为了测试SUP-TRNA的读取效率 ，我们使用了两种不同的构建体。首先，一个含有三肽基肽酶1基因（密码子201-215）的双萤火虫荧光素酶 - 肾小球荧光素酶（FLUC-RLUC）报告基因（FlucR208x-rluc）下游 。与常染色体隐性进行性溶酶体疾病
，晚期婴儿神经蛋白粘膜脂肪促脂肪促性脂肪促性脂肪促性促进性溶酶体疾病相关的三肽基肽酶1（TPP1）基因（CLN2）。作为对照，当使用带有SER的TSA1T5抑制器时 ，我们用编码AGC密码子编码ser ser flucr208S-ruc替换了FlucR208X-RLUC中的UGA PTC
。RLUC的表达由Coxsackievivirus B3内部核糖体进入位点控制。其次
，将以相应PTC突变为中心的不同疾病相关基因（补充表2）插入15个密码子（45 nt）（补充表2），直接在5'UC2 CDS的PGL4.51（Promega）中 ，直接在AUG Start Codon之后
，产生PTC-Fluc Variants 。 　　对于体内实验，合成了Akaluciferase Gene44（ALUC）（aluc） ，并将其克隆到PARM237945中
。ALUC的编码序列（CD）通过15个以疾病相关的PTC为中心的15个密码子（在ALUC ATG开始密码子之后）扩展了5'上游（ALUC ATG起始密码子之后）
，例如人三肽肽酶1基因TPP1的R208X（密码子位置201-215）（补充表2）。将R208突变为R208X（UGA，UAG或UAA） ，以模仿人PTC（ALUCR208X）或R208S（ALUCR208S）
，以用作阳性对照 。对于内部实验，将人类CFTR基因的TPP1和S466X R208X和S466X（密码子位置459-473）的15个密码子融合为抗逆转基因 ，产生FLUCR208X和FLUCS466X
。S466被突变为UAA，UAG或UGA。 　　CRE基因46在其5'端与SV40大型T-抗原核定位信号（氨基酸序列PKKKRKV）延伸以促进重组效率47 。基于PCR的诱变和GBBLOCK（Integrated DNA技术）基于PCR的诱变和从头基因合成
，在位置Ser69和Ser82位置的胡说八道突变引入
。 　　HEP3B（HB-8064）和HEPA1-6（CRL-1830）细胞系从ATCC获得。将Cre-loxP报告基因集成在HEK293T（CRL-3216）细胞中（由R. trelles生成） 。永生的囊性纤维化支气管上皮细胞系CFBE41O-（由D. gruenert生成）不使用等位基因CFTR表达表达CFTR变体的异位表达
。在稳定表达CFTRR553X，CFTRR1162X或野生型CFTR的Fischer大鼠甲状腺（FRT）细胞中测量旋转的离子转运。 　　16HBE14O-细胞 ，即表达野生型CFTR的人支气管上皮细胞（包括所有内含子；由D. gruenert产生的） 。使用CRISPR – CAS9在内源性CFTR基因座进行基因编辑16HBE14O-细胞
，从而创建等源性16HBEGE CFTRR553X/ - 和CFTRR1162X/ - 细胞系49。两种16HBEGE细胞系均从囊性纤维化基金会治疗实验室获得
。 　　用囊性纤维化的个体的鼻刷收集原代HNE细胞，该细胞是CFTRR1162X纯合子的 ，并从囊性纤维化基金会疗法实验室中获得。 　　在HEK293XL-TLR7或HEK293XL-TLR8细胞（Invivogen）中监测IL-8响应 。将细胞在低通道数下等分
，并存储在液氮中
。使用基于Venor GEM PCR的检测试剂盒（Merck）定期测试细胞对支原体污染的测试。 　　在IsoAcceptor中，trnaseruga/trnaseraga ，trnaargucu和trnaglyucc分别将反密码子交换为UCA产生TS
，TR和TG（补充表1） 。先前的研究表明，在tRNA家族中 ，这些同感受体（例如Trnaser（AGA）和Trnaser（UGA）
，TRNAARG（UCU）和TRNAGLY（UCC）4）是在其本地抗多子量管dododododododododododododododododododododododododododododod codoon之后具有最高读数的人之一
。 　　对于TψC-STEM TRNA变体（Ti变体），我们估计了与EEF1A结合亲和力的ΔΔG°值 ，考虑到三个TψC-STEM基碱基对49-65、50-64和51-63的累积贡献（图1A，右下）。真核（EEF1A）和细菌（EF-TU）伸长因子共享氨基酰基-TRNA结合50的保守位点
