细胞与慢病毒包装质粒PSPAX2（addgene质粒12260
，来自D. trono的礼物）和PMD2.g（Addgene Plasmid 12259，D 。trono的礼物）和使用磷酸盐钙的适当转移质粒共转染。转染后60小时收集上清液 ，使用0.45-μm滤波器过滤，并存储在-80°C下
。使用已知滴定（IU ML-1）的慢病毒标准和基于SYBR绿色I的PCR增强逆转录酶测定法（SG-PERT）方法67估算病毒滴定。通过将其重悬于补充有适当慢病毒（MOI多样化（MOI）= 10）的完整培养基中
，并将其重悬于SCLC NE细胞中，并将其重新悬浮 。将细胞 - 病毒悬浮液铺在六孔板的涂层孔中 ，并在30°C下以1,200g旋转2小时
。转导后24小时更改培养基。 　　将用IPSAM4表达或对照细胞移植的小鼠用无菌盐水或单独的媒介物（每天每周5天）
，用0.3 mg kg-kg-1的Upsem817 Tartrate（6866; Bio-Techne）注射腹膜内注射 。同一天，通过体内生物发光成像监测肿瘤负担 ，并每周随访
。腹膜内服用150 mg-kg-1的-luciferin（1-360223-200; Regis Technologies）后
，对动物进行成像。用2％的异氟烷​​对动物进行麻醉，并使用IVIS光谱系统（Perkinelmer）捕获生物发光信号 。使用Living Image软件（V.4.8； Perkinelmer）对生物发光信号进行定量：在每个小鼠的腹部区域绘制了7 cm2平方的感兴趣区域（ROI） ，并计算了平均辐射度（P s-1 cm-2 sr-1）
。从每个测量值中删除背景信号
，通过在同一视野内放置在空白区域上的相似ROI中的平均值来从每个测量中删除。通过计算每个实验组每只小鼠的几天细胞移植后的寿命来进行生存分析 。在分析中审查了由于与研究无关的原因而死亡的小鼠
。使用Kaplan – Meier格式显示数据，并使用对数级（Mantel-Cox）测试对结果的统计显着性进行了测试。 　　通过标准方法进行贴片钳记录68 。在记录前培养1-4天后 ，将细胞传播到35毫米组织培养物处理的塑料培养皿中后
，将细胞铺板。对于NE细胞系，将培养皿与5％的母质溶液预先涂层20-30分钟 ，以允许粘附
。使用10×或20倍的目标用相位对比显微镜（Olympus IX71）观察细胞。 　　在使用X系列数据录制界面（国家仪器（National Insterface）（国家仪器）（在4杆的bessel cutab cutab cutab cutab）下，使用X系列数据录取界面（国家仪器（National Instrument）
，使用X系列数据驱动界面（国家仪器（National Instrument）），使用X系列数据录取界面（国家仪器（National Instrument） ，在4杆bessl和4-khz下
，在10-20 kHz下以10-20 kHz进行了10-20 kHz，在10-20 kHz下 ，在10-20 kHz中生成了16位波形
，并在10-20 kHz中对电流钳和电压钳记录进行了16位波形 。在记录之前，将培养基交换为林格溶液 ，该溶液由140 mM NaCl
，4 mM KCl，1.4 mM CaCl2、1 mM MMGCL2和10 mM HEPES组成 ，与NaOH平衡至pH 7.4
。在大多数记录中
，如文本所述，进一步添加了5毫米葡萄糖 ，但在某些记录中被乳酸（10毫米）省略或取代。 　　使用1.5毫米直径的硼硅酸盐玻璃毛细管（哈佛装置）建立记录，在尖端上进行燃烧
，并充满细胞内灌注溶液，由105 mm葡萄糖酸钾 ，由30 mm kcl
，10 mm kcl，10 mm Hepes ，10 mm egta
，1 mm egta，1 mm egta和10 mm atsp and pp artp artp artp·egtp ，0.3 mm
，0.3 mm，磷酸磷酸盐Na2 ，与KOH平衡至pH 7.3
，或125毫米葡萄糖酸钾，10 mM HEPES ，4 mm ATP·Mg，0.3 mM GTP和10 mM磷酸蛋白酶Na2
，与KOH平衡至pH 7.3 。记录在室温（23–25°C）下进行
。 　　调整膜电位，以在密封形成之前对计算出的液体连接电位的预定液体 ，并浸入浴缸中。移液的电阻为5-10MΩ 。为了估算未扰动的静膜电位
，在通过移液器溶液对细胞内室的明显透析之前，在细胞跟踪贴片破裂后立即进行电流夹记录以建立整个细胞记录模式
。这通常是在电流夹模式下进行的 ，以允许在破裂过程中对零电势的时间分辨记录
，并测量0-3 s之内的初始值。如果在电压夹中进行破裂，则在大约4 s的电流夹中测量电势 。通过对小（2-4 pA）的电流钳反应的拟合来评估细胞输入电导和电容
