可以使用内含子中的RNA测序（RNA-Seq）覆盖来测量拉长POL II的易位速度 。这是因为Pol II速度和共转录剪接反映在读取覆盖范围的特征性锯齿模式中，可观察到总RNA-Seq或新生的RNA-Seq测量值15,16 。读取覆盖范围通常沿内含子降低5'至3' ，而这种降低的幅度取决于Pol II速度：伸长速度越快 ，坡度越浅17,18,19。POL II的高速导致在裂解细胞时内含子中断的新生转录本较少 。因此，通过量化沿内含子的读取覆盖率的梯度 ，可以确定在单个内含子处Pol II的伸长速度（图1A ，B） 。请注意，该度量仅与转录本的表达水平微弱相关（补充表2）。为了监视衰老过程中转录的动力学如何变化 ，我们量化了五种动物物种RNA-Seq产生的内含子读数的分布 - 虫虫秀丽隐杆线虫 ，果蝇果蝇墨拉哥果蝇，小鼠mus mus musculus，大鼠rattus rattus rattus rattus rattus norvegicus21 and homo homo homo sapiens and diversement-and possection and possection and cpection and cpection and cpection and cpections and and Adection and Adection;哺乳动物组织（大脑 ，肝脏 ，肾脏和全血），苍蝇大脑和整个蠕虫 。人类样本起源于全血（健康供体 ，21-70岁）和两种主要的人类细胞系（胎儿肺成纤维细胞（IMR90）和人脐静脉内皮细胞（HUVECS）） 。过滤后 ，我们获得了518至6,969个内含子，这些内含子通过了可靠的Pol II速度量化的质量标准（请参阅方法）。这些不同数量的可用内含子主要是由于内含子大小和数字的种间变化而引起的 ， 并在某种程度上是从测序深度变化的。为了评估POL II速度在生物学重复过程中的鲁棒性变化 ，我们根据其“速度特征 ”聚类，即 ，在所有内含子上检测到的伸长速度 ，这些内含子可以在每组实验中通常量化 。我们观察到来自跨物种同一年龄的样品的共同群集在很大程度上一致，而年轻的和老年样本大多相互分离（扩展数据图1） 。这表明与年龄相关的速度变化在生物学重复方面是一致的 ，并且可以在独立的测量中可靠地量化。我们观察到所有五种物种的平均波动岩II伸长速度随着年龄的增长而增加 ，并且所有检查的组织类型都会增加（图1C和扩展数据图2A） 。Pol II速度的变化与内含子的长度或其在基因中的位置无关（补充表2） 。在选择所有重复速度一致变化的内含子（即，随着年龄的增长）的速度变化，观察到的Pol II伸长速度的增加甚至更为明显；扩展数据图3）。该结果是非平凡的 ，因为我们的分析还揭示了内含子 ，并且Pol II速度持续降低 。为了通过正交分析确认我们的发现，我们使用了新生RNA的4-硫代（4SU）标记来监测IMR90细胞中的转录动力学 。在抑制5,6-二氯1-β-核呋喃糖基苯甲酰唑（DRB）的转录后 ，我们在转录释放后四个时间点量化了4SU标记的转录本类似脉冲的实验（即0、15 、30和45分钟）。这使我们能够量化Pol II的进展到基因体中（有关详细信息 ，请参见方法），并使用增殖（Young）和衰老（旧）IMR90细胞确认了我们的结果 。基于4SU的测定的POL II速度的测量结果与基于斜率的测定法的测量显着相关 （图1D） ，两种方法中的Pol II速度平均增加（图1E和扩展数据图4） 。请注意 ，尽管许多单独的基因在两个测定中都显示出延伸速度的降低速度降低，但大多数都表现出速度提高。
要评估已知的延伸寿命延伸干预措施（抑制胰岛素-IGF信号传导和饮食限制）是否受影响的POL II速度 ，我们使用DILP2-3,5突变体在第14天和50天和50天和50天的dilp2-3,5突变体中使用DAF-2-MUTANT蠕虫来测序RNA ，并在30和50和50和50 and irs and irs and irs and ir-irs and-ir-irs and-ir-irs theull od wildpece and-ir-irs theirs and-ir-irs theirs vellp2-3,5突变体 。我们还对饮食限制性和随意喂养小鼠的肾脏和肝脏进行了对RNA的测序 。在所有比较中，除了IRS1-NULL小鼠和26个月大的饮食限制小鼠的肝脏外 ，延长寿命的干预措施导致Pol II速度显着降低。在广泛的动物物种和组织中 ，pol II的伸长速度随着年龄的增长而增加，在大多数情况下，这种增加在延长寿命的情况下会恢复（图1）。
尽管Pol II速度随着重复的年龄而持续变化（图1扩展数据） ，但我们没有观察到在模型中会影响要影响的特定基因 。为了确定与年龄相关的POL II速度变化对具有特定功能的基因的影响 ，我们对200个基因进行了基因集富集分析，这些基因在蠕虫 ，蠕虫 ，苍蝇大脑，小鼠肾脏和肝脏以及大鼠肝的衰老期间的Pol II速度最高 。只有非常通用的功能类别（例如代谢活性）在三个或更多种类的物种中始终富集（扩展数据图5）。因此 ，在物种和组织之间似乎没有任何特定的细胞过程受到一致的影响 。接下来 ，我们检查了与年龄相关的基因表达调节剂的基因表达变化 。我们观察到，在衰老过程中 ，某些调节剂（例如 ，PAF1和THOC1）始终被下调（扩展数据图6），也使用基因集富集分析（扩展数据图7）证实了这一点。这些表达变化可能代表了对转录伸长速度有害增加的补偿性细胞反应 。
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希望本篇文章《与年龄相关的转录伸长变化会影响寿命》能对你有所帮助！
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