，因此，从细菌EF-TU-TU-TU-TUNNAPHE复合物中获取了每个核苷酸对的ΔΔG°值23,51 。 　　反密码子茎和反火登环都与反火顿共同发展 ，以确保忠实的解码
。为了增加解码
，在天然sup-trnas52中，在核苷酸位置31和39处首选U – A或A-a对 ，因此
，我们在A1变体中考虑了它们（图1A和扩展数据图1）。在A2变体中，抗多肺茎取自TRNASEC 。保留了身份元素（即通过氨基酰基-TRNA合成酶识别为氨基酰胺tRNA所识别的核苷酸
。例如 ，在trnaser家族中
，歧视剂g73和V-region53作为身份元素，在trnaarg家族中 ，它们是g73
，a20和c35 – u/g36，在trnagly家族中 ，它们是a73，c2 – g7153。 　　在永生的细胞培养模型
，患者衍生的原代细胞和体内，使用体外转录的tRNA变体用于共转染 。 　　如所述 ，使用T7转录系统在体外转录TRNA。简而言之
，使用上游T7启动子（5'-Taatacgactcactata-3'）编码相应的tRNA序列的两个部分重叠的DNA寡核苷酸用于体外TRNA合成
。将两种寡核苷酸的24μM溶液在95°C下固定2分钟，然后在室温下以20 mm Tris-HCl（pH 7.5）（pH 7.5）和0.4 mM DNTP在室温下排列3分钟 ，并添加0.4 mM DNTP
，并与4Uμl-1恢复反向转录酶（热渔夫科学）孵育40分钟，为40分钟。使用苯酚/氯仿纯化该DsDNA模板 ，用80％乙醇洗涤
，并重悬于DEPC处理的水中 。另外，通过PCR反应在TSA1T5表达TSA1T5的质粒上通过前向启动子的上游退火和反向引物（5'-TGGCGTAGTCGACGGGATTC-3'） ，并以前两个两个核代替前两个核代替的2'-O-methyl修饰
，制备DSDNA模板
。对于体外T7转录，将2 mM NTP ，5 mM GMP，1倍转录缓冲液
，0.6UμL -1 T7 RNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific）添加到DSDNA模板中，并在37°C下孵育过夜。通过制备变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）来解决tRNA变体 ，并在乙酸钾50 mm
，在4°C下过夜200 mM KCl pH 7.0过夜，然后在DEPC培养的水中乙醇沉淀和重新悬浮 。 　　在与上述相似的条件下 ，通过T7 RNA聚合酶从线性化质粒中转录体内递送的TRNA
，并如前所述21,45纯化
。纯化的TRNA的完整性通过甲苯胺蓝色染色（0.4％（w/v））监测，在10％变性的Tbe-rea凝胶（Thermo Fisher Scientific）中。 　　为了生成用于体内实验的高质量mRNA转录本或用于在细胞系统中进行体外转录的tRNA和mRNA的共转移 ，我们采用了先前描述的方法为1,45 。通过二氧化硅柱（Macherey-Nagel）纯化mRNA转录本
。双重FLUCR208X-RLUC mRNA用未修饰的核苷酸在体外转录
，而AluCr208X和CRE mRNA与完全用N1-甲基丙氨酸取代的UTP合成。通过紫外吸光度及其纯度（全长％）和通过片段分析仪（Agilent）验证的纯度mRNA 。将转录物存储在-60°C以下的无RNase水中，直到体外转染或用LNP进行体内给药的配方
。 　　将HEP3B ，HEPA1-6或CFBE41O-细胞以每孔为1×104个细胞在96孔细胞培养板中播种
，并在Dulbecco的修改的必需培养基（DMEM，PAN BIOTECH或GIBCO）中生长 ，用于HEPA1-6或HEPA1-6或最小介质（MEM，PAN BIOTECH）
，用于CFBEBBE-BBE41O-6。所有培养基都含有10％的胎牛血清（FBS，PAN Biotech）补充 ，并且CFBE41O-细胞的培养基还补充了2 mM-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific） 。16到二十四小时后
，HEP3B或CFBE41O-细胞与25 ng PTC-FLUC或野生型FLUC质粒一式三份，分别使用LipoFofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific）一式三份或野生型FLUC质粒或100 ng的野生型FLUC质粒和100 ng。4-6小时后 ，将培养基替换
