根据地方法规获得了知情同意书 ，并根据地方法规和由国家审查委员会（IRB）批准的人类受试者研究方案获得了知情同意
，该协议是由国家审查委员会（IRB）批准的 。实验是根据地方法规在美国和法国进行的，分别在洛克菲勒大学和INSERM的IRB批准下进行实验 ，以进行人类遗传学和免疫学研究，包括那些使用HPSC衍生的组织特异性细胞进行研究目的的研究
。获得了法国伦理委员会（ComitédeProtection des enses）
，法国国家医学和健康产品安全机构的批准，以及巴黎的Inserm（协议C10-13）和纽约的洛克菲勒大学机构审查委员会（协议SHZ-0676）。与HPSC相关的工作得到了三机构干细胞倡议胚胎干细胞研究委员会（协议2021-05-003）的批准 。 　　原代人成纤维细胞是从对照 ，P1和P2的皮肤活检标本中获得的
，并在补充的DMEM（Gibco BRL，Invitrogen）中培养 ，并补充了10％胎儿小腿血清（FCS）（Gibco BRL
，Invitrogen）。永生化的SV40转换成纤维细胞系是通过使用含有T-抗原DNA的4 mg质粒通过电穿孔转染约500万个细胞的
。然后将细胞放入两个新鲜的75 CM2瓶中，每个瓶中含有12 ml DMEM（Gibco BRL ，Invitrogen）
，并补充了10％FCS（Gibco BRL，Invitrogen）。SV40成纤维细胞克隆大约15天后出现 。这些克隆被培养并通过用于实验用途
。将HEK293T细胞（ATCC）和HeLa细胞（ATCC）保持在补充10％FC的DMEM中。定期检查所有细胞 ，以确保它们对支原体阴性 。 　　通过从外周血细胞或患者的原发性成纤维细胞中萃取酚 - 氯仿分离基因组DNA
。DNA（3 µg）用Covaris S2超声波（Covaris）剪切。使用TRUSEQ DNA样品预备套件（Illumina）制备适配器绑扎的库 。使用SuneSelect人类所有外显子50 MB试剂盒（Agilent Technologies）进行外显子组捕获
。在Illumina Hiseq 2000（Illumina）上进行了配对的测序
，产生了100台读数。将序列与人类基因组参考序列（HG19构建）对齐，burrows-theeler对准器（V.0.7.12） 。使用基因组分析工具包（GATK ，v.3.4），SAMTOOLS（V.1.0）和PICARD工具（http://picard.sourceforge.net; v.1.92）进行下游处理
。分别使用GATK Unified Genotyper和Gatk indelgenotyperv2进行替换和插入或缺失（INDEL）调用。所有带有Phred缩放的单核苷酸多态性质量的调用
，包括20个或更少的读取覆盖范围 。所有变体都用内部开发的注释软件注释。 　　我们对319例HSE患者的同类和8,500人（对照组）进行了纯合非同义词和基本剪接位点变体的富集分析
。我们考虑了MAF低于0.01的非同义词和必需的剪接站点变体。我们搜索了HSE患者，8,500个对照和GNOMAD数据库中纯合状态中存在的所有变体（v.2.1.1） 。我们比较了逻辑回归模型中的变体的纯合子的比例 ，通过包括主要成分分析（PCA）的前五个主要成分
，从而解决了同志的种族异质性
。使用PLINK（v.1.9）对全异位序列和全基因组序列数据进行了PCA，使用1000个基因组项目3阶段公共数据库作为参考 ，使用15,000多个外显子变体
，MAF具有超过0.01，呼叫率大于0.99。我们还进行了Fisher的精确测试 ，以比较我们的HSE队列和GNOMAD之间TMEFF1纯合型变体的频率 。 　　来自对照组的基因组DNA样品
，两名患者及其父母用作300-600碱基对（BP）区域的放大模板，该区域将PCR与位点特异性寡核苷酸引物一起使用
。通过通过Sephadex G-50超精神树脂（Amersham-Pharmacia-Biotech）进行超速离心纯化PCR产物 ，并在ABI Prism 3700基因分析仪（Applied Biosystems）上与大染料终结量周期测序试剂盒进行测序。应用生物系统基础数据收集（V.3.0）用于收集Sanger测序数据 。Snapgene软件（V.7）用于序列分析