。对于电压钳记录 ，使用多灯700B的内置电路来补偿移液管和全细胞电容和串联电阻（80％）。 　　为了测量兴奋性
，确定了运行中峰值电压和稳态去极化电压之间的过冲或最大正差 。如果单元格显示出反弹尖峰，则始终是最大的 ，也是用于测量的峰值。兴奋性定义为峰值电压和稳态去极化电压之间的最大正差
，以一系列逐渐更大的电流步长响应序列
。如果在运行中不超过一个扫描中没有清晰，一致的过冲 ，则兴奋性为零。 　　为了在不同能源供应的条件下进行预孵育，将培养基换成含有0-10 mm葡萄糖或5 mm乳酸的林格溶液
，持续时间从小于2小时到16小时以上（过夜），并在室温下在室温下在湿润的室内孵育培养皿 。 　　为了估计保持动作潜力产生所需的负静息电位的能量成本 ，使用了一个简单的模型
，该模型假设静止的膜电导仅由钠选择性和钾选择性分数组成，这是合理的 ，因为这些膜有助于静止电位的主要电化学梯度
。该模型求解了电源钠泵电流
，该电流等于通过稳态状态下膜的静息电导率的内向钠和向外钾通量的总和。 　　其中v是静息膜电位，并且是总输入泄漏电导的等效钠选择性和钾选择性分数： ，这是从对电流夹模式下对小超极化电流步骤的响应进行测量的 。NERNST平衡电位
，并假定分别从移液管和林格溶液的组成中计算得出的分别等于+53.8和-108.4 mV，因为在NE细胞中 ，通常只有几毫米的转移
，而在静止的潜力中，静止潜力的静止潜力与腐蚀剂和钾盐的含量均为不合时宜的液体相位
。 　　因为钠泵将三个Na+离子输出 ，并且每个ATP分子水解中的两个K+离子都在 　　由此可以证明，静止的钠电流由 　　并且电池休息时的ATP消耗率为 　　其中f是法拉第的常数（参考文献69）的等式（3）和（4）。因此
，通过测量和V并假设值，并且可以估计保持静息潜力的能量成本 。 　　为了估计每个动作潜力的成本 ，静止电位与动作电位的峰值之间的差异（假定为AF1165单元的典型值为60 mV）乘以膜电容（假定20 PF
，AF1165的典型值，AF1165单元的典型值） ，从每个磁性较高的磁性范围内的电源常数估计
，以使膜的电源不断增加，以使膜的浓度浓缩量 ，SOD均可依次
。这给出了每个动作电位2.5×106 ATP所需的ATP的估计
，这是一个保守的下限，因为它假定了动作电位的完全效率（钠和钾电压门控电流的非重叠率70）。 　　为了估计囊泡释放的成本 ，我们假设质膜电容的典型值增加了20 f
，这是在短暂的去极化脉冲中，使用电压夹至1-kHz正弦曲线命令电压的电流的相移来测量 。假设特定的膜电容为1μfcm-2 ，则转化为释放约400个囊泡（直径40 nm）
。我们没有有关这些细胞中囊泡包装的能量学的具体信息，但是使用神经元中每40 nm囊泡的23,400 ATP的粗糙估计值为囊泡释放的每个动作潜力为5×107 atps。 　　可以将这些成本与报道的上皮癌症小组中ATP产生的测量值进行比较
，该癌症的上限约为20 pmolμg -1每分钟的蛋白质 。假设干重分数为25％，并且每个细胞的体积为1 pL（相当于侧面为10μm的立方体）可产生4,000个细胞 ，每微克蛋白质。这相当于每秒5×107 ATP的ATP产量
。 　　对于蓝光刺激
，我们使用了BlueCell，这是一种带有内部构建硬件和软件的设备 ，如先前的研究75所述。该设备以一系列蓝色LED条（460 nm）以及温度传感器和冷却风扇的速度运行
，以防止在长时间蓝光暴露时过热细胞培养板 。LED阵列由Raspberry Pi MicroComputer控制，该raspberry Pi微型计算机接收了以前使用J.-P.提供的bluecell.ijm文件编程的光序列
。文森特的实验室。该文件在ImageJ2（v.2.9.0）中运行 ，并设计了不同的照明序列 。所有的照明序列的蓝光强度为10 mW cm -2
，其频率模式（1 、10或100 Hz）在时间点范围（1
、5或10分钟）中保持
。具体而言，对于1-Hz刺激序列 ，在每个刺激周期中都建立了5 s的额外步骤
，以防止细胞耗尽。 　　使用了以下药物：柠檬酸四毒素（TTX; AB120055; ABCAM），烤面包酮（R8875; Sigma-Aldrich） ，寡霉素（O4876; Sigma-Aldrich），FCCP（HY-100410; MEDCHEMEXPRESS）
，Antimcin a（Antimcin a）A（a86744444674）（5431; Tocris Bioscience），双氯芬酸钠盐（D6899; Sigma-Aldrich）和CCH（C4382; Sigma-Aldrich） 。用于不同代谢测定的代谢产物是丙酮酸钠（P2256-25G； Sigma-Aldrich）和乳酸钠（L7022-5G； Sigma-Aldrich）
