单个雄性H.的基因组DNA用于构建11个库，包括短插入（170 bp ，500 bp
，800 bp）和伴侣对（2 kb，5 kb ，5 kb
，10 kb，20 kb ，20 kb）库，并在Illumina Hiseq 2000测序平台上进行了测序 。总体而言
，我们获得了大约218 GB的原始序列数据（补充表1.1）
。使用默认参数使用Soapdenovo2.04（参考文献42）组装基因组。没有使用统计方法来预先确定样本量 。实验不是随机的
。在实验和结果评估中，研究人员并未对分配视而不见。 　　总共构建了19个RNA-Seq库 ，其中包括来自男性和雌性H的组合软组织（大脑
，g，肠 ，肠道
，肝脏和肌肉）的两个文库 。以及使用衬里海马（Hampocampus hippocampus ectus）的RNA（补充信息，第2节）的RNA（补充信息 ，第2节）。所有图书馆均根据制造商的说明（Illumina
，San Diego，CA ，CA
，美国）使用Illumina Truseq RNA样品制备套件制备，并使用Illumina Hiseq 2000平台进行了测序
。RNA-seq读取是使用Trinity43从头组装的 ，或映射到H。使用带有默认参数的TopHat44来基因组，然后使用内部Perl脚本进行分析 。基因在育雏袋发育不同阶段的基因的差异表达使用以前开发的方法45确定
。使用QRT – PCR验证了RNA-seq结果
，每个阶段都有五个生物学重复。所有数据均表示为平均值±平均值±标准误差，并通过单向方差分析进行评估 ，然后进行Tukey的诚实显着差异测试
，以通过多个比较来调整P值 。对于p值<0.05，结果被认为具有统计学意义
。 　　H. COME基因组的注释是使用Ensembl基因注释管道进行的 ，该管道整合了从头算基因预测和基于证据的基因模型。简而言之
，从Ensembl（版本75）下载了D. Rerio，G 。Aculeatus ，O
。Latipes
，T。Rubripes和T. nigroviridis的蛋白质序列，并使用带有参数的TBLASTN46映射到基因组中 。其次 ，使用太阳能（内部软件
，0.9.6）加入了来自BLAST的高分段对（HSP）
。第三，使用GeneWise47对齐串联段以完善基因模型。最后 ，我们滤除了基于Genewise评分的全长副本和过滤冗余对准的比对率的比对 。此外，使用H.出现成绩单（emair_transcript和male_transcript）和H. h. rectus转录本（JUV_BRAIN
，JUV_BODY，RUD_TESTIS和PROP_POUCH）来协助基因模型预测。我们使用Swiss-Prot ，Trembl
，NCBI NR数据库和KEGG数据库注释了预测的基因模型（补充表3.4）
。 　　我们使用了CAFE（2.1版），该程序用于分析最大似然框架下的基因家族扩张和收缩。基因家族是由Treefam管道和物种之间估计的差异时间作为输入而产生的 。我们使用参数“ -p 0.01 ，-r 10000
，-s”来搜索基因的出生和死亡参数（λ），计算了使用10,000个蒙特卡洛随机抽样观察到的每个基因家族的概率 ，并报告了基因家族中概率小于0.01的基因家族的出生和死亡参数
。对于H.的基因家族扩张和收缩分析。包含具有多个功能注释的序列的家族也被删除（补充表4.1和4.2） 。 　　我们从基因家族分析（补充信息
，第4.1节）中获得了4,122个直系同源基因
。使用Muscle48与默认参数对齐一对一直系同源基因的蛋白质序列。然后，我们使用Trimal（参考文献49）用参数“ -gt 0.8 –ST 0.001 –CONS 60 ”过滤了饱和位点和不良区域 。在串联比对中修剪饱和位点和不良区域后 ，使用了2,128,000个氨基酸进行系统基础分析
。修剪的蛋白质比对用作对齐相应的编码序列（CDSS）的指南。使用内部Perl脚本将CDS中的对齐蛋白和四倍变性位点分别串联为超基因 。 　　使用串联蛋白序列的RAXML版本8.1.19（参考文献50）重建系统基因树
。具体而言
，我们使用Protgammaauto参数选择了最佳氨基酸取代模型，指定斑点GAR为外组 ，并使用100个引导程序评估了结果的鲁棒性。为了比较不同物种的中性突变速率，我们还基于四倍的退化位点产生了系统发育 。系统基因拓扑用作输入
，RAXML中的“ -f e
”选项用于使用ModelEgenerator版本0.85（参考51）建议，使用四倍退化（GTR）模型下的四倍退化（GTR）模型下的四倍退化位点（GTR）模型来优化输入树的分支长度。我们使用r-package ape52中的phylo模块 ，根据中性树的优化分支长度计算了对外组（斑点GAR）的成对距离