。 　　HSE发作后分别从P1和P2收集血浆。一组常见病毒的血清学测试使用常规酶联免疫吸附测定法
，使用联络XL平台（DIASORIN）测量针对各种病毒的抗病毒IgG抗体 。结果是以相对光单元的形式获得的，但在这里以每毫升所用血清的单位表示
。VirScan测定法用于根据根据非重叠的富集肽的数量定义的严格截止数量来评估对广泛病毒或其他病原体的抗体反应 ，或如前所述的30％的已知阳性样品中存在至少30％（如先前所描述的30％）中对单个反复靶向的诊断肽的血清阳性。VirScan热图上的整数代表每个样品中抗病毒药抗体识别的每个病毒的显着非重叠的富含富含富含的肽的数量 。尽管具有较高的灵敏度和特异性，但VirScan仍无法检测需要翻译后修饰的表位
，或在蛋白质片段上的不连续序列长度超过56个氨基酸。在分化紧密相关的病毒菌株中，VirScan也可能不如某些基于核酸的测试特异性
。34。 　　将TMEFF1（登录号Q8IYR6）cDNA插入到Pdonor克隆载体中 。用位置的诱变用于获得指示的突变构建体
。然后将所有TMEFF1和Nectin-1（Delta典型同工型Q15223-1）结构插入PTRIP进行过表达研究。对于FRET分析61 ，将CFP3A插入了信号肽后TMEFF1的N末端区域
，而PSYFP2-C1在信号肽后将PSYFP2-C1插入Nectin-1，HVEM和PILRA的N末端区域 。用于克隆的PSCFP3A-C1和PSYFP2-C1质粒是D. gadella的礼物（addgene质粒＃22879和＃22878）
。使用Snapgene软件（V.7）生成了用于亚克隆或生产截短蛋白质构建体的所有引物。对于慢病毒载体的产生 ，使用了包膜质粒PCMV-VSV-G
，包装质粒PSPAX2和转移质粒PTRIP 。所有构建体均已重新计算，以确保在克隆过程中不会产生不定的突变
。 　　将HEK293T细胞裂解在NP-40裂解缓冲液中（280 mM NaCl ，50 mm Tris
，pH 8，0.2 mm EDTA ，2 mM EGTA
，10％甘油，0.5％NP-40） ，补充1 mm DTT，Phosstop（Roche）和完整的蛋白酶蛋白酶和ROCH（ROCH）（ROCH）。将蛋白质裂解物进行SDS -PAGE进行
，并将所得带转移到硝酸纤维素膜上，并用未偶联的原代和二级抗体进行探测 。抗GAPDH抗体（Santa Cruz Biotechnology）用作负载对照
。我们使用了一种以1：500的稀释度（Santa Cruz Biotechnology ，B4
，SC-393457）识别TMEFF1蛋白N末端的抗体。该抗体，抗flag（Sigma-Aldrich ，A8592; 1：1,000稀释）和抗MYC（细胞信号技术
，2040; 1：1,000稀释）抗体和GAPDH（SC-477724，SANTA CRUZ CRUZ BIDECHOLOGY; 1：5,000 DILUTION）是从商业供应商那里购买的 。将膜在4°C下与原代抗体一起孵育过夜。SuperSignal West Pico化学发光底物（Thermo Fisher）用于可视化HRP活性 ，并使用Amersham Imager 600（GE Life Sciences）检测到该信号
。 　　两百万HEK293T细胞被用来播种6厘米菜过夜。用2 µg空载体或TMEFF1质粒和2 µg编码HSV-1受体（Nectin-1
，PILRA或HVEM）或HSV-1糖蛋白（GB，GD ，GD
，GH，GH ，GL，GL
，GL或GC）共转染 。36-48小时后，收集细胞 ，用冰冷的PBS洗涤
，并在IP缓冲液中裂解，其中包含1.0％（Vol/vol）Triton X-100 ，10％（Vol/vol）甘油
，100 mM Tris-HCl，pH 7.4 ，1.4