。在每个实验中指定浓度。对于LBNOX诱导 ，将细胞用1 µg ML-1的强力霉素盐酸盐处理（D9891; Sigma-Aldrich） 。 　　将细胞铺在96孔测定板（3903;康宁）中（井中的NE SCLC细胞3,000–6,000个细胞
，用于预先用Matrigel/Hbss溶液涂覆的井中；在常规培养基中，无Matrigel/Hbss溶液的NE SCLC细胞每孔500个细胞 ，无孔SCLC/LUAD/PDAC细胞）
。第二天
，将细胞用10％透析的FBS（F0392; Sigma-Aldrich）切换为DMEM，其中含有感兴趣的药物。经过3天的培养或各自的药物处理后 ，使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定法（G7570; Promega）测量每个井的活细胞数量 。将结果标准化为对照和未处理样品。所有测定均以每个细胞系测试的四个技术重复进行
。对于用表达LBNOX的细胞进行的剂量反应曲线
，自播种日以来，它们用1 µg ML-1强力霉素培养。 　　为了收集条件的培养基 ，将非NE细胞以每板5×106的细胞为15厘米的板中
，而将NE细胞以每板107个细胞为107个细胞中的Matrigel涂层的10厘米板 。播种是在各自的常规培养基中进行的
。播种24小时后，将培养基（每15 cm板20 mL和10 cm板）更换为无丙酮酸DMEM（10-017-CV; Corning） ，用100 U ml-1的青霉素 - 链霉菌素和2％的市值透析血清（F0392; Sigma-Aldrich）。介质变化后24小时（播种后48小时），收集培养基并通过0.22-μm滤波器过滤 。将培养基存储在4°C下以供一周内使用
，或者等分存储在-80°C下
。条件培养基使用3.5K MWCO盒（66330; Thermo Fisher Scientific）进行平衡透析。将条件的培养基注入盒式盒子中，并以1：100在4°C下的体积比为1：100的新鲜培养基透析 。每轮透析重复两次 ，预期稀释比为1：10,000小于3.5k MW
。对于钙成像实验
，在协议中使用了氟生物DMEM（A1896701; Thermo Fisher Scientific），而不是DMEM（10-017-CV； Corning） ，然后收集。 　　实验前一天
，将细胞在常规培养基（DMEM; 10-013-CV; Corning; corning; corning; corning; corning; corning; corne; corne; corne; corne; corne; corne; corning; corning; corning; corning; corne; corne; corning; cornecillin-thepsycin 10％fbs和100 u ml-1的corne），每个细胞系有两个板 。在实验当天 ，细胞被更改为每井的1 ml新鲜培养基
，然后在37°C的孵化器中孵育
。2小时后，将每个细胞系的一块板带取出 ，用100 µL的放射性标记的2-脱氧葡萄糖（100 µl 11 µCI ML-1 [3H] -2DG）
，最终浓度为1 µCI ML-1）。将板轻轻摇动以进行混合物，并在室温下精确孵育15分钟 。然后吸出培养基 ，将板放在冰上，并用冰冷的PBS（每孔5毫升）洗涤四次。用500 µL胰蛋白酶/EDTA将细胞胰蛋白酶胰蛋白酶固定
，并使用1-ML移液管混合
。然后，将每个样品的每个胰蛋白酶混合物的400 µL细胞转移到闪烁瓶中 ，并加入闪烁缓冲液。将小瓶旋转直到溶液变明清晰
，并准备好进行放射性测量 。另一个板中的细胞数并联计数
。 　　在实验前一天，将NE细胞在2 ml常规培养基中以每孔的106个细胞接种。模拟板是中等控制的 ，并且与其他井相同的方法 。第二天
，用含有不同浓度的乳酸浓度的新培养基（DMEM; 10-017-CV; Corning; Corning; Corning;用10％透析血清或2％透析血清的透析血清或配对的NE/非NE-NE/非NE/非NE-NE细胞实验）替换为5 mL PBS洗涤
。第二天，在轻轻摇动板后收集培养基 ，以1,000 rpm离心5分钟
，然后收集1毫升上清液。在YSI生物分析仪（黄泉仪器）中测量葡萄糖和乳酸浓度 。这些代谢产物中的分泌/摄取程度取决于对照和含细胞的培养基的浓度之间的差异
。 　　如先前所述，进行了磺胺类药物B（SRB）测定法76。对于蓝光刺激实验 ，将6×104至4×105 MSCLC-NE
，MSCLC-NON-NE，LUAD和PDAC细胞之间的播种在六孔板中 ，每孔具有1 ml培养基 。在接下来的3天中，每天用1或10 Hz蓝光（1、5或10分钟）刺激细胞