。在McMctree Program53中实现的贝叶斯松弛分子时钟（BRMC）方法用于估计不同物种之间的差异时间。一对一源基因和系统基因拓扑的串联CD用作输入 。基于化石记录的两个校准时间点O. latipes – t
。Nigroviridis（〜96.9-15090万年前（Mya））和D. Rerio – G。Aculeatus（〜149.85–165.2 Mya）（http://www.fossilrecord.net/dateaclade/index.html）在McMctree估计中用作约束 。具体而言
，我们在计算中使用了相关的分子时钟和REV替代模型
。MCMC流程运行了5,000,000步，每5,000步进行一次采样。McMctree建议H.与Stickleback ，Nile nile Plapia
，Platyfish，Fugu和Medaka的共同祖先不同 ，约有103.8 Mya
，与白垩纪相对应 。 　　我们从NCBI下载了1,417个或基因家族成员的蛋白质序列，并将其映射到H
。使用带有“ E-Value≤1e-10”和“对齐速率≥0.5 ”的TBLASTN的基因组。太阳能（内部软件 ，0.9.6版）用于在每对蛋白质映射结果之间连接高分段对（HSP） 。我们保留了一比对
，对齐速率超过70％，映射身份超过40％
。随后 ，将蛋白质序列映射到基因组上，并在上游和下游扩展280 bp
，以定义整合的基因模型。为了进行系统发育分析，使用肌肉对齐蛋白质序列 ，并使用PHYML将JTT+Gamma模型对齐用于最大样本分析
，以构建系统发育树 。 　　使用Vista的H. Come，Stickleback ，Fugu和斑马鱼的TBX2B-TBX4-BRIP1区域的同步分析表明
，H。tbx4丢失了
。（图3）。为了排除H. Come基因组序列中TBX4缺乏的情况是由于组装误差造成的，我们首先验证了H. H. TBX2B-TBX4-BRIP1区域的微同步区域 。简而言之 ，设计了28个引物对（补充表9.1）
，用于重叠放大器，从TBX2B的末端“步行
”到BRIP1的开始
。这些产品的扩增子大小和部分末端测序并未表明H组装中的任何异常。 　　此外 ，我们进行了以下分析：（1）使用来自斑马鱼和尼罗尼非非非鱼的TBX4蛋白搜索了H. COME基因组（TBLASTN）
，并且无法找到TBX4基因；（2）仅使用TBX4蛋白的域序列搜索H.基因组，但无法找到TBX4基因；（3）使用斑马鱼和尼罗尼非非非鱼的TBX4蛋白进行TBX4（TBLASTN）的H. come和H. h. h. h. h. h. h. come come come come and come come and tbx4（tblastn） ，但无法找到任何匹配的转录本；（4）搜索H. Come和H. h. h. h. h. hictus转录组数据也具有域序列，并且没有找到tbx4基因的残余；（5）H 。的“幽灵” TBX4基因座中预测CNE
。使用Fugu TBX4 locus作为参考（基础）（补充图9.3）。我们使用了其他鱼类基因组基因座中存在的CNE（在H. Come中不存在）来搜索H.来源基因组来排除它们可能存在于基因组中其他地方的可能性 。我们在H中找不到这些CNE中的任何一个
。最后
，我们进行了退化的PCR实验，以确定H中是否缺少TBX4基因。使用四个前向和两个反向引物（补充表9.1） ，我们检查了在七种海马物种中是否存在TBX4（包括H. comes和H. rectus）
，五种pipefish（四种来自Syngnathus属，一种来自Corythoichthys属的种类 ，来自Corythoichthys）（全部来自Syngnathidae Fins syngnathidae fins pelvic pelvic fins）;Ghost Pipefish（solenostomus）和小号鱼（Aulostomidae）与Syngnathidae密切相关
，但具有骨盆鳍 。还有其他具有骨盆鳍的硬骨鱼类（补充图9.1和9.2）
。 　　我们使用CRISPR -CAS9策略来生成TBX4突变斑马鱼线。设计了两个引导RNA（GRNA），靶向斑马鱼TBX4在序列的5'端 ，该序列的上游或DNA结合Tbox域内的上游或内部（补充图9.4） 。如先前所述54（补充表9.2中给出的寡核苷酸序列）
