如前所述54，在大肠杆菌BL21（DE3）-Gold细胞（Agilent Technologies）中进行了Tau（297–391）的表达 。54 。简而言之 ，将一盘细胞重悬于1 L 2xty（类酸酵母）中 ，并补充了100 mg L -1氨苄青霉素，并在600 nm时生长至0.8的光密度。对于均匀的15N和13C标记的TAU，在富含[15n]氯化铵的1 g L-1的同位素含量的M9最小培养基中生长细菌和[13C]葡萄糖（Sigma）的2 g L-1 ，补充了1.7 G L-1 g L-1 g l-1 yeast Yeast Nitrogen碱基（SIGMA）。Cells were induced by the addition of 1 mM IPTG for 4 h at 37 °C, collected by centrifugation (4,000g for 20 min at 4 °C), resuspended in washing buffer (50 mM MES at pH 6.0; 10 mM EDTA; 10 mM dithiothreitol (DTT), supplemented with 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride and cOmplete EDTA-free protease鸡尾酒抑制剂 ，以每克颗粒为10 ml），并在95°C加热5分钟 。使用超声处理（使用SONICS VCX-750 Vibracell Ultra Sonic处理器在40％振幅下进行7分钟 ，5 s ON/10 s关闭）进行细胞裂解 。将裂解的细胞在4°C下以20,000克离心35分钟 ，通过0.45μm截止过滤器过滤，并加载到HITRAP CAPTEROS 5-ML柱（GE Healthcare）上进行阳离子交换。用10列的洗涤缓冲液洗涤柱 ，并使用含有0-1 M NaCl的洗涤缓冲液梯度洗脱 。收集3.5 mL的馏分并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Page; Tris-Gycine 4-20％凝胶）分析 。合并含蛋白质的馏分并使用0.28 g ML-1硫酸铵沉淀 ，并在4°C下在摇杆上持续30分钟。然后将沉淀的蛋白在4°C下以20,000g的速度离心35分钟，并在pH 7.2的2 mm磷酸盐缓冲液中以10 mM DTT的速度重悬于10 ml的磷酸盐缓冲液中 ，并加载到16/600 75-PG的大小 - 分类柱上 。通过SDS-PAGE分析了尺寸排斥分数 ， 使用分子量浓度浓度器，将含蛋白质的馏分汇总并浓缩至20 mg ml-1 ，其截止过滤器为3 kDa 。将纯化的蛋白质样品在50-100μl等分试样中闪烁 ，以供将来使用。使用Nanodrop2000（Thermo Fisher Scientific）确定蛋白质浓度 。
在10 mM磷酸钠中以6 mg ml-1浓度的tau，将pH 7.2，10 mM DTT加载到12 mm的两个扇区细胞中 ，放置在AN50TI转子中 ，并以50,000 r.p.m离心 。在4°C下使用Optima XL-I分析性超速离心（Beckman）。使用C（s）分布模型在Sedfit-16.1C55中分析数据，以确定具有符合沉积物曲线的沉积系数的物种的浓度（C） 。使用SEDNTERP56计算缓冲液的部分比体积（） ，密度和粘度 。使用程序Gussi 1.4.2（参考文献57）和Prism 9.5.1（GraphPad软件）绘制数据。
使用14.1-TESLA（T） ，18.8-T和22.3-T Bruker Avance III光谱仪在278 K处获取溶液状态NMR数据，该光谱仪分别在600 、800和950 MHz的质子频率下运行 ，配备了5毫米TCI TCI三重共振螺旋桨。所有NMR样品均以pH 7.4的50 mM磷酸盐缓冲液制备 ，用150 mm NaCl，10 mM DTT和5％D2O作为锁定溶剂 。
在600 MHz下 ，在300μm下完成了同位素富集（15n和13c）人Tau（15n和13c）人Tau（15n和13c）人Tau（15n和13c）人Tau（15N和13C）的人Tau（15N和13C）的分配 。使用18-39％的非均匀抽样来帮助更快的数据获取 ，以对自己的碳连接率配对，以配对提供标准的三维（3D）数据集。HNCO和HN（CA）CO以及HNCA和HN（CO）CA实验对分别在1H ，15N和13C尺寸中分别用2,048 、64和128的复合点收集 。分别在1H ，15N和13C尺寸中分别以2,048、64和96的复合点收集CBCA（CO）NH和HNCACB对 。使用（H）N（COCA）NNH实验建立了另外15N连接率，分别在1H，直接15N和间接15N维度中具有2,048、80和128个复合点。还收集了C'-Detect实验C_HCACON_IA3D和C_HCANCO_IA3D ，以分别在直接13C ，直接15N和间接13C尺寸中收集的1,024 、64和128点有助于骨干分配 。