，或用1 µM TTX或条件培养基处理
。播种后的第二天，其中一个板被用作实验的T0时间点 ，并通过向每个孔中添加500 µL 10％三氯乙酸来固定。3天后
，所有板也用500 µl的10％三氯乙酸固定，并在寒冷室中至少保持1小时 。然后 ，用蒸馏水（DH2O）将所有板（包括T0板）洗涤3次
，并用0.04％SRB（以1％乙酸制备）在室温下染色至少30分钟。接下来，除去染料 ，并用1％乙酸洗涤井三次
。最后一次洗涤后
，将剩余的液体完全抽出。将板与盖子在37°C的孵化器中放置10-15分钟，直到干燥 。最后 ，将1 ml的10 mM Tris（pH 10.5）添加到每个孔中以溶解染料
。板在室温下摇动5-10分钟。然后
，将100 µL的每个孔转移到96孔板上，并在Tecan Infinite M1000微板读取器中读取510 nm的吸光度 。每天加倍时间是通过以下公式计算的 ，其中XN和X0分别是实验的末尾和开始（T0）的吸光度值
。对于每个实验，包括三个技术重复。 　　通过在六孔板中
，通过在1,000–10,000个MSCLC-NE，MSCLC-NON-NE ，LUAD和PDAC细胞的细胞以及30,000个细胞的细胞中
，评估克隆性 。10–14天后，将菌落用0.1％晶体紫 ，1％甲醛
，1％甲醇的溶液染色15分钟
。在大量洗涤和干燥后，将染色试剂在1％乙酸中分辨出来 ，并使用Tecan Infinite M1000微板读取器在570 nm处测量吸光度
，作为细胞数的间接度量。 　　对于蓝光刺激的实验，将细胞接种以进行集落形成测定 ，第二天
，它们用蓝光刺激10分钟（1 、10或100 Hz），包括每个实验中未刺激的条件 。对于使用TTX的菌落形成测定 ，设计了两个实验设置
。在其中一个中，将细胞接种在六孔板中
，如上所述。第二天，将培养基替换为1 µm TTX的新鲜培养基或培养基 。板在菌落染色之前的规则条件下生长10天。在另一种方法中 ，在播种菌落测定之前
，将细胞用1 µM TTX预处理24小时
。第二天，在没有TTX的常规培养基中洗涤未处理和处理过的细胞 ，以菌落形成并生长10天。 　　如先前的研究77中所述
，使用软焦点菌落形成测定法评估HSCLC细胞系的克隆性 。简而言之，将1.2％的低熔点琼脂糖（16520-100; Invitrogen）溶液与相等体积的2倍培养基混合 ，其中包含26.74 g L-1 DMEM粉末（50-13-PB; Corning）
，2.4 G L-L-1 g l-l-l-1比苯甲酸钠，比苯甲酸钠 ，1 mm硫酸钠和2 mm硫酸盐酸盐
，200 fba，20％FBS（113.200 fbs）;（11140050; GIBCO）
。然后 ，将1.5 mL的琼脂糖 - 中等混合物分层在六孔板的每个孔的底部，然后在室温下固定30分钟。对于顶层
，将每种HSCLC细胞系重悬于2×培养基中，以达到每个孔的最终密度15,000个细胞 。接下来 ，将这些细胞悬浮液与0.6％琼脂糖溶液以1：1的比例混合
，并添加到每个孔的顶部（1.5 mL）
。在室温下孵育30分钟后，加入每孔的每孔1 mL（有或没有1 µM TTX） ，并在规则生长条件下孵育板
，持续3-4周。每2天，将新鲜培养基（带有或没有1 µM TTX）添加到井中 ，以防止蒸发 。在实验结束时
，通过在每个孔中添加200μl氮气四唑溶液（1 mg ML-1; N6876; Sigma-Aldrich）来染色，并在37°C下孵育过夜
。 　　使用细胞裂解RIPA缓冲液从细胞中提取总蛋白 ，并补充了磷酸酶和蛋白酶抑制剂鸡尾酒（78440; Thermo Fisher Scientific）；通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（4-15％）解决30 µg蛋白质裂解液
，并转移至聚偏二氟化物（PVDF）膜中，该膜在TBS-T中用5％BSA阻断了TBS-T或PBS-T中的5％非脂肪牛奶 ，并在PBS-T中与指标的Antign Antign Antight indigned Antight indiged Antight indiged Antign。所使用的主要抗体如下：抗HES（11988； 1：1,000；细胞信号技术），抗MCT4（SC-376140; 1：1：1：100; Santa Cruz Biotechnology）
，Anti-MCT1（AB1286-I; 1：1,000; 1：1,000; Sigma-Aldrich），Signma-Aldrich ，Sigral-Sosing simble-Sox1（41：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：4194；抗C-FOS（AB190289; 1：500; ABCAM）
