通过免疫组织化学分析了20名在常规的组织病理学诊断程序中获得的20例黑色素瘤患者（临床III-IV）患者的皮肤转移。GP100（未稀释），S-100（未稀释）和Sox10（未稀释）使用自动化的Ventana基准平台和标准协议 。这些研究是在常规临床检查的背景下进行的 ，并获得了奥托 - 冯·古近大学医院医院伦理委员会的批准（批准编号为162/20）
。 　　分析了来自19例患者（临床期IIIB – IV）的皮肤（n = 5）
，亚库（n = 4）的20种黑色素瘤转移（n = 4）和淋巴结（n = 11）的20种黑色素瘤转移的幼体肿瘤活检的细胞悬浮液。先前描述了肿瘤解离，文库构造 ，SCRNA-SEQ数据获取和分析的方法20 。这项研究得到了UZ Leuven医学伦理委员会的批准
，并获得了所有患者获得的书面同意
。通过高免疫特征评分和低拷贝数变化评分，将免疫细胞与其他肿瘤微环境细胞区分开。接下来 ，使用Singler重新聚集并注释细胞 。使用AUCELL R Package49测量MHC-I和MHC-II基因签名分数。 　　如前所述50，根据人类黑色素瘤活检发表的米兰方案50
，通过顺序免疫染色和抗体去除来产生多重免疫荧光图像
。从已发表的面板中包含的完整41个蛋白质标记中，包括Panck（1 µg ML-1） ，CD3（1 µg ML-1）
，CD4（1：200），CD8 ，（1 µg mL-1）
，Foxp3，Foxp3（1 µg ml-1） ，MHC-II（1 µg mHc-ii（1 µg mHc-ig-ml-ML-1）
，CD68（1：500），MITF（1 µg ML-1）和CD31（1 µg ML-1）分别显示出染色角质形成细胞 ，效应T细胞
，MHC-II，表达髓样细胞亚群 ，黑素细胞亚群，黑素细胞
，黑素瘤细胞和血管。如前所述进行图像分析51 。简而言之，经验丰富的病理学家对污渍进行了视觉评估
。使用方法学的自定义实现52进行了平面校正。使用先前描述的算法53注册连续的染色弹 。使用仅用二抗染色的基线图像减去组织自荧光
。 　　在12小时的光/黑暗周期中 ，将小鼠安置在环境温度和湿度控制的环境中
，以模仿自然条件。野生型C57BL/6J小鼠是从Janvier或Charles River购买的 。T细胞受体转运PMEL-1（B6.CG-THY1A/CY TG（TCRATCRB）8REST/J），TRP-1（B6.CG-RAG1TM1MOM TYRP1B-W TG（TCRA ，TCRA
，TCRB，TCRB）9REST/J） ，OT-ot-ot-ot-i（C57BL/6-TG/6-TGB）（B6.CG-TG（TCRATCRB）425cbn/j）小鼠
，以及荧光B6-EGFP（C57BL/6-TG（UBC-GFP）30scha/j）和CD11C-eyfp（B6.cg-tg（itgax-tg）（itgax-venus）1mmnz）1mnz）小鼠是从杰克（Jackson）购买的
。通过将CAG-Venus小鼠与PMEL-1小鼠交叉产生PMEL-1-Venus小鼠。通过将B6-EGFP小鼠跨到TRP-1缺乏的RAG1-KO背景TRP-1小鼠中，产生TRP-1-EGFP小鼠 。通过将CAG-Venus小鼠与OT-I小鼠交叉产生OT-I-I-Venus小鼠
。通过将OT-II小鼠与HCD2-DSRED小鼠（由C. halin提供）来产生OT-II-DSRED。所有转基因小鼠均在房屋中繁殖 。年龄匹配的肿瘤发育中小鼠的队列被随机分配给不同的实验组。所有动物实验均根据C57BL/6背景的雄性小鼠在特定的无病原体条件下在没有病原体的条件下在单独通风的笼子中 ，根据在德国萨克斯尼 - 阿纳哈尔特州兽医事务的伦理学委员会批准的机构和国家指南