，使用合成的寡核苷酸克隆到PT7GRNA载体中。使用Megascript T7转录试剂盒（Thermo Fischer Scientific AM1334）抄录，使用Mirvana miRNA隔离套件（Thermo Fischer Scientific AM1560）纯化了使用Megascript T7转录试剂盒（Thermo Fischer Scientific AM1334）抄录的BAMH1-HF（NEB R3136T）后 ，从该载体（NEB R3136T）线性化后从该载体合成GRNA
。使用MMACHINE SP6转录试剂盒（Thermo Fischer Scientific AM1340）从CS2+Cas9载体合成Cas9 mRNA
，并使用RNAeasy Mini Kit（Qiagen 74104）的RNA清理方案纯化。 　　在野生捕获菌株的斑马鱼中被注射，在一个左右的grna和〜90 ng cas9 RNA的单阶段 。将这些F0鱼饲养至成熟 ，并使用跨靶位点的FIN剪辑，DNA分离和PCR进行基因分型（补充表9.2中给出的基因分型引物）
。使用T7核酸内切酶（NEB M0302L）分析了PCR产物的突变54。将镶嵌突变体F0鱼量入到AB野生型鱼中
，并使用PCR和T7核酸内切酶进行批处理基因分型以传播突变 。将突变的PCR产物克隆到PGEM-T载体（Promega，Madison ，WI）中
，并测序以鉴定载体鱼传输移码突变
。这些载体鱼再次被越过AB野生型，并将所得的F1鱼饲养至成熟。使用FIN剪辑 ，DNA分离
，PCR，T7核酸内切酶进行基因分型 ，以鉴定杂合突变鱼
，然后通过克隆和测序突变PCR产物进行测序，以证明存在Fameshift等位基因的存在 。CRISPR – CAS9突变策略在扩展数据中示意性地显示了图5
。 　　在F0突变体TBX4鱼中 ，我们观察到低频下的骨盆鳍损失。GRNA＃1给出了3/42 FISH
，具有双侧或单面骨盆鳍损失，而1/34的GRNA＃2具有单侧骨盆鳍损失（扩展数据图5） 。我们观察到GRNA＃1和GRNA＃2的突变等位基因传播 ，但未能识别导致GRNA＃2的移码突变的缺失，因此该CRISPR没有生成稳定的线
。对于GRNA＃1
，我们确定了几个移码突变体，其中一个进一步分析。该突变体具有缺失/替代突变 ，其中八个核苷酸被三个核苷酸代替
，导致有效的5 bp缺失并引入了移码突变（扩展数据图5） 。该突变引入了下游终止密码子，导致缺乏DNA结合结构域的严重截断的蛋白质（补充图9.4和9.5）。突变线保持在AB野生型背景上
。 　　使用斑马鱼作为参考基因组 ，产生了六种硬骨鱼的全基因组比对。斑马鱼（ZV9
，2010年4月）的软膜基因组序列是从Ensembl Release-75 FTP网站下载的 。从UCSC基因组浏览器：Stickleback（2006年2月，FR3 ，2011年10月
，2011年10月），Medaka（2005年10月2日 ，2005年10月2日）
，Nile Tilapia（Orenil2，2012年2月2日） ，从UCSC基因组浏览器：Stickleback（Gasacu1，2006年2月）下载了以下软掩盖的基因组序列
。使用WindowMasker（来自NCBI BLAST+软件包v.2.2.28）重复屏蔽H. CAME基因组序列（HIPCOM0）
，并带有附加参数“ -dust true ”。使用此方法将大约32％（158.1/501.6 Mb）掩盖了基因组 。 　　仅排除斑马鱼的染色体序列，而排除了脚手架
。参考（斑马鱼）基因组分为21 MB序列 ，其重叠为10-kb
，而percomorph鱼类基因组（H. Come，Stickleback ，Fugu
，Medaka，Medaka和Nile Tilapia）分为10 MB序列 ，没有重叠。使用Lastz V.1.03.54（参考55）进行成对对齐
，并具有以下参数：–Strand =两种种子= 12of19 – Notransition – Notantion – gappation -gap = 400,30 – hspthresh = 3000 – gappedThresh = 3000 – Inner = 2000 -inner = 2000 – amasking = 50 – ydrop = 9400 – ydrop = 9400 – scores = hoxd55.q – format = axt = axt = axt 。使用内部PERL脚本将分裂序列的坐标恢复为基因组坐标
。使用UCSC基因组浏览器工具“ AXTCHAIN”和“ CHAINNET