，抗GPX4（AB125066; 1：1,000; ABCAM），抗4-HNE（AB46545; 1：1,000; ABCAM） ，抗LCB3（抗LCB31：3,000; ABCAM）
，抗HSP90（610418; 1：3,000; BD Biosciences），抗磷酸 - SER133-CREB（9198; 1：500; Cell Signaling Technology; Cell Signaling Technology）和抗FLAG TAG（2368; 1：1,000; 1：1,000;细胞信号技术） 。如果需要 ，然后将膜与HRP偶联的抗兔（AB205718; 1：3,000; ABCAM）
，抗小鼠（G-21040; 1：3,000; Invitrogen）或抗chicken（A16054; A16054; 1：3,000; 1：3,000; Invitrogen; Invitrogen; Invitrogen; Invitrogen; Invitrogen; Invitrogen; Invitrogen; Invitrogen; Invitrogen; Invitrogen; Invitrogen; Invitrogen; Invitrogen; Invitrogen; Invitrogen; Invitrogen）辅助孵育
。使用ECL Prime Western印迹检测试剂（RPN2232； Amersham）和Chemidoc XRS+系统（Bio-Rad）可视化靶蛋白带。有关凝胶源数据，请参见补充图1 。 　　一个固定的肺叶与蔗糖冷冻保护（PBS中的30％蔗糖 ，一夜之间）
，嵌入最佳切割温度化合物中，并缓慢冷冻在干冰中。人类SCLC组织阵列LC703A是从美国BioMax购买的
。使用Leica CM3050 s低温恒温器将样品冷冻切片切成100μm-厚的部分。在SuperFrost Plus粘附显微镜载玻片（J1800AMNZ; Epredia）上收集切片 ，在室温下在PBS中洗涤30分钟，并在0.24％NH4CL PBS中淬火10分钟 。Slides were permeabilized and saturated in a blocking solution (15% donkey serum, 0.20% glycine, 2% BSA, 0.25% gelatine and 0.5% Triton X-100 in PBS) for 2 h at room temperature and then incubated for 24 h in the blocking solution at 4 °C with the following primary antibodies: anti-MCT4 (sc-376140; 1:100; Santa Cruz生物技术）
，抗SOX1（AF3369; 1：200; Bio-Techne），抗Vacht（139105; 1：100;突触系统） ，抗TDTOMATO（AB8181-200; 1：200; SICGEN）和抗β3-纤维蛋白（AB52623; AB52623; 1：1：250; ABCAM; ABCAM）
。The day after, samples were washed three times in PBS for 10 min each and incubated in PBS for 1 h at room temperature with the following fluorescent conjugated secondary antibodies: donkey anti-mouse Alexa Fluor (AF) 488 (A21202; 1:250; Invitrogen), donkey anti-rabbit AF 488 (A-21206; 1:250; Invitrogen), donkey anti-goatAF 568（A-111057; 1：250; Invitrogen）
，驴抗山羊AF 647（A32849; 1：250; Invitrogen）和山羊抗Guinea Pig AF 647（A21450; 1：250; Invitrogen; Invitrogen）。然后将样品在PBS中洗涤3次10分钟，并与DAPI（D1306; 1 µg ML -1; Thermo Fisher Scientific）在PBS中孵育5分钟 。使用Dako荧光安装培养基（S3023； Agilent Technologies）和Epredia 22×50毫米盖玻片将载玻片安装