，以批准和使用实验动物（萨克斯尼 - 阿纳哈尔特州的兽医委员会）（允许允许的42502-15-15-1393 UNIMI II II II MD，MD ，42502-2-1615 UNI MD，42502-2-1672 UNI MD）按照欧盟的立法（理事会指令499 2010/63/eu）和德国联邦共和国（根据§8
，第1款，第1款Tierschg和Tierschversv）
。 　　如先前所述 ，通过在我们的实验室中的序列移植在HGF-CD4KR24C小鼠模型中的原发性黑色素瘤中建立了小鼠黑色素瘤细胞系HCMEL12。小鼠黑色素瘤细胞系B16和人类黑色素瘤细胞系A375和SKMEL28购自ATCC 。人类黑色素瘤细胞系Mamel04和Mamel102由D. Schadendorf提供
。All cell lines were cultured in complete Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium consisting of RPMI 1640 medium (Life Technologies) supplemented with 10% foetal calf serum (Biochrome), 2 mM -glutamine, 10 mM non-essential amino acids, 1 mM HEPES (all form Life Technologies), 20 µM 2-mercoptoethanol (Sigma),100 IU ML -1青霉素和100 µg ML -1链霉素（Invitrogen）在具有5％CO2的加湿孵化器中。常规筛选细胞系以进行支原体污染
，并由商业提供商或短串联重复指纹进行身份验证 。 　　为了测量小鼠和人类黑色素瘤细胞系中细胞死亡的测量，首先将细胞在完全rpmi培养基中的96孔板中播种
。Inflammatory mediators were added after 24 h (10 U ml−1 recombinant mouse IFNγ (Peprotech); 1,000 U ml−1 recombinant mouse TNF (Peprotech); 100 U ml−1 animal-free recombinant human IFNγ (Peprotech); 1,000 U ml−1 recombinant human TNF (Peprotech) and 100 µM SNAP (Cayman化学物质））。24小时后 ，使用异硫氰酸荧光素（FITC）膜联蛋白V凋亡检测试剂盒I（BD Pharmingen）收集浮动细胞并染色
，并使用Attune NXTUNE NXTUNE声学焦点流式细胞流式细胞仪（Thermofisher）进行分析 。 　　为了生成腺病毒疫苗AD-PT，由人类PMEL互补DNA的前150个碱基对产生了融合构建体（编码人类PMEL/GP100蛋白的氨基酸1-50 ，包括CD8+ T细胞Epitope Espopope kvprnqdwl）和包括1,404酸的CDNNA（CDNNA）（CDNNA）（CDNNA）51 cDNA（CDNA）（编码）
。CD4+ T细胞表位SGHNCGTCRPGWRGAACNQKILTVR）
，然后是编码T2A病毒自我切割肽和黄色荧光标记蛋白EYFP的序列。将这种疫苗构建体被克隆到pshuttle载体（称为pshuttle-pt-yfp）中 。然后，使用BACMID PADZ5-CV5-E3+在大肠杆菌菌株SW102中的重组技术生成了具有该序列的重组腺病毒载体
。该BACMID的E1区域被称为氨苄西林 ，LACZ
，SACB或ALS Cassette的选择/反式盒式盒子取代。接下来，用PT-YFP转基因将带有该杆菌的大肠杆菌用PSSHUTTLE-PT-YFP作为模板进行电孔 ，并用PT-YFP转基因与同源臂进行了同源臂 。在LB核板上选择抗生素后分离阳性菌落。使用911人类胚胎视网膜细胞系扩展AD-PT和AD-OVA