，1 mm EDTA，1 mm EDTA ，75 mm NACL NACL和蛋白酶抑制剂（Roche）
。离心粗细的全细胞裂解物
，并在4°C下与蛋白质G磁珠（Bio-Rad）加2 µg抗TMEFF1抗体（Santa Cruz Biotechnology，B4 ，B4，SC-393457）
，SC-393457）或小鼠IGGGGIGGISIPE型（SATANATANN）SCANTANN（SACTANTAN）在4°C下孵育并在4°C中孵育过夜。Nectin-1内源性IP分析使用了2 µg抗Nectin-1抗体（Thermo Fisher，37-5900） 。对于其他CO-IP分析 ，根据制造商的说明
，使用了抗FLAG M2亲和力琼脂糖珠（Sigma-Aldrich，F2426）或抗Myc琼脂糖珠（Sigma-Aldrich ，A7470）
。然后将珠子用IP缓冲液洗涤3次
，并在95°C的蛋白质负载缓冲液中用1％SDS洗脱相应的免疫沉淀物10分钟。对于免疫印迹，将全细胞裂解物和免疫沉淀物进行SDS-PAGE进行 。将所得条带转移到PVDF膜上 ，然后用抗TMEFF1（Santa Cruz Biotechnology
，b4，SC-393457）探测 ，抗抑制蛋白1（Thermo Fisher
，37-5900; 37-5900; 1：250 Dielution; 1：250 Dielution），Anti-flag M2 Hrp（Sig Mig（Sig） ，SIG;1：1,000稀释），抗C-MYC（9E10）HRP（细胞信号技术
，2272 s）和抗GAPDH小鼠单克隆（ProteIntech，HRP-60004; 1：5,000稀释）抗体
。 　　将皮质神经元铺在Mattek 35毫米＃1.5玻璃盖玻片（Mattek Corporation ，P35G-1.5-14-C）上
，密度为每CM2 1.5×105。皮质神经元中的内源性TMEFF1通过与兔多克隆抗TMEFF1抗体（Biorbyt，orb325220）的隔夜孵育 ，以1：1,000的稀释为染色
，然后与山羊抗兔AF488二型二级抗体（Invitrode抗体，A11034; A11034; 1：1500000000000000000000士州）进行对抗 。HEK293T细胞中的内源性Nectin-1通过与小鼠单克隆抗Nectin-1抗体（Novus生物学 ，NBP2-54643-0.1 mg）的隔夜孵育
，以1：500稀释，在用山​​羊抗抗体Afi Afi Af647多胞质抗体（Biot af647 polyclonal抗体（Biot）抗体（40.500）稀释之前 ，可将其染色
。稀释1小时。根据制造商的协议
，用膜固定ST 755/777细胞表面染色试剂盒（Biotium，30104-T）或WGA Alexa Fluor Plus 770（Thermo Fisher ，W56134）用膜固定ST 755/777细胞表面染色试剂盒进行细胞表面染色 。根据制造商的协议，将富含的染色体DNA用DAPI（Thermo Fisher
，62248）染色。然后，用倒置的LSM 980激光扫描共聚焦显微镜（Zeiss）成像皮质神经元 ，配备了60×1.4 Na的油度镜头
，34个光谱检测通道（使用GAASP PMT检测器，两个Multialkali PMT ，一个Nir Gaas PMT
，一个NIR GAAS PMT和One nir Gaasp pmt和One nir Gaass 7 sirys 7 nir pmt和One nir a kael tectair tector pmt和One nir pmt tectration 5使用Zeiss Zen Blue采集软件（v.3.5）
。 　　WT或TMEFF1-KO HEK293T细胞稳定地表达nectin-1在48孔板中以每孔5×104个细胞的密度铺板，并用重组HSV-1 GD用他的标签（Acro Biosystems Inc ，GLD-V52H3）在37°°C中用重组HSV-1 GD处理150分钟。收集细胞并通过与4％PFA孵育15分钟