，转染细胞后24小时用1×无源裂解缓冲液（Promega）裂解，并用荧光素酶测定系统（Promega）和Spark Microplate读取器（Tecan）测量的荧光素酶活性
。将G418以25 µg mL -1的浓度添加到细胞中 ，并孵育24小时。 　　播种后24小时
，将HEPA1-6细胞用3个体外转录的记者mRNA（FLUCR208X-RLUC，FLUCR208S-RLUC或FLUCR208-RLUC）与50 ng的体外transcranscircrax pernna一起转染 。对于体外剂量反应实验（扩展数据图4） ，将50–0.78 ng的体外转录tRNA连续稀释
，并通过双重稀释，并与记者mRNA（12.5 ng）共转染到每个孔中
。为了在不同剂量的PTC配对tRNA上实现类似的转染效率 ，一种不与UGA PTC配对的体外转录的不匹配tRNA被用作填充剂，因此总是共同转染每个孔的总tRNA 50 ng。将细胞在37°C孵育过夜
，用PBS冲洗，并通过将20 µL添加20 µL的1倍无源裂解缓冲液（Promega）收集 。在Spark Microplate读取器（TECAN）上 ，在10 µL裂解液中测量了荧光素酶活性
。 　　CFBE41O-细胞用体外转录的SUP-TRNA转染
，浓度为4,000至7.81 ng，并通过两倍逐渐稀释 ，如上所述。根据制造商的说明
，使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定（Promega）确定细胞活力 。 　　人类TLR转换的HEK293细胞是一个已建立的系统，用于分析tRNA诱导的人类TLR7和TLR8的刺激 ，并按照28所述监测IL-8响应
。简而言之
，将用HTLR7和HTLR8（Invivogen）稳定转染的HEK293XL细胞在96孔细胞培养板中以每个井的5×104细胞播种，并在DMEM（PAN Biotech）中培养 ，并补充了10％FBS（PAN Biotech）和2 mm -glutamine（Pan Biotech）。二十四小时后
，将细胞用体外转录的TSA2T5（1 µg ML-1）或Resiquimod（R848; Invivogen，1 µg ML-1）作为对照激活剂 ，作为TLR7 – TLR8信号通路的对照激活剂，使用Lipofectin（Lipofectin（Lipofectin）（使用Lipofectin（Healto Fisherecic）） 。3小时后
，更换培养基，转移后16小时 ，根据制造商的说明
，使用人IL-8 ELISA KIT II（BD Biosciences）测量上清液中的白介素IL-8
。 　　将HEPA1-6细胞以每道菜为1×106细胞在两个10厘米的菜肴中播种。播种后十六至二十四小时，使用Messengermax（Thermo Fishersenfific） ，将细胞与2 µg在体外转录的双重FLUCR208X-RLUC mRNA或双FLUCR208-RLUC和4 µg体外转录的TSA1T5中共转染 。将细胞在37°C孵育过夜
，并通过胰蛋白酶吸收收集。模拟转染的细胞用作阴性对照
。用PBS用PBS冲洗四次，并用Jade Bio用2D Nano PRM液相色谱 - tandem质谱法（LC -MS/MS）进行分析。 　　使用Arcturus Therapeutics的专有脂质纳米颗粒技术平台Lunar生产LNP 。如先前所述21,56
。使用微流体装置将溶解在所需比例的乙醇中的适当体积的脂质与含有RNA的水相混合 ，然后进行下游加工。为了封装RNA
，将2 mg ML -1 RNA溶解在5 mM柠檬酸盐缓冲液中（pH 3.5） 。The molar percentage ratio for the constituent lipids is 50% ionizable amino lipids, 7% 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (Avanti Polar Lipids), 41.5% cholesterol (Avanti Polar Lipids), and 1.5% 1,2-dimyristoyl-sn-glycerol, methoxypolyethylene glycol（聚乙烯乙二醇链分子质量：2,000）（美国NOF）
。以1：3乙醇的流比：水相，将溶液组合在微流体装置中。总脂质与RNA的重量比为25：1（Lunar1）或15：1（Lunar2） 。然后将混合材料用含有50 mM NaCl和9％蔗糖的Tris缓冲液（pH 7.5）稀释3次 ，在离开Micromixer出口后