。T175细胞培养瓶中细胞的汇合单层被MOI 1感染了AD-PT或AD-OVA。在37°C下孵育36小时时，观察到细胞性效应 。接下来
，将细胞刮擦，冻融三次 ，裂解液通过以7,000克的速度离心45分钟来清除裂解液
。然后根据标准方案通过TCID50方法滴定原油病毒。 　　为了产生CIITA-KO
，TRP1-KO，JAK1-KO和TYR-KO HCMEL12变体 ，使用了HCMEL12黑色素瘤细胞
，可以使用CRISPR-CASPR – CAS9介导的基因编辑很容易地对其进行遗传修饰55 。根据制造商的指令，将细胞以每个孔的5×105细胞密度为5×105细胞 ，并用Fugene HD Transfection Reagent（PROMEGA）与1.6μgPX330-SGRNA和0.4μg质粒（PRP-GFP）染色
。使用FACSARIA III细胞分类器（BD）对GFP阳性细胞进行单细胞分类
，以产生每个靶向基因的多克隆和单克隆群体。将HCMEL12细胞用无单诱导RNA的PX330质粒模拟转染，并且在所有执行的实验中 ，多克隆细胞系都用作CRISPR-Control 。根据制造商的方案
，使用核世精组织试剂盒（Macherey-Nagel）提取培养的基因敲除变种的基因组DNA
。进行了两步PCR协议，以生成针对下一代测序的靶向PCR扩增子。在第一个PCR中 ，使用与条形码引物相互互补的靶基因的特异性引物用于扩增使用Phusion HD聚合酶（新英格兰Biolabs）的基因组区域 。在第二个PCR中，使用了包含条形码序列的适配器特异性引物和Illumina适配器序列P5和P7（Illumina Barcodes D501-508和D701-D712）
。根据制造商的标准方案
，使用Miseq基因和小基因组测序仪（Illumina）进行下一代测序，并具有单端读取和300个周期（Miseq Reagent Kit Kit Kit Kit v.2 300循环）。为了检测插入或删除 ，基于Web的程序OUTKNOCKER（http://www.outknocker.org/）如前所述使用了56 。导入FASTQ文件
，并将目标基因扩增子的序列用作对齐的参考序列。 　　使用蛋白酶抑制剂（Thermo Scientific）使用M-Per哺乳动物蛋白试剂（Fermentas）裂解黑色素瘤细胞
。根据制造商的规程，使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Scientific）通过基于Bradford的测定法测量蛋白质浓度。加入Laemmli缓冲液 ，并在95°C下煮沸5分钟 。然后
，将10μg的蛋白质加载并根据3％堆叠和10％聚丙烯酰胺凝胶的SDS -PAGE凝胶电泳根据尺寸分离
。将蛋白质通过湿印迹1小时转移到具有0.2μm孔径（GE Healthcare）的聚氯乙烯膜中。在PBS中用5％的脱脂牛奶封闭非特异性结合，持续1小时 。用山羊多克隆TRP1抗体（1：1,000 ，Novus生物学）在4°C染色
。接下来
，将印迹与抗山羊IgG HRP（1：2,000，Santa Cruz）一起在室温下孵育1小时。辣根过氧化物酶偶联的β-肌动蛋白（200 µg ML-1）用作负载对照 。通过信号激发ECL试剂（细胞信号技术）检测到结合抗体 ，并使用章鱼QPLEX成像仪（NH DyeAgnostics）可视化化学发光
。 　　为了产生TAGBFP
，MCHERRY和OVA-TAGBFP表达细胞系，通过使用逆转录病毒包装结构将人类胚胎肾脏293T细胞转染 ，从而产生逆转录病毒。分别根据标准协议 。含逆转录病毒的上清液用于转导靶细胞系，并使用10 µg ML-1紫霉素转导后48小时开始转导细胞的抗生素选择
。 　　对于肿瘤接种