使用Topspin版本3.2或4（BRUKER）或使用NMRPipe58处理所有原始NMR数据，并具有压缩感测 ，用于重建非均匀采样数据（通过QMDD）59 ，并使用NMRFAM-Sparkarky和Mars60进行了分析 。
进行二次化学移位分析以探测次要结构元素。计算了Tau（297–391）的随机线圈Cα，Cβ和C'值 ，分别从实验得出的值中减去 ，分别从实验得出的值中减去ΔCα，ΔCβ和ΔC' 。（ΔCα+ΔC'）/2 -ΔCβ的负值表示伸长的主链构象中的残基；阳性值表示螺旋构象 。
分子运动在600 、800和950 MHz的质子频率（分别为60.8、80.8和96.3 MHz）的质子频率下进行探测。Longitudinal relaxation was probed with a standard Bruker 15N T1 pseudo-3D experiment, collected with 10-, 20-, 40-, 80-, 120-, 160-, 320-, 640-, 1,280- and 2,000-ms delays and a standard Bruker 15N T2 pseudo-3D experiment with 16.9-, 33.8-, 50.7-, 67.6-,84.5- ，101.4- ，118.3-，169- ，202.8和253.5毫米延迟 。这两个实验的恢复延迟均为5 s 。使用标准的布鲁克（Bruker）交织2d 15n {1H}异核核对大关效应实验 ，恢复延迟为5 s。如先前所述，收集了其他纵向和横向交叉相关的交叉浮肿测量，分别为100和40 ms ，分别为ΔT弛豫周期。如先前所述 ，进行了无汇率R2速率（R2EFF）的计算 。65 。
如前所述，使用Mathematica（Wolfram）脚本完成了影响分析25。相应的纵向和横向交叉相关的交叉延误测量和15n {1H}异核核核次横向效应值在三种不同的田间强度下收集的效应值用于创建频谱密度分析景观 。这些特定于频率的数据拟合到多个相关时间 ，数量从4到9不等 ，并且使用蒙特卡洛模拟范围内（从2 ps – 2 ns到100 ps – 100 ns）范围内 。Akaike信息标准用于评估每种条件的统计相关性，表明最佳表示形式包括五次尺度 ，范围从36 ps到36 ns。
如先前所述50 ，对细丝组装，并进行较小的修改 。在40μl纯化的单体TAU（297-391）的等分试样以6 mg ml-1的速度进行组装反应 ，在384孔微板岩中密封并放置在Fluostar Omega（BMG LabTech）中 。在pH 7.2 、100 mM MGCL2和10 mM DTT的10 mM磷酸盐缓冲液中进行PHF反应。以前 ，我们报告了Tau（297–391）的体外组装中，其中MM MGCL2（参考文献3） 。不同浓度的MGCL2不影响PHF的形成 。CTE反应在pH 7.2 、150 mM NaCl和10 mM DTT的50 mM磷酸盐缓冲液中进行。使用200 R.P.M.进行720分钟的反应 。轨道在37°C下摇动 。我们以前的组装反应3在48小时内进行。等待更长的时间增加了PHF或CTE丝的总量 ，但也会导致丝团结合 ，从而使冷冻EM分析变得复杂。对于连续监测，将1.5μm的TH添加到反应中，每10分钟进行一次测量 。为了进行离线监测 ，进行了多个反应的重复 ，并且对于每个时间点，将其添加到一个单独反应的整个体积中 ，浓度为1.5μm 。
还进行了多个反应的复制品 ，以定量颗粒状tau。在0、60 、90 、120、360和720分钟时，收集了全部反应复制品的全部体积以进行超速离心 。在聚碳酸酯离心管（Beckman Coulter）中 ，将反应在20°C下以400,000克离心15分钟 。将沉淀重悬于40μl反应缓冲液中 ，以匹配上清液的体积。将加载缓冲液添加到上清液和颗粒中，然后在95°C下加热5分钟 ，每种1.5μl通过SDS-PAGE（4–20％Tris-Glycine Gels）运行 。使用ImageJ量化频段强度 ，并使用Prism 9.5.1（GraphPad软件）绘制数据 。