，将乙醇含量降至6.25％
。浓缩稀释的LNP配方，并使用空心纤维膜（MPES KROS膜 ，Repligen）和含有50 mM NaCl和9％蔗糖去除乙醇的空心纤维膜（MPES KROS膜，Repligen）和Tris Buffer（pH 7.5）浓缩。使用Zen3600（Malvern Instruments
，带有Zetasizer 7.1软件）来表征粒度和多分散指数（PDI） 。通过确定未包膜的RNA含量来计算封装效率，通过测量在LNP中添加Ribogreen（分子探针）后测量荧光强度（FI） ，并将该值与LNP在1％Triton X-10中溶解后获得的RNA含量的总荧光强度（ft）进行比较
。百分比封装是通过比率（ft -fi）/ft×100％计算的。所有LNP均与> 90％的封装效率有关 。 　　所有小鼠均为养育
，并在研究开始时进行实验性幼稚。选择小鼠以对照或实验条件的方式随机治疗而不会盲目
。在无病原体环境中，在创新的IVC啮齿动物笼系统中 ，在无病原体环境中
，小鼠在温度为12 h，温度在19-22°C且湿度为50-60％的情况下 ，在无病原体环境中容纳5小鼠。在整个研究期间
，都使用了多余的获得标准饮食（2018，来自Envigo ++++的全球18％蛋白啮齿动物饮食）和预填充的酸水（pH 2.5-3.0） 。床上用品是硬木芯片（Sani-Chips ，7115
，Envigo ++++）和笼子每两周更换
。根据机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的动物使用方案和政策（EB17-004-003，2017年2月1日 ，以及2021年6月17日的最新修订），在Arcturus Therapeutics进行了所有涉及动物的体内程序。Vivarium由AAALAC认可的供应商Explora Biolabs（Charles River Company）管理 。 　　静脉内给药和体内成像：8-10周大的雌性BALB/C小鼠购自Charles River Laboratories
。LUNAR1制剂在0.6和二十五个小时
，在0.9或1.5 mg kg-1（即0.3 mg kg-kg-1荧光素酶mRNA和0.6或1.2 mg kg-1 sup-trna）。剂量后六和二十五小时将15 mg ml -1）以每只小鼠的100 µL腹膜内注射，然后体内成像 。发光LUC底物进行十分钟后 ，使用IVIS Lumina III（Perkin Elmer）对用2％异氟烷（Perkin Elmer）进行活性动物生物发光成像
。使用Living Image软件（Perkin Elmer）
，通过关注区域的关注区域对图像进行量化。总共将33只小鼠接受静脉内施用 。同一年龄组内的天真动物分层为不同的治疗组；动物被随机分配给组
。没有使用统计检验来预先确定样本量。用Lunar1与体外转录的LUCR208X mRNA共同成型，并以两种不同的浓度（每例构成三只小鼠）进行体外转录的TS 。将六只小鼠用LUNAR1与没有PTC（LUCR208S）的mRNA合作 ，在两个不同的浓度（每个组成三只小鼠）以Ts进行了形成。将另一只六只小鼠的队列与LUNAR1一起与体外转录的LUCR208X mRNA共同形成
，并以两种不同的浓度（每只小鼠组为三只小鼠）在体外转录的TSA1T5
。将六只小鼠用LUNAR1与没有PTC（LUCR208S）和TSA1T5共同形成的LUNAR1在两种不同的浓度（每个组为三只小鼠）下。另一只六只小鼠Lunar1与体外转录的LUCR208X mRNA共同形成，并在两种不同的浓度（每例组成三只小鼠）中与UGA PTC配对 ，并在体外转录的不匹配tRNA与UGA PTC配对 。 被管理
。用PBS处理三只小鼠
，并作为阴性对照。 　　气管内管理：六到十周龄的女性B6.CG-GT（ROSA）26SortM14（CAG-TDTOMATO）HZE/J小鼠购自Jackson Laboratories 。通过气管内灌输在用2％异氟烷解析的小鼠中，使用27g×1英寸的钝针（B27-100 ，SAI
，SAI）在0.35 mg kg-1中用于野生型CRE mRNA或0.7 mg kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-in的27g kg kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-1英尺，并在0.7 mg kg-kg中 ，使用27g×1英寸的钝针（B27-100，SAI）