，将总共2×105个细胞内后（I.C.）注射到剃须的侧面或30克（0.3×13 mm）注射针（BD）的小鼠的剃须侧面或助力。通过检查和触诊来监测肿瘤的发育 。每周三次测量肿瘤大小，并表示为平均直径。当肿瘤超过15 mM平均直径或小鼠在遵守局部伦理法规时表现出疾病的迹象时 ，将小鼠安乐死
。所有动物实验均以四到六只小鼠的组为组
，并至少两次重复。 　　如前所述23,24进行了ACT治疗 。简而带有幼稚的PMEL-1/GP100特异性CD8+ T细胞和/或幼稚TRP-1特异性CD4+ T细胞的TRP-1供体小鼠（在100 µL PBS中）
。除非另有说明，否则我们将含有5×105抗原特异性T细胞的脾细胞转移。通过单个腹膜内 ，在体内刺激了从属转移的T细胞 。在100 µL PBS中注入2.5×108 PFU的重组腺病毒疫苗AD-PT
。在T细胞转移后第3、6和9天
，向肿瘤注入50 µg CpG 1826（MWG Biotech）和50 µg聚糖尿病：聚囊酸（Polyi：C，Invivogen）在100 µL蒸馏水中稀释。T细胞转移后七天 ，通常从腔静脉面部从腔静脉中取出血液
，以确认通过流式细胞仪成功扩展T细胞 。 　　NK细胞耗竭是由单个腹腔内进行的
。在100 µL中注射200 µg抗NK1.1抗体（克隆PK136，bioxcell） ，在pH 7.0稀释缓冲液（Bioxcell）中稀释。CD8+ T细胞耗竭是通过I.P.进行的 。注射最初为100 µg
，然后每周注射50 µg抗CD8抗体（克隆2.43，bioxcell）
。MHC-II封锁是由单个i.v进行的。在数据采集之前 ，直接注射500 µg抗MHC-II抗体（克隆Y-3P，Bioxcell）
，在2P-IVM中诱导麻醉，大约30至60分钟 。IFNγ封锁是通过每周I.P进行的在100 µL中注射500 µg抗IFNγ抗体（克隆XMG1.2 ，生物XC）
，在pH 8.0缓冲液中稀释。单核细胞耗竭是通过i.p.进行的连续五天注射20 µg抗CCR2（克隆MC21，由M. Mack提供）
。中性粒细胞消耗是通过腹腔注射的。每五天注射100 µg抗Ly6g（克隆1A8 ，bioxcell） 。iNOS的抑制是由每日i.p.进行的在100 µL PBS中稀释的200 µg L-NIL（Cayman Chemicals）
。 　　单细胞悬浮液的免疫染色是根据标准方案进行的。在用抗CD16/CD32（1：300
，Biolegend）孵育单个悬浮液，然后用荧光聚糖偶联的单克隆抗体CD45-APC FIRE 750（1：1,600）（1：1,600） ，CD11C-APC（1：200）
，F4/80-PE（1：300），CD11b-cdy111111111111111111em ，CD11C-APC（1：1,600）
，（1：2,000），CD45R-PE（1：1,000） ，CD3ε-BV421（1：500），CD4-BV605（1：500）
，NK1.1-APC（1：400），CD45-FITC（1：1,000） ，F4/80-apc（1：200）
，ly6c-bvv bv v v fitc（1：1,000）I-A/I-E-E-BV510（1：800），CD45-BV711（1：200） ，CD11C-APC FIRE 750（1：100）
，SIGLEC H-FITC（1：400），CD4-PE（1：1：1：1,600） ，CD11B-PE-PE-CY7（CD11B-PE-CY7（1：2,000）
，LY6G-PE（1：1：1：1：1：800），1：800） ，1：800）
，1：800），3-800（1：800）（1：800）（1：800）（1：800）（1：800）（1：800）（1：800）（1：800）（1：800）（1：800）（1：800）（1：800）（1：800）（1：800）（1：800） ，3（1：800），3岁（1：800）