，并通过在PBS中与6％BSA孵育1小时固定细胞 。然后用PE结合的小鼠抗Nectin-1（Biolegend，R1.302 ，340404）以1：2,000的稀释度和APC偶联的小鼠抗His-TAG（Biolegend
，J095G46，362605）抗体 ，将细胞染色30分钟
。然后用PBS洗涤细胞两次，并通过流式细胞仪进行分析。 　　为了评估TMEFF1在细胞表面的表达
，将细胞以每个孔的5×105细胞的密度为5×105细胞，并用纯化的小鼠抗TMEFF1抗体（Santa Cruz Biotechnology ，b4
，sc-393457）以1：1,000的稀释为1：1,000 。然后将它们用PBS+1％FC洗涤3次，并与AF488偶联的抗小鼠抗体孵育30分钟 ，在PBS+1％FC中稀释1：1,000（Invitrogen
，A11001）
。然后用PBS+1％FC洗涤细胞两次，并通过流式细胞仪进行分析。在Gallios流式细胞仪（Beckman Coulter）上采集样品 ，并使用FlowJo软件（Tree Star）分析结果 。 　　为了评估细胞表面内源性Nectin-1的表达
，将HEK293T细胞以每个井的密度为5×104个细胞在48孔板中铺板，并用PE共轭小鼠抗nectin-1（Biolegend ，r1.302
，r1.302，＃340404）以1：2,000的稀释为1：2,000
。用PBS洗涤细胞两次 ，并通过流式细胞仪进行分析。在LSRII流式细胞仪（BD Biosciences）上采集样品，并使用FlowJo软件（Tree Star）分析结果 。 　　SV40成纤维细胞或HPSC衍生的皮质神经元用于每CM2的密度为1.5×105个细胞的六孔板
。为了评估TLR3相关的反应
，用TLR3激动剂聚（I：C）（Tocris，4287；低分子量的混合物（250-1,000 bp）（250-1,000 bp）和高分子量的混合物（超过1,000 bp） ，以25 µG ML-ML ML ML ML ML-ML-ML-1的浓度刺激细胞的混合。（2 h
，4 h和6 h） 。为了评估HSV-1诱导的反应，将细胞感染HSV-1（MOI 1） ，并在感染后24小时通过RT-QPCR进行评估。为了评估I型干扰素反应
，用IFNα2B（Schering，NDC-0085-0120-02;每ML 1,000单位）或IFNβ（PBL Assay Science 11415-1;每ML 100单位）刺激细胞 ，并通过刺激后的RT-QPCR进行评估
。 　　从市售的人体组织中分离RNA（Clonetech
，636643），外周血单核细胞 ，成纤维细胞
，HPSC衍生的皮质神经元，HELA或HEK293T细胞 ，以及使用Quick-RNA Microprep kit和Zymo IC的Zymo IC列的质粒转染和无质粒转染的，有或无需质粒转染（RNA）（rna）。根据制造商的说明
，我们用细胞到CT试剂盒（AM1729，Thermo Fisher）从细胞中提取mRNA 。RT–qPCR was performed on an Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System with Applied Biosystems TaqMan assays for TMEFF1 (Hs00902905_m1, spanning exons 1–2; Hs00186495_m1, spanning exons 9–10), NECTIN-1 (Hs01591978_m1), HVEM（TNFRSF14）（HS00998605_G1） ，PILRA（HS00956112_M1）和β-葡萄糖醛酸酶（GUS
，＃4310888E）进行归一化基因
。使用Applied Biosystems 7500软件（V.2.0.6）分析结果，并根据制造商套件中所述 ，根据ΔΔCT方法表示结果。 　　使用Quick-RNA MicroPRE试剂盒（R1051