，从而给予LUNAR2制剂
。TSA1T5（每个0.35 mg kg -1）;在第0天和第2天（总共两剂）给出了每只鼠标50 µL。最后一个剂量后48个小时，收集了来自麻醉小鼠的肺并用10％中性缓冲福尔马林（NBF）拆除 。然后在处理免疫组织化学之前将肺固定在10％NBF中过夜
。总共将24只小鼠接受了气管内施用 ，并将动物随机分配给组。没有使用统计检验来预先确定样本量 。用Lunar2与PTC-CRE mRNA和TSA1T5与抗反激体配对一起对四只小鼠进行了加工
，四个与PTC-CRE mRNA和不匹配的TSA1T5与抗反应配对与UAG配对的LUNAR2与lunar2与lunar2仅与ward-cre mrna，四个cre mrna ，lunar cor form co co croce cor tsa1t5一起成型
。只有四个接受PBS作为阴性对照。 　　切片在5 µm处切片
，将脱瓦并在抗原检索过程中再保水为蒸馏水 。将切片与Trueblack脂肪霉素自动荧光淬火剂（生物植物）一起孵育1分钟，在PBS中洗涤 ，并阻塞以抑制非特异性抗体
，如果背景抑制系统（Biotium），则使用TrueBlack使用TrueBlack。将切片与一级兔多克隆RFP抗体（稀释1：800; 600-401-379 ，Rockland抗体）
，小鼠单克隆FOXJ1抗体（稀释1：1,000; 14-9965-82稀释），Thermo Fisher Scientific）或Rabbit多克隆Muc 5b抗体（Thermo Fisher ScientificFisher Scientific）在4°C下过夜
。M.O.M.试剂盒（矢量 ，BMK-2002）用于删除任何鼠标鼠标的IG干扰。在PBS洗涤后，将驴抗小鼠AF488（A-21202
，Thermo Fisher Scientific）或驴抗兔AF555（A-21428，Thermo Fisher Scientific）二级抗体与载玻片一起孵育1小时 。随后将载玻片在DAPI中进行了反染色 ，并用Vectashield Fibrance Antiffade安装介质（H-1700
，矢量实验室）安装
。 　　Cre重组酶依赖性EGFP的稳定表达系统是通过将HEK293T细胞与PLV-CMV-LOXP-DSRED-LOXP-EGFP57（J. Rheenen的礼物）转染HEK293T细胞建立的，并在Broad Institute遗传性扰动平台的方案后选择了普霉素。通过EVOS细胞成像系统（Thermo Fisher Scientific）缺乏EGFP证实所选细胞 。将细胞以每孔为1.6×104个细胞在96孔板中播种 ，并在24小时后用体外转录的CRE mRNA（12.5 ng）和体外转录的TS变体（25 ng）将其播种到不同的PTC（TS :: :: :: ga
，TS :: uga，ts :: uag; ts per per ersemens）
。转染后四天内每天都记录在火花微孔读取器（TECAN）上的荧光 ，并报告为相对荧光单元。通过EVOS细胞成像系统（Thermo Fisher Scientific）可视化DSRED和EGFP的表达 。 　　将HNE（R1162X/R1162X）细胞播种在涂有胶原蛋白IV（Sigma）或Purecol（Advanced Biomatrix）的T75烧瓶中
，在5％CO2中37°C下的12 mL预热的完整Pneumacult Ali Ex+培养基（Steamcell Kit）
。至500 ml培养基添加以下补充剂：0.5 ml氢化可的松（Stemcell），10 ml 50x Ex+补充剂（Stemcell Kit） ，对于某些制剂
，2 mL两性霉素B（12.5 µg mL -1; Sigma），500 µl Ceftazidime（500 µl Ceftazidime（100 mg ml -l -1; sig Ml -1; sigmma） ，500000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 lANT。（100 mg ml -1; Sigma）和500 µl毒素（100 mg ml -1; Sigma） 。将细胞膨胀3-5天，直到达到70-80％的汇合
。 　　然后通过0.05％胰蛋白酶-EDTA（PAN Biotech）或酶（Stemcell）处理细胞