，3CD8α-APC Fire 750 (1:1,600), H2-Kb-PE (1:500), I-A/I-E-APC (1:2,000), CD3ε-FITC (1:100), CD335-APC (1:100), CD8α-PE (1:800), Vβ14-FITC (1:2,000), T-bet-PeCy7 (1:200) andFoxp3-Alexa Fluor 647（1：100） 。使用固定/透明溶液试剂盒（BD或Biolegend）进行细胞内染色
。首先用针对细胞表面抗原的抗体染色的单细胞悬浮液，然后固定并透化 ，然后进行细胞内染色。使用7-氨基分霉素或碘化丙啶进行死细胞排除 。所有数据均以Attune NXT Outtic Focusing流式细胞仪（Thermofisher）获取
。使用FlowJo V.10.8.1对Windows（Tree Star
，Inc。）进行门控和后续分析 。使用ARIA III（BD Biosciences）进行荧光激活的细胞分选
。 　　为了量化肿瘤组织中的免疫细胞亚群的丰度，每个生物样品有2,000个感兴趣的细胞与单个FCS文件相连。使用OPT-SNE Learning Configuration57在Flowjo中生成T分布的随机邻居嵌入（T-SNE）图57 。有利的点树k-nearest-neybours算法和Barnes-Hut梯度算法设置为1,000次迭代 ，30个困惑和840个学习率。根据特征标记组合的热图注释免疫细胞亚群
，并计算出其在肿瘤中的百分比
。 　　为了量化MHC分子的表达，将肿瘤细胞用100 U ML -1重组鼠IFNγ（peprotech）预处理72小时 ，然后通过流式细胞仪进行分析。为了评估CD4+ T细胞的抗原识别
，用AD-PT对TRP-1 TCRTG小鼠进行了免疫，然后注入50 µg CpG和50 µg Polyi：C I.C.免疫后3天和6天 。从脾脏中分离出TRP-1 CD4+ T细胞 ，并通过两轮磁细胞分选（Miltenyi）纯化
。直接的抗原识别是通过与IFNγ预处理的HCMEL12细胞共培养纯化的CD4+ T细胞来确定的。如前所述
，通过最初用重组GM-CSF和IL-4（Peprotech）产生骨髓来源的树突状细胞来评估代理中的抗原识别 。1周后，将分化的骨髓来源的树突状细胞与HCMEL12裂解物脉冲过夜 ，然后用纯化的CD4+ T细胞共培养
。对于直接和髓样细胞依赖性抗原识别分析，通过标准方案
，使用流式细胞仪，通过细胞内细胞因子染色来测量CD4+ T细胞从CD4+ T细胞中产生的IFNγ。 　　用镊子和剪刀切除肿瘤 ，然后使用Entris 224-1S分析平衡（Sartorius）称重 。使用5-mL注射器柱（BD）和70 µM细胞滤网（Greiner）机械地创建单细胞悬浮液
。免疫染色后
，将细胞悬浮在定义的体积中，并对使用独特的体积样品和鞘液输送系统进行了Attune NXT的声学流式细胞仪进行分析 ，从而可以准确测量定义样品体积分析的细胞数量。然后可以通过将定义样品体积计数的CD45+免疫细胞的数量与相应的单细胞悬浮液的总体积相乘
，从而得出单个肿瘤中活细胞中活细胞的总数 。该总数按肿瘤的总重量的划分产生了每毫克肿瘤组织的绝对免疫细胞计数
。各种免疫细胞亚群的绝对计数是根据其可行CD45+免疫细胞中的相对百分比计算得出的。 　　在ACT后的第5天收获肿瘤，并在4％多聚甲醛中固定24小时 ，然后在20％的蔗糖中脱水
，然后嵌入最佳切割温度冻结培养基（Sakura Finetek） 。接下来，将6 µm的切片切在CM305S低温恒温器（Leica）上 ，粘附在Superfrost Plus载玻片（VWR）上
，并存储在-20°C下，直到进一步使用。解冻后 ，用冰冷的丙酮固定载玻片，并用大鼠抗小鼠I-A/I-E（1:50）和抗RAT IgG-Alexa Fluor 594（1：100）染色