，Zymo Research）从HPSC衍生的皮质神经元中提取RNA 。使用Illumina Ribozero Truseq绞合的总RNA库Prep Kit（Illumina）制备RNA-Seq库，并在Illumina Novaseq平台上完成RNA-Seq ，读取长度为100 bp
，读取深度约为4000万次
。所有样品均在技术重复项中进行测序。所有FASTQ文件都通过质量控制，并与Star（2.6.1d）与GRCH38参考基因组对齐 。基因级特征是使用基于GRCH38基因注释的featurecounts v.1.6.0量化的
。使用Edger软件包（V.3.40.2）62中的每百万计数 ，通过PCA降低尺寸
，并使用ComplexHeatMap（v.2.14.0）进行热图分析，将计数数据标准化。使用DESEQ2（V.1.38.3）64进行差异表达分析 。对于Nectin1的同工级分析 ，将RNA-Seq FastQ文件与Kallisto（V.0.48.0）65的转录组指数（Ensembl Release 110）进行伪一致
。转录组学级特征被量化并标准化为每百万的转录本。研究了每组条件的重复项，并将平均基因表达水平用于后续分析 。 　　通过通过非整合细胞节仙台病毒载体试剂盒（Life Technologies）感染患者的原发性成纤维细胞（Life Technologies）
，从而获得了患者特异性IPSC。人类胚胎干细胞（HESC）或IPSC（共同称为HPSC）培养物在Essential 8培养基（Life Technologies，A1517001）中
。我们使用了一条健康的对照hESC系（H9 ，我们可以根据Wicell从Wicell进行的材料转移协议进行描述的实验）
，一项健康对照IPSC线（BJ1）和来自其他HSE HSE患者的HSE HSE患者的iPSCS（iPSC），具有常染色体隐性TLR3或IFNAR1缺陷率（TLR3 - / - /--/ - 及IFNAR1 - -AR -and -ifNAR1） ，以前是从前进行了研究。我们还使用了两条基因编辑的TMEFF1-KO IPSC系和两条通过本研究提供的患者特异性TMEFF1突变的IPSC系 。验证了新得出的IPSC线
，以消除生物群和实验用途前消除转基因表达24
。通过从患者IPSC系中提取的基因组DNA的Sanger测序证实了患者特异性的TMEFF1突变。所有HPSC均进行核分型，以确保基因组完整 。 　　将皮质神经元与在涂有VTN-N（Thermo Fisher）的10厘米板上的E8 Essential培养基中生长的HPSC分化
。在含5％CO2的大气中 ，将细胞保持在37°C。根据已发表的方案37
，将HPSC分化为皮质神经元 。简而言之，HPSC通过ACCUTASE（创新细胞技术 ，AT-104）处理以获得单细胞悬浮液
，该悬浮液在补充的岩石抑制剂（Y-27632二氢氯化物，10 µm; tocris tocris; tocris ，1254）上以每cm2的密度为300,000个细胞密度为300,000个细胞
。将细胞培养在包含LDN193189（100 nm）（Stemgent，04-0074）和SB431542（10 µM）（Stemcell Technologies
，72234）的Essential 8培养基中，添加了XAV939（2 µm; Tocris ，3748/10）
，用于第一个三天，持续了10天。在基于N2的培养基（Gibco ，17502048）中
，用B27（Gibco，12587010）补充了基于N2的培养基（Gibco ，17502048）的细胞11-20天
，以促进神经祖细胞的发展 。然后将这些细胞解离并在多层氨酸/纤连蛋白/层粘连蛋白涂层的板上进行了回答，并将其维持在补充BDNF（R＆D Systems ，248-BD）的神经性培养基中D0627）
， - 谷氨酰胺（Gibco，35050061）和B27（Gibco ，12587010），以促进神经元分化和成熟
。所有实验均在DIV 50的HPSC衍生的皮质神经元上进行。 　　使用SV40转化的成纤维细胞和HPSC衍生的皮质神经元的RNeasy Mini Kit（Qiagen）提取总RNA 。根据制造商的说明