，并在12或24-ALI移植（0.4 µm孔多乙二醇terephtalate膜膜插入术中，在1.5×105×105×105×105×105×105 coluagen coluence）上（0.4-µm孔多乙二醇terephtatalate terephtatalate terephtatalate膜插入）如下添加了0.5-0.6 mL（基底外侧）和〜0.5 mL（顶）。用5％CO2在37°C下生长细胞3-4天 。每天在顶端和基底外侧改变培养基。在第4天 ，除去顶部培养基
，并换了基底外侧浴溶液，换了ALI完整培养基（Stemcell） ，然后每周3次额外交换至少21天
，直到达到完全差异化的状态
。 　　CFBE41O-细胞，16HBEGE CFTRR1162X/ - 或16HBE41O -CFTRWT细胞以每个井的1×105细胞在12孔细胞培养板上播种 ，并在最小必需培养基（MEM
，PAN BIOTECH）中培养，并补充了10％FBS（PAN BIBOTECH）和2 MM -GLUTICIC FIELLICIC FIELLICIC FIELLICIC FIELLICIC FIELLICIC FIELLICIC fishericatific fishericatiencient。另外还补充了1％的1％青霉素/链霉素（Gibco）的培养基 ，并将培养板涂上1％人纤连蛋白（Thermo Fisher Scientific）
，1％牛胶原I型（晚期Biomatrix），1％牛bovine Serum Cholim（Gibco） 。播种后24小时 ，CFBE41O-细胞与400-500 ng PTC-CFTR（S466X，R553X或R1162X变体）或野生型CFTR质粒和800-1,000 ng ptrna trna intra variant（使用Lipofectic variant 3000（热）3000（热）
。在NMD抑制剂（带有反转录的免疫印迹和定量PCR（RT – QPCR）分析）的实验中
，用5 µM NMD14（Medchemexpress）（Medchemexpress）预先治疗16HBEGE细胞24 h，然后使用800 ng flysecripted trna valetiant lipofofienation lipofofigication 3000（lipofigicals）进行转染。转染4-6小时后 ，替换培养基并再生长24小时 。 　　使用Lipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific）
，从具有800-1,000 ng的体外转录tRNA（TRT5或不匹配tRNA）的单层的顶部表面转染了良好分化的HNE（R1162X/R1162X）细胞（见上文）
。6小时后，将新鲜培养基交换并在接下来的24小时内孵育细胞。通过与荧光蛋白共转染估计 ，用脂肪系胺的转染效率约为18–20％ 。在NMD抑制剂（NMD14或SMG158,59）的实验中
，在基底外侧添加了药物
。添加NMD抑制剂后六个小时，从具有体外转录的tRNA的单层的顶部表面转染了细胞 ，同时继续使用NMD抑制剂进行治疗。额外6小时（用NMD14或SMG1的总处理为12小时）后
，将培养基替换，并再生长24小时 。我们将SMG1浓度基准为0.5 µm ，以使mRNA稳定在5 µm时与NMD14相当
。两种抑制剂用于排除抑制剂特异性效应。应该注意的是
，16HBEGE细胞对NMD处理是可靠的，而供体衍生的HNES在使用NMD14或SMG1进行扩展治疗后的生存力变化 ，因此，NMD治疗不应超过12-15 h 。 　　细胞（CFBE41O-细胞
，16HBEGE CFTRR1162X/ - ，16HBE41O- CFTRWT或HNE CFTRR1162X/R1162X）用tRNA或模拟治疗转染 ，然后用80 µl mnt MNT Fasher（10××; 300 mM tris tris pH pH pH per totna或模拟治疗）被裂解通过单克隆CFTR-NBD2抗体（1：100稀释
，596，J。R
。Riordan和T. Jensen）进行免疫印迹 ，可通过囊性纤维化基金会疗法抗体分布程序提供。如前所述
，分析利用毛细血管电泳系统（JES，蛋白质）60 。用JESS定量模块和分子量标记物（180 kDa峰）对应于完全糖基化的CFTR（带C）的峰面积（频带C）标准化 ，以最大程度地减少多个JESS运行之间的波动
。请注意
，由于Lipofectamine的轻微不利影响，被模拟转染的细胞（用脂肪系胺处理的细胞）被用作对照。在最终浓度为10 µm和30 µm的最终浓度下添加ataluren（PTC124） ，并孵育24小时 。 　　使用RT – QPCR测量了用体外转录的tRNA变体（1,000 ng）或NMD抑制剂（5 µM）转染的CFTR变体的稳态mRNA表达