。用Leica SP8 Falcon倒置的共聚焦显微镜与白光激光器（470-670 nm）捕获图像 ，配备了HC PL APO 20×NA 0.75 CB2
， HC PL APO 40×NA 1.30 CS2和HC PL APO 63×NA 1.40 CS2油浸入目标和HYD探测器。根据每个荧光团选择激光激发线，功率强度和发射范围 ，以最大程度地减少出血 。使用LAS X软件收集数据
。使用ImageJ软件分析数据
，并使用JACOP插件进行共定位分析并计算Pearson的系数。为了计算与肿瘤接近的累积轴突长度，对肿瘤径向设计300 µm的ROI ，并使用了Neyronj插件 。轴突密度得分计算为肿瘤累积轴突长度和直径之间的比率
。使用Qupath 0.5.0计算了TMA处的MCT4和SOX1阳性细胞的数量
，并使用Imaris软件生成了3D可视化，渲染和视频。 　　为了进行免疫组织化学分析 ，将组织样品固定在10％NBF中，脱水
，嵌入石蜡中，并使用LEICA RM2235微落压机以4μM切割 。将载玻片在二甲苯中脱离两次 ，持续5分钟
，并用100％工业甲基化精神（IMS）重新水合5分钟，然后用70％的工业甲基化精神持续5分钟 ，持续5分钟
，持续5分钟。将样品转移到基于柠檬酸盐的抗原检索溶液（H-3300；载体实验室）中，在900 W下进行8分钟 ，冷却至50°C
，再次煮沸3分钟，最后冷却至室温
。将载玻片在1.6％H2O2中在PBS中孵育10分钟 ，在DH2O中洗涤5分钟
，在室温下在1％BSA中孵育1 h，并在4°C下与以下主要抗体在4°C下孵育：抗磷酸 - 磷酸ser133-creb（9198; 1：400; Cell Signal;信号技术） ，Anti-i-KI-KI-KI-KI67（ABSI-KI-KI67）（AB-KI-KI67）（AB-KI67）（ABSI-KI67）7（AB-KI67）; abi-KI67; 0;ABCAM）和抗切割的caspase 3（9579; 1：250;细胞信号技术）。将样品在PBS-T中洗涤3次，持续5分钟 。对于二抗（抗兔聚合物）和3,3'-二氨基苯胺
，使用了键合聚合物精炼检测试剂盒（DS9800; Leica）
。简而言之，将样品与聚合物检测系统试剂在室温下孵育30分钟 ，并在PBS-T中洗涤3次
，每次5分钟。施用3,3'-二氨基苯胺溶液，在DH2O中洗涤 ，以终止反应并在樱花组织中的prisma中对抗 。用奥林巴斯VS200滑梯扫描仪捕获图像
。Qupath 0.5.0中的“阳性细胞检测”功能用于量化KI-67并在肝切片中裂解caspase 3阳性细胞。 　　将NE细胞以每个孔的106个细胞接种
，并将非NE细胞以每孔的250,000细胞为250,000个细胞在2 mL常规DMEM中的六孔板中播种 。每个细胞系的六口井播种两个时间点，每个时间点进行三份技术一式三份
。对照是在没有细胞的模拟板上DMEM。第二天 ，将板用每个孔（包括模拟板）用5 mL PBS洗涤
，然后用P1000移液器恰好用2 ml的2 ml新鲜培养基（10-017-CV（10-017-CV），用10％透析的FBS；康宁）代替 。同时 ，在T0处计算每个细胞系的三口井
。24小时后
，收集10 µL培养基以进行气相色谱 - 质谱法，并获得了T24的细胞计数。通过将指数的生长方程拟合到初始和最终细胞计数来建立NE细胞和非NE细胞的生长速率 ，并进行该方程的整合以确定该实验过程中每单位时间平均单位时间的平均细胞（曲线下的区域） 。收集的培养基存储在-80°C或直接进行极性代谢物的提取。在1.5 mL Eppendorf管中的样品中，将含有Norvaline（Sigma）内标准的高性能液相色谱（HPLC） - 含有10 µg ml-1的浓度的甲醇添加到样品中
，以达到80％甲醇的最终浓度，然后在4°C中以10分钟为单位均衡10分钟
。收集上清液并将其转移到新的Eppendorf管下 ，并在惰性氮气下干燥。通过与16 µL MOX试剂（2％2％甲氧胺在吡啶中的甲氧胺
，热科学）在90分钟内初次孵育，将干燥的样品衍生化以形成甲氧电机-TBDMS衍生物 ，持续90分钟TERT丁基甲基氯硅烷（T-BDMC）（Regis Technologies） 并在60°C下孵育30分钟 。然后将样品在4°C下以最大速度离心10分钟
。然后
，将16 µL的上清液转移到气相色谱 - 质谱小瓶中。使用配备有30 m db-35ms毛细管柱的安捷伦6890 GC进行气相色谱 - 质谱分析，该GC连接到70 eV时的电子撞击电离下运行的敏捷5975B MS 。使用氦气作为载气以1 ml min -1的流速为载体 ，以270°C的无分级模式注入一微升样品
。气相色谱烤箱温度在100°C保持3分钟