，使用上标III第一链合成系统（Thermo Fisher）对RNA进行了反转录。使用2×TAQ PCR主混合（ApexBio）和TMEFF1引物（正向，5'-GCCTTGCCCTGAAAACCTCA-3';反向 ，5'- GTTCATGCGATAGGCAGGCAGTGTC-3'）进行PCR
。将PCR产物插入PCR2.1-TOPO载体（生命技术）中
，并用于改变恒星竞争的细胞（Takara Bio）。每个受试者至少有100个菌落用于P1和健康对照 。最后，我们对这些菌落进行了PCR ，并用TMEFF1引物（正向
，5'-GTAAAAACGACGGCCAG-3';反向：5'-caggaaAcagctatGac-3'）对它们进行了测序
。 　　如先前所述36进行了基因编辑实验。简而言之，使用CRISPR设计工具（http://crispr.mit.mit.edu/）生成指南RNA序列 。人TMEFF1的CAS9目标位点为5'-GatgagtCatCatGtaAata-3'
。将指导RNA插入PSPCAS9（BB）-2A-EGFP载体中 ，然后在存在Lipofectamine LTX（Invitrogen）的情况下用于转染BJ1 IPSC细胞；24小时后
，通过在96孔板中的细胞上通过流式细胞仪对EGFP信号进行分类。单细胞克隆通过Sanger测序进行基因分型 。对于BJ1 TMEFF1-KO基因分型，在本研究中使用了以下引物（正向 ，5'-GCAGGATTCTGTTGGGAGAATAC-3';反向
，5'-CCTCTCATCTCAATTCCATGCAAGCAG-3'）
。 　　使用HEK293T或HELA细胞通过Synthego CRISPR基因基因敲除KIT v.2进行基因编辑。The Cas9 target site for human TMEFF1 is 5′-CAGCCGGAGCGGCGCCTCAG-3′, 5′-CGCGCGTCCAACCAGCCCCC-3′ and 5′-ATGCTCTTGCCTTTGCCGCC-3′, and the target site for human NECTIN1 is 5′-GCAGGAATTCCACACGCTCG-3′,5'-GTAGATGGCCACGTTCTGCT-3'和5'-GTGATCTTCACGCTGGGAAG-3' 。通过Sanger测序对散装或单细胞克隆进行基因分型
。对于HEK293T和HELA TMEFF1-KO基因分型，使用了以下引物：正向 ，5'-cacaaagggaaggcgcgaggaggaga-3';反向，5'-CCACGACGGGGGTCTTCCC-3'。对于HEK293T和HELA Nectin1-KO基因分型
，使用了以下引物：正向，5'-tctggatgaAcaggggggggg-3';反向 ，5'-aactgtgtgggtggggg-3' 。 　　如上所述
，我们培养了IPSC衍生的皮质神经元。如前所述47，在CCF2测定中评估了通过HSV-1进入细胞向细胞的递送
。将培养基替换为0.6 µL CCF2-AM ，5.4 µL溶液B
，79 µL溶液C（CCF2-AM Live-Blazer Dye溶液； Invitrogen，K1032） ，15 µL probenecid和500 µL初始培养基。将细胞在37°C下在含有5％CO2的大气下孵育40分钟
，以加载胞质溶胶用CCF2底物加载 。然后将细胞用培养基洗涤3次，并在100的MOI中用HSV-1感染 ，其中β-内酰胺酶融合到PUL47（HSVF-GS＃6389）或WT HSV-1（GS＃2695）的C末端
。感染后一小时
，使用配备有40×，1.3 Na油物镜的倒置显微镜成像细胞成像使用SoftWorx采集软件（v6.5.2）。捕获了单个场的三个顺序图像 ，第一个图像是使用381–399 nm激发滤波器和435/48 nm发射滤波器获得的荧光图像 。使用381–399 nm激发滤波器和525/50 nm的发射滤波器获得了第二个图像，最终图像是明亮的场图像