。细胞的生长并以与上述用于免疫印迹分析的方式相同
，但是为了捕获mRNA表达，在TRNA转染后6小时裂解细胞（分别用NMD14和TRNA的总处理分别为12 h和6 h）。使用Trizol（Invitrogen）分离总RNA 。使用随机六聚体（Thermo Fisher Scientific）和还原逆转录酶（Thermo Fisher Scientific）在20 µL总体积中对2 µg总RNA进行反转录
。使用t专业热环（Biometra）上的Sensimix Sybr Hi-Rox试剂盒（Thermo Fisher Scientific）进行定量PCR。CFTR转录物的跨越外显子23- exon 24（CFTR mRNA中的核苷酸3874–4001）的区域用以下引物对：前向5'-gatcgatgtgtgtgtgtgtgtcttggga-3'和反向5'-tccactgttcattcattcatagggggggggggggggggggatcaaaaaaa-''进行扩增 。GUSB转录本被用作房屋保管表达控制 ，其表达水平在CFTRWT表达水平上范围，并使用以下引物对进行扩增：正向5'-GACACGCTAGAGCAGCATGAGGGGGGG-3'和反向5'-GGGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTGTTGATGATGG-3'
。使用ΔΔCT方法进行分析。为每个样品进行每个生物重复反应的技术重复 。 　　将16HBEGE CFTRR553X/ - 细胞以每孔6×105的细胞接种
，如上所述生长，并生长。播种后24小时 ，根据制造商的方案
，使用Lipofectamine 3000在一式三份中用1.5 µg TSA2T5或水（作为对照）转染细胞
。转染后转染后5 、24、36
、48和72 h裂解细胞，每孔加1 ml Trizol（Invitrogen）。根据制造商的说明 ，使用TRIZOL方法分离细胞的总RNA
，并通过10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳评估RNA完整性 。 　　用0.6 mg kg-kg-1在体外转录的TSA1T5静脉内对四只雌性BALB/c小鼠进行静脉注射
。治疗后6小时和72小时，在兽医吸入麻醉系统腔室中用3％异氟烷麻醉小鼠。收集了麻醉小鼠的肝脏并闪烁 。用PBS处理的小鼠用作阴性对照
。将整个器官粉在液氮中粉碎 ，并通过在500 µL Trizol（Invitrogen）中研磨而裂解。根据制造商的说明
，使用TRIZOL方法分离总RNA，并评估了10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的RNA完整性 。 　　如前所述61,62 ，使用TRNA量表的微阵列分析TRNA
，并进行了一些调整以测量SUP-TRNA
。在微阵列上，发现了覆盖41个胞质tRNA物种的全长tRNA序列的tDNA探针 ，发现了49个核编码tRNA家族的互补的TDNA，与TSA1T5的TDNA互补一起发现（5'-TGGCGTAGTCGACGGGATCGACCCGTGCGGGGGAGGAGGAGAAACCCCACCATGGTTTTTTTTGGAAGAGACCATCGCCTTAACCACTCGGCGCCACGACTAC-3'）或TDNA补充TDNA（5'-TGGCGTAGTCGACGGGATTCGACCCGTGGGGGGAGGAGAAACCCCAACCAAGGTTTGAAGCCTGCCCTGCCCTTAACCACTCGGCGCCACGACTAC-3'）。每个微阵列由12个相同的块组成
，每个块都包含每个天然tRNA的2个探针，而TSA2T5或TSA1T5的3个探针（每个SUP-TRNA总共36个信号） 。为了完全脱核酸TRNA ，将5μg的总RNA在37°C下在100 mM Tris-HCl缓冲液（pH 9.0）的37°C下孵育45分钟
，然后用乙醇降水和0.1含乙醇的沉淀和3 M乙酸钠（pH 5.5）纯化，并补充了糖原（20 mg ml-1 ，Therm-1
，Thermo-1，Thermo fishericific）
。CY3标记的RNA：将DNA发夹寡核苷酸连接到TRNA的脱酰化3'-NCCA末端 ，使用T4 DNA连接酶（NEB）在室温下1小时。来自非转染细胞的总RNA被用作比较