”，将比对减少为参考基因组的单个覆盖范围。使用Multiz.v11.2/hover.v3（Ref 。56）产生多个比对 ，并带有树拓扑“（ZV9（hipcom0（（fr3 gasacu1）（oryylat2 orenil2））））”
。 　　从多个比对中提取了斑马鱼基因的四倍（4D）位点（Ensembl Release-75）。这些4D位点用于使用Rphast v.1.5 Package57（一般可逆的“ Rev ”替代模型）中的Thylofit构建中性模型 。然后
，在每个斑马鱼染色体比对上以Rho估计模式运行Phastcons，以获得每个染色体的保守模型。这些保守的模型使用Phyloboot平均为一个模型
。随后 ，使用具有以下输入和参数的PHASTCON在多个比对中预测了保守的元素：中性和保守的模型，输入对准的目标覆盖= 0.3 = 0.3和保守序列的平均长度= 45 bp。为了评估这种方法在识别功能元件中的敏感性
，将Phastcons元素与斑马鱼蛋白编码基因进行了比较 。80％的蛋白质编码外显子（197,508/245,556外显子）被保守元件（最小覆盖率10％）重叠，表明该识别方法相当敏感
。 　　如果CNE在percomorph基因组中显示出一个CNE ，如果它显示出至少30％的斑马鱼CNE
，则在多斑马cne中显示出覆盖范围。为了识别由于基因组的重排或由于Teleost Fish重复基因分配CNE而导致的多量对齐中可能错过的CNE，我们使用BlastN搜索了斑马鱼CNES ，使用BlastN的基因组（E <1×10-10; <1×10-10;≥80％的身份;≥30％覆盖） 。那些在Percomorph基因组中没有显着匹配的CNE被认为是该基因组中缺少的
。为了说明可能因测序差距而丢失的CNE
，我们确定了斑马鱼和Percomorph基因组中无差距的同步间隔，并产生了一组从这些间隔中缺少的CNE。这些CNE代表了Percomorph鱼类中缺失的一组CNES ，因此被用于进一步分析 。使用Great Software58进行了与CNE相关的基因的功能富集
，每个CNE分配给具有最近转录起始位点的基因，在斑马鱼基因组中的1 MB之内 ，并根据基因组区域的A超测试（False Discovery速率（FDR）Q值<0.05）识别出明显富集的功能类别
。我们确定了与CNE相关的基因的统计学意义基因本体论生物学过程项
，分子功能项和斑马鱼表型描述。 　　我们还使用全球对齐计划姆拉根（Mlagan）预测了H. Come和其他代表性的硬骨鱼类中的CNE 。使用Mlagan与斑马鱼对齐直系同源的HOX簇作为参考序列，并使用VISTA预测CNE
。 　　在H中丢失的七个代表性斑马鱼CNE（在丢失的CNE中最大）被用GFP作为记者基因而在转基因斑马鱼中提高活性。使用斑马鱼基因组DNA作为模板通过PCR扩增CNE 。将产物克隆到与小鼠CFO（MCFOS）基底启动子和GFP的编码序列相关的Minitol2转座子供体质粒中。转座酶mRNA是通过使用MMESSAGE MMACHINE T7试剂盒（Ambion; Life Technologies）在体外转录cDNA来产生的
。将含有CNE的MCFOS-MINITOL2构建体和转座酶mRNA共同注入斑马鱼胚胎的蛋黄 ，这是一个至两个细胞的阶段。每个CNE构建体被注入250-350个胚胎，并在两天内重复注射 。在28°C下饲养胚胎
，并在24、48和72小时（HPF）观察到GFP
。注射后胚胎的存活率为70-80％。在至少20％的F0胚胎中，一致的GFP表达被认为是由CNE驱动的特定表达 。将这种胚胎饲养至成熟度 ，并与野生型斑马鱼交配以产生F1线
。在拟合具有落膜的化合物显微镜下观察到GFP在F1胚胎中的表达（Axio Imager M2； Carl Zeiss
，Germany），并使用连接的数字显微镜摄像头（AxioCam; Carl Zeiss ，德国）拍摄。通过将斑马鱼胚胎保持在0.003％N-苯基硫脲（Sigma-Aldrich
，瑞典）中，可以抑制色素沉着 。在至少三条F1鱼类中观察到的一致的GFP表达被认为是由CNE驱动的特定表达
。 　　所有动物均严格按照美国国立卫生研究院（美国）指南进行护理。斑马鱼基因敲除方案得到了Sun Yat-Sen University的机构动物护理和使用委员会的批准 。斑马鱼转基因测定方案得到了新加坡一A*星的生物资源中心的机构动物护理和使用委员会的批准
。 　　老虎尾海马（H。H. h. h. to and H.的RNA-seq读取分别沉积在登录号下的NCBI序列读取存档中 ，分别为SRA392578和SRA392580 。