。通过绘制感兴趣的区域（ROI）来量化CCF2裂解 在明亮场图像的细胞中心
，然后确定435 nm和525 nm图像的ROI中的平均荧光强度。通过将435 nm ROI的平均荧光强度除以525 nm ROI的相应平均荧光强度来计算比率值 。在每个实验中，每组条件记录了至少30个ROI的三个独立实验 ，获得了比率测量值
。结果中显示的每个点代表了一个细胞内细胞内CCF2裂解的测量。使用ImageJ软件（V.2.3.0/1.53F）进行图像分析 。使用GraphPad Prism 9（V.9.2.0）进行统计分析
。 　　IPSC衍生的皮质神经元被HSV-1感染
，融合到直接的RFP记者（HSVF-GS＃3217）66,67,68,69。感染后10小时，在PBS中用4％多聚甲醛固定细胞 。将皮质神经元用抗MAP2抗体以1：1,000（ABCAM ，AB11267）染色
，然后用抗小鼠IgG Alexa Fluor 488以1：500（Invitrogen，A11001）抗体抗染色。核用DAPI标记（Thermo Fisher ，62248）
。使用配备40倍
，1.3 Na油物镜的倒置显微镜和PCO。在表达MAP2的皮质神经元的核心中心抽取ROI，并在其中测量了RFP强度 。如果细胞的RFP排放量比该场的背景高3.1倍以上 ，则被认为是感染的
。我们每个条件至少分析了50个单元。至少三个独立的实验获得了图像 。使用ImageJ软件（V.2.3.0/1.53F）进行图像分析
。使用GraphPad Prism 9（v.9.2.0）进行统计分析。 　　HSVF-GS＃3217感染了TMEFF1变体的HEK293T和HELA细胞 。感染10小时后用4％多聚甲醛固定细胞
。将细胞用PBS（PBST）中的0.1％Triton-X100（Sigma-Aldrich）透化
，并通过在PBST中与6％山羊血清孵育一小时。然后，通过稀释的1：250（Santa Cruz Biotechnology ，B4，SC-393457）耐用小鼠抗TMEFF1抗体隔夜孵育细胞
，并与抗小鼠IgG Alexa Fluor 488抗体孵育，以1：500 InvitRogen（Invitr）（Invitorgogen ，A111001）孵育 。核用DAPI标记（Thermo Fisher
，62248）
。使用Zeiss Zeiss Zen Black Acquisition软件（V.2.3 SP1），使用配备63倍 ，1.4 NA油目标镜头的LSM 880 Airyscan NLO倒激光扫描共焦点和多光子显微镜捕获图像。在过表达TMEFF1的细胞细胞核的中心绘制了ROI
，并在其中测量了RFP强度 。 　　对于WT HSV-1（KOS菌株，ATCC）感染 ，每个孔的1.75×105皮质神经元用于播种48孔板。在神经元培养基中以0.001的MOI感染细胞
。2小时后
，洗涤细胞，将250μl新鲜培养基添加到每个孔中。HSV-1感染并冷冻后 ，在各个时间点收集细胞和上清液 。如前所述21
，通过计算Vero细胞（ATCC）上的TCID50的TCID50来确定HSV-1滴度
。 　　如果适用，结果表示为平均值±S.E.M.或中位±四分位数范围。通过Tukey测试进行多次比较 ，比较了单向ANOVA中的对照细胞和细胞之间的对照细胞和细胞之间的平均值 。如有指示，线性混合模型用于对数转换的相对值
，以解释重复测量值
。如果发现数据遵循非正态分布，则使用Dunn测试进行多个比较的Kruskal – Wallis测试。两尾Mann-Whitney U检验用于两组之间的比较 。在本研究中未使用盲或随机分组
。使用SPSS 19.0和GraphPad Prism 9（V.9.2.0）进行统计分析。统计显着性表示如下：NS ，不显着；p> 0.05;*p <0.05;** p <0.01;*** p <0.001;**** p <0.0001 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得
。