，或用Vectashield抗FANTIFAILD ANTIFFODE NOUPATIN（载体实验室）直接安装
。图像是在Axio Imager.M2上获取的，它具有Colibri 7 LED照明系统（Zeiss） ，并使用ImageJ V.1.52i（http://imagej.nij.gov/ij）进行分析。 　　用100 mg kg -1氯胺酮和10 mg kg -1甲基嗪腹膜固醇麻醉小鼠
，并补充3 mg kg -1 acepromazine s.c.麻醉发作后 。将动物放置并固定在加热阶段
。在麻醉期间，施用透明的vidisic carbomer凝胶润湿眼睛。后腿固定在升高的位置 ，并使用手术剪刀和镊子将覆盖黑色素瘤的皮肤脱离 。在裸露的位点上使用了一滴透明的Vidisic Carbomer凝胶作为安装培养基
。使用24×60毫米的盖玻片在腿部两侧放置两个组件性STD Putty（3M ESPE）
，并使用24×60 mm的盖玻片在果皮上轻轻按下，以使盖玻片与裸露的部位轻微接触 ，而不会在肿瘤上施加压力。果皮的完全聚合后
，将小鼠转移到两个光子显微镜下的37°C加热板上 。 　　使用蒸馏水或透明的Vidisic Carbomer凝胶作为浸入液体的浸入式液体进行成像进行成像×20/0.95目标
。使用Mai Tai DeepSee（调谐到800 nm）和Insight X3（调谐到980 nm）Ti：SA振荡器（均来自Spectra-Physics），对LSM700设置进行了激发。如下：DSRED ，980 nm激发和555 nm的二分性透射率
，在长通二分色镜检测器级联上读出荧光信号，并具有5​​87/45 nm的带通滤波器；金星 ，980 nm兴奋和520 nm二色性变速器，带有534/30 nm带通滤波器；第二次谐波一代
，800 nm激发和445 nm的二分性挠度未经过滤；具有485 nm短通滤波器的TAGBFP，800 nm激发和490 nm二科运动挠度；和EGFP ，980 nm激发
，520 nm二分性偏转和490 nm二科基传输，带有525/50 nm带通滤波器 。用Chamaeleon Ultra II TI：SA振荡器调谐到880 nm ，对三距离设置进行激发
。荧光信号用带有495 nm主二分法镜和445和445和520 nm次级二分法镜（所有长通）的双分裂检测器阵列读出：第二次谐波产生
，495 nm和445 nm二核型二分法；具有494/20 nm带通滤波器的TAGBFP，495 nm二分性偏转和445 nm二分传变量；EGFP ，495 nm二分性传输和520 nm二分色偏转
，带有514/30 nm带通滤波器；维纳斯（Venus），495 nm和520 nm的二分色传输 ，带有542/27 nm带通滤波器。非横向光电倍增管（用于所有设置中的第二锤子
，DSRED和VENUS，对于三轴设置中的EGFP和TagBFP）和高灵敏度检测器（用于tagbfp和Zeiss设置中的EGFP） 用于信号收集 。 　　通常 ，选择了353 µm2的三到四个代表性视野，X
，Y-和48至60 µm的Z范围为4 µm步长尺寸以进行数据采集。Z堆栈以60-90秒的间隔捕获，单个视频长度为15–30分钟
。使用Bitplane Imaris软件（V.8.3至9.7）进行数据分析。使用Imaris斑点函数鉴定T细胞 。使用低表面细节的表面功能鉴定出肿瘤区域
。使用表面函数高细节鉴定CD11C-Venus细胞。使用Imaris软件计算T细胞速度 。当速度小于2 µm -min -1时 ，将细胞视为逮捕
。接触持续时间被测量为T细胞质量中心与最接近CD11C细胞表面之间的距离小于8 µm。使用ImageJ V.1.52i（http://imagej.nij.gov/ij）裁剪
，安排和动画3D渲染和跟踪的快照图像 。 　　每组三个单独的肿瘤被收集并加工成单个悬浮液