，并在3.5°C min -1时增加到300°C。质谱仪源和四极杆保持在230°C，检测器以扫描模式运行 ，记录了100-605 m/z的离子丰度 。乳酸和丙酮酸峰的注释是通过与上述相同过程衍生化的乳酸和丙酮酸标准品的参考来确定的
。代谢物的分泌率是通过将每个代谢物的提取离子总数除以每个单位时间平均细胞的总数来计算的。 　　使用Agilent Seahorse Bioscience细胞外通量分析仪测量OCR 。将细胞接种在敏捷的海马XF96细胞培养微板酸盐（TC处理； 102416-100； Agilent Technologies）中进行实验
，并在HBSS中用Cultrex BME（3432-010-010-01; Bio-Techne）涂有井
。将SCLC NE细胞以每孔105细胞的形式播种，而在100 µL适当的常规培养基中 ，将非NE细胞以每孔104细胞接种。第二天，补充了10 mm-葡萄糖
，1 mM丙酮酸和2 mM-谷氨酰胺的培养基XF DMEM培养基（103575-100; Agilent Technologies）所取代的培养基 。将板在37°C下孵育1小时，无二氧化碳。在注射寡霉素（1.5 µM ，最终浓度）
，FCCP（1.5 µM，最终浓度）和烤烤甲霉素A（0.5 µM ，最终浓度）后
，执行了XF细胞MITO应力测试方案
。运行测定后，用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒（23225; Thermo Fisher Scientific）测量了每个孔的蛋白质含量。蛋白质的总毫克用于标准化 。使用在线软件Seahorse Analytics（V.1.0.0-699）进行数据分析 ，以计算基础呼吸率
，ATP耦合的呼吸和耦合效率
。 　　Cal-520, AM (ab171868; Abcam)-loaded SCLC NE cells, GCaMP6m-expressing mSCLC-NE cells alone or GCaMP6m-expressing mSCLC-NE and non-NE cells in a ratio of 4:1 were seeded in 35-mm glass-bottom dishes (81218-200; ibidi) coated with Matrigel (356231; Merck)并在氟生物DMEM（A1896701; Thermo Fisher Scientific）中培养过夜，并补充了谷氨酸（35050038； Thermo Fisher Scientific）和青霉素 - 链霉菌素（15140122; Thermo Fisher Scientific） ，并具有2％透射透析的FBS（2640004000400040004400044000440004400044000440004400044000440004000400040004000400040004000400040004000400040004000400040004000400040004000性的科学）。第二天
，它们使用Olympus IX73倒倒荧光显微镜成像，该显微镜配备了带有TTL触发器控制的PE-300超标准荧光照明系统和Prime BSI Express SCMOS摄像头4.2 MP ，具有95％的量子效率 。使用绿色通道（470±20 nm的激发）和GFP过滤器集，使用40×Plan-Neofluar物镜（0.75NA）获取用LED光源刺激的细胞图像
，并由Micro-Manager软件（v.2.0.0）控制
。记录以每秒0.5帧（Hz）的速度进行5分钟。曝光时间为200 ms 。对于包括MCT抑制剂处理在内的实验，将SR-13800（5 µM）和双氯芬酸（0.5 mm）添加到细胞培养基中 ，并在成像之前孵育5分钟
。 　　使用剑桥高级成像中心的定制直立光板荧光显微镜进行3D培养的NE SCLC细胞的钙成像。 　　使用先前研究的方案从小鼠那里获得精确切割的肺切片 。HBSS中2％低熔点琼脂糖（16520-100； Invitrogen）的溶液用于肺膨胀
。为了成像表达Salsa6F报告剂的肿瘤细胞
，分离出携带肿瘤的肺裂片，并使用自动振动型（Leica VT1200S）在冰冷的HBSS/HEPES缓冲液中以300 µm的横向切割。 　　将切片置于无血清DMEM（21063029; Gibco）的12孔板中 ，并补充了1％青霉素 - 链霉素（15140122; Thermo Fisher Scientific）
，并在37°C的5％CO2上孵育30分钟，以进行30分钟以进行成像 。成像之前 ，将用于NEB成像的切片与俄勒冈绿色488 BAPTA-1-AM（O6807; Invitrogen）一起孵育30分钟。 　　将切片安装在两个低熔点琼脂糖凝胶的两层薄层之间