在特定的时间点，从振动器中取出微板 ，将3μl反应混合物施加到发光递减的R1.2/1.3 ，300网状碳AU网格。使用Vitrobot Mark IV（Thermo Fisher Scientific）在液态乙烷中陷入液体冻干 。服用每个等分试样后，重新密封了微板并在10分钟内返回振动板以继续组装反应 。
在医学研究委员会（MRC）分子生物学（LMB）以及Eindhoven（TFS）Thermo Fisher Scientific的研究与开发设施中获得了冷冻EM数据。在LMB，将图像记录在Krios G2（Thermo Fisher Scientific）电子显微镜上 ，该电子显微镜配备了猎鹰4摄像头（Thermo Fisher Scientific） ，而没有能量过滤器 。在TFS，将图像记录在带有冷场发射枪 ，Falcon-4相机和Selectris X（Thermo Fisher Scientific）能量滤波器的Krios G4（Thermo Fisher Scientific）上 ，该型号的狭缝宽度为10 eV 。使用EPU软件（Thermo Fisher Scientific）以每平方Ångström的30–40电子剂量记录所有图像，并在处理前使用relion_convert_to_tiff66转换为TIFF格式。
使用Relion的运动校正程序纠正 ，对齐和加权视频帧。67 。使用CTFFIND-4.1（参考文献68）估算对比传递函数（CTF）参数 。使用Relion-4.0进行螺旋重建（参考文献29,69）。使用Topaz70,71的修改版本手动或自动选择细丝 。在1,024或768像素的盒子中提取采摘的颗粒 ，并降低至256或128像素以进行初始分类 。
无参考的2D分类至少有150个类，忽略了CTF直到第一个峰 ，至少进行了35次迭代 ，以评估不同的多晶型物和交叉距离的存在。通过由CHEP算法启发的新的分层聚类方法鉴定出多符号（见下文） 。在384像素的盒子中重新提取选定的颗粒，以进行初始3D细化 。最初的3D参考是使用RELION_HELIX_INIMODEL2D73从2D类平均图像中生成的。对于颗粒数较低（<5,000）的FIA和结构 ，一种使用DeNoising 74正规化的新算法改进了初始修补 ，因为传统的细化导致由于过度拟合而导致重建的高噪声水平 。随后，使用3D分类和3D自动进行选择来选择导致最佳重建的粒子并优化螺旋参数 。对于某些数据集，3D分类也用于分离密切相关的多晶型物。对于用于原子建模的地图 ，使用贝叶斯抛光67和CTF细化75来增加分辨率 。最终地图使用依赖的标准后处理程序进行锐化 ，并在两个独立完善的半映射之间使用傅立叶壳相关性（FSC）估算了报告的分辨率（补充图49-52） 。通过主链羰基氧的密度确定的，与分辨率超过2.9Å的低温em图的触手可及。对于所有其他地图 ，手持性是根据在2.9Å以上的分辨率上解决的图中存在的子结构确定的。
根据最初的2D分类 ，每个细丝的2D类分配分布的余弦距离，通过算术平均值的未加权对组方法将采摘的细丝从分层聚集 。通过在指定的阈值或交互式上将树状图弄平 ，选择簇 。合并了低于最小颗粒阈值的簇（通常为1,000个）。为每个确定的群集进行了其他2D分类 ，迭代聚类和2D分类程序，直到获得2D类的视觉均匀种群为止 。然后选择丝状类平均值 ，并使用输出粒子进行改进 。
相对于采摘颗粒的总数 ，根据用于初始细化的特定细丝类型的提取颗粒的数量计算了每个数据集中细丝的百分比。对于自动采摘的数据集，有时首先使用初始的无参考2D分类来从选择过程中删除误报 。由于我们的图像分析中的局限性 ，报告的百分比可能无法反映原始组装反应中细丝类型的相对量 ，并且因为某些细丝类型可能比其他细丝在网格孔中更好地分散 。
原子模型是使用COOT76手动构建的，或使用ModelAngelo77自动构建。在ISOLDE78中进行了包含三个β-rungs的模型的坐标 。为了确保一致性，将中间梯级的二面角应用于顶部和底部梯级 。随后 ，针对每个精制结构对第一半映射进行了单独的模型修补。然后通过将其比较与此半图（FSCWORK）以及其他半图（FSCTEST）进行比较来评估所得模型（补充图49-52） 。使用Chimerax79制备了结构图 ，包括静电势和疏水性表面 。扩展数据图8是使用淀粉样蛋白插图器软件制备的。80。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。
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