。使用阳性选择试剂盒（Miltenyi）富含CD45+细胞。接下来，将单个样品用独特的totalSeq-B主题抗体B0301-B0310（1：300 ，biolegend）进行标记
，然后用荧光标记的抗体染色 。用ARIA III荧光激活的细胞分选蛋白（BD）对CD45+CD11b+ly6g-细胞进行排序
。将分离的细胞加载到10倍铬微流体控制器的一个车道上。主题标签和基因表达文库的cDNA被放大，并通过PCR添加指标 。测序是在S1墨盒的两个车道上的Illumina Novaseq上进行的 ，在配对端模式下读取长度为150 bp。计算读数深度以获取每个单元格的大约50,000个基因表达库的读数
，每个单元格读取了5,000个主题库库
。 　　使用10倍基因组铬技术生成的SCRNA-seq数据对齐并使用细胞护林员单细胞软件套件对MM10小鼠参考基因组进行对齐。从细胞游舱产生的原始，未经过滤的数据用于下游分析 。根据三个指标 ，对细胞进行质量控制：总唯一分子标识符（UMI）计数
，检测到的基因数量和每个细胞的线粒体基因计数的比例
。具体而言，将少于1,000 UMI的细胞 ，1,000个检测到的基因和超过25％的线粒体UMI被过滤掉。为了删除潜在的双线，取消了UMI计数以上40,000以上的细胞 。随后
，我们使用SOLO58用不同的标签 - 寡核核苷酸标记的样品来消除样品
。在质量控制之后，我们使用SCRAN59通过其尺寸因子对原始计数进行了归一化 ，然后进行了Log2转换。对数化和归一化计数矩阵用于下游分析 。 　　使用Scanpy Python软件包进行了归一化数据的分析
。最初
，使用scanpy.pp.highly_variable_genes选择了4,000个最大可变的基因，并使用参数为'n_top_genes = 4000'。接下来 ，使用scanpy.tl.pca使用参数为'n_comps = 50
，use_highly_variable = true，svd_solver ='arpack'的50个组件进行主组件分析 。随后 ，使用scanpy.tl.umap的UMAP进行降低
。使用R Package Singler61自动分配单细胞
，并以免疫基因组项目的转录组作为参考。通过使用运行scanpy.tl.leiden的Leiden算法进行表达曲线的聚类，以“分辨率= 1.0”来进行 。从进一步的分析中除去了少于20个细胞的簇。使用R包装桅杆中实现的栏​​模模型 ，在分类为巨噬细胞的细胞和单核细胞分类的细胞之间进行差异基因表达
。随后的基因集富集分析是使用基因集富集分析在预先依据模式下使用log2折叠变化作为排名度量的。通过计算来自MSIGDB基因集的所有基因的z评分来得出IFN评分
，每个单元格是“ hallmark_interferon_gamma_response ” 。 　　为了进行RNA速度，使用10倍铬样品的速度级工作流程生成了剪接和未剪接的RNA丰度的计数矩阵 ，其中10倍基因组学提供了MM10基因组的基因组注释文件，并从UCSC Genome Browser中获得了重复的注释文件
。随后的分析使用SCVELO62进行。将计数矩阵加载到扫描仪环境中
，与先前生成的AnnData对象合并，并使用Scvelo.pp.filter_and_normalize进行标准化 。接下来 ，计算了速度估计的矩
，估算了基因特异性速度并计算了速度图
。此外，用速度定向的边缘生成了基于分区的图抽象。 　　每个图传说中给出了统计分析和样本数（n）的数量 。Mann – Whitney U检验 ，未配对的两个尾t检验
，方差分析（ANOVA）和对数秩检验在GraphPad Prism（v.8）中进行
。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。