，在室温下在带有1.5盖玻璃（P24-1.5H-N; Cellvis）的24孔玻璃底部成像板中固化
。它们是使用环境室（37°C，5％CO2）的Olympus csu-W1 Sora旋转磁盘共聚焦显微镜成像的。30倍硅浸入物镜（1.05 Na）和488和561 nm激光激发波长用于图像采集 。对于每个视场 ，以每秒0.5帧的速度进行记录
。 　　对于包括使用MCT4抑制剂双氯芬酸（0.5 mm）治疗的实验
，在使用药物治疗前和5分钟与药物孵育后，从相同的视野中记录了时间失误。 　　对于所有钙成像实验 ，在ImageJ（v.1.54F）中分析了单个视野 。在每个视野记录的时间失去期间，使用了痕迹插件和细胞探测器预处理的模型Cyto和Cyto2的cyto和Cyto2
。随后的钙峰分析中
，只有在时间流失的所有时间点进行了分割和跟踪的细胞。获得每个分段单元的平均强度荧光值，并从每个时间点记录的单个值中减去在每个视野中测量的背景 。使用自定义MATLAB SCRIPT79生成每个分段单元的单个荧光强度迹线 ，并使用FindPeaks函数生成峰值指标
。将每个时间点的荧光强度标准化为特定分段细胞的所有荧光强度值的中值。临界值为0.1进行峰值突出 。只有至少一个具有最小峰值突出性为0.1的峰的细胞被视为活性细胞
。 　　使用mirneasy试剂盒（Qiagen）分离来自MSCLC-NE/非NE细胞系的总RNA。按照制造商的说明
，准备了RNA库与Illumina Truseq套件进行测序 。Illumina HISEQ 2000 50-NT单端读数映射到UCSC MM9鼠标基因组构建（http://genome.ucsc.edu/），使用RSEM80（v.1.2.12）和Bowtie（v.1.0.1）具有默认选项。原始估计的表达计数被标准化为1,000的计数（参考文献81）
。鉴于数据集的复杂性在不同的生物背景的混合物方面 ，使用高分辨率签名方法来表征全局基因表达谱。独立的组件分析是一种无监督的盲源分离技术
，在此基于离散计数的表达数据集上使用，以阐明统计上独立且在生物学上相关的签名 ，如先前详细介绍1 。所有RNA测序分析均以R统计编程语言（http://www.r-project.org/）进行
。使用默认设置82的预先排名模式进行GSEA。使用R中的Heatplus包装生成热图 。 　　为了进一步研究与实验中观察到的特征代谢需求有关的SCLC漏洞的存在
，我们使用了先前发表的CRISPR筛选，该筛查使用SCLC ，LUAD和PDAC细胞进行了42,83
。选择识别SCLC特定漏洞的标准是SCLC中的中位数log2折叠变化（L2FC）<-2和SCLC中的中位L2FC减去LUAD/PDAC <-1.5的中值L2FC。图书馆内4,915个基因的八个基因符合这些标准 。将这八个基因上传到富集中以执行GSEA
，选择“ GO生物过程2023 ”数据集作为参考
。84,85,86。 　　为了将我们的观察结果扩展到使用SCLC PDXS生成的其他数据集，我们分析了从51 PDXS27的队列中的RNA测序数据集 。具体而言 ，我们使用其归一化的RNA测序数据进行了Pearson相关分析，每千座片段中的片段每百万映射的读数和分配给这些PDX的NE分数
。此外
，我们根据其NE分数将这些PDX分为两组：NE得分大于0.8且NEN分数小于0.2。在这两组中分析了SOX1和SLC16A3（编码MCT4）mRNA水平 。使用Shapiro -Wilk检验评估数据的正态性，并相应地选择了数据转换和统计检验 ，如图图例所述。 　　此外
，我们分析了112例SCLC患者（配对肿瘤和NAT样品）的RNA测序和蛋白质组学数据集，最近发布了56
。有关数据获取 ，归一化和临床信息的更多详细信息可以在原始论文中找到。对于肿瘤和配对NAT之间的差异表达分析
，应用了Wilcoxon匹配的签名级测试 。为了进行相关分析，使用了Spearman测试
。对于生存分析 ，我们根据每个感兴趣的基因的标准化和Log2转化的表达是高于还是低于中位数
，将患者分为两组（“高
”或“低”）。我们为“高 ”和“低
”患者绘制了Kaplan-Meier曲线，并使用单变量对数秩检验进行了比较 。 　　除非另有说明 ，否则所有统计分析均在GraphPad Prism中使用推荐的测试和该软件的事后测试进行
。在分析中没有排除数据。每个实验的重复数量在相应的图例和方法中报告 。使用至少两个生物学重复进行蛋白质印迹
。没有使用统计方法来计算样本量。根据旨在捕获与该领域类似研究一致的生物学作用的初步实验
，选择样本量 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得
。