，并用ATTO647标记的RNA标记：DNA发夹寡核苷酸 。对于随后的阵列归一化，将每个样品用三个体外转录的TRNA（每种2μm）升入 ，它们不会与任何人类TRNA或SUP-TRNA交叉杂交。tRNA微阵列的详细实验协议可从协议中获得（https://doi.org/10.17504/protocols.io.hetb3en）
。使用Inhouse Python脚本分析了扫描的微阵列幻灯片。CY3与ATTO647信号的比率中值被标准化为尖峰ins
，其比率设定为一个 。此后，将来自SUP-tRNA的每个CY3信号归一化为尖峰的CY3信号 ，并在5 h（为16hbege细胞）或6 h（用于小鼠）时表示为与信号的平均值的比率
。 将其设置为100％。阵列在转染后5小时，24小时和36小时在两个生物学重复中进行
，并在单个复制中进行48 h和72 h样品 。由于阵列的可重复性高（置信区间高于98％），因​​此合并了从生物重复物中的单个信号进行标准化
。 　　在FRT细胞中测量了旋转的离子转运 ，该细胞代表了表达顶端CFTR上皮的标准模型
，并被美国食品和药物管理局视为CFTR调节剂的药物标签扩展的信息6,3,64。将稳定表达CFTRR553X，CFTRR1162X或野生型CFTR的FRT细胞以100,000–150,000的细胞接种到可渗透的支撑物上（每个Transwell Insert 0.33 cm2） 。播种后四天 ，细胞形成紧密的连接
，并使用脂肪切开胺3000（Thermo Fisher Scientific）在20 µL Optimem中用400 ng的体外转录tRNA（TR，TRT5或错配TRNA）转染
。将细胞在37°C的空气 - 液界面条件下在5％CO2中保持24小时。如上所述 ，HNE（R1162X/R1162X）细胞也被培养并用NMD抑制剂处理
，然后进行ISC测量 。 　　用MC8电压夹和P2300使用室设备（生理仪器）在电压夹条件下监测短路电流
。在培养物插入物（康宁）上生长的细胞在两侧都沐浴，含有相同的林格溶液（以mm为单位）：115 NaHCO3 ，2.4 kh2po4
，1.24 k2hpo4，1.2hpo4 ，1.2 cacl2，1.2 cacl2
，1.2 mgcl2和10 -glucose（pH 7.4）。用95％O2：5％CO2充气，每10 s强加1-S长的3-MV脉冲 ，以计算欧姆定律的耐药性 。如该研究所示
，粘膜溶液被更改为低氯化物缓冲液（1.2 mM NaCl和115 mM葡萄糖酸钠，其他成分如上所述）。加入Amiloride（100µm）（双侧）以阻断残留钠电流 ，然后是CFTR激动剂Forskolin（10 µm）和CFTR增强剂VX-770（5 µM）
。在每个实验结束时
，使用INH-172（10 µM）用来阻止CFTR依赖性ISC。为了分析USSING室数据，在Windows环境软件上运行了获取和分析2.3软件包（生理仪器） ，以同时测量1到8个组织的电流
，电压，电导和电阻 。对于HNE测量 ，将使用设备软件提供的标准设置与60 s的数据采集一起监视基线的当前变化
。 　　为了评估HNE（R1162X/R1162X）用TRT5或不匹配TRNA转染的HNE（R1162X/R1162X）的功能性微观分析参数（例如ASL高度）
，我们使用了微光学相干层析成像（μOOCT）（μOOCT），一种高速 ，高速度的高分辨率显微镜反射成像方法，如前所述。简而言之
，这是一种非侵入性方法，不使用外源性染料和颗粒来对气道上皮和相关的定量分析进行图像 ，并且μoct仪器以大约1μm的分辨率提供了细胞单层的横截面图像 。从过滤器外围获得1毫米的图像
，其扫描梁平行于滤膜圆周的圆周切线
。数据以20,480 Hz线路速率获取，每帧512行每秒40帧。ASL高度的量化是通过对使用图像J软件治疗的研究者直接测量相应层的几何测量来进行的 。使用Sidak的多重比较通过双向方差分析进行统计分析
。 　　For ribosome profiling, 2 female wild-type mice were intravenously dosed with LUNAR1 formulated with 0.6 mg kg−1 in vitro-transcribed tSA1T5, and 2 female mice were administered intratracheally twice 48 h apart (on day 0 and day 2) with LUNAR2 formulated with 0.35 mg kg−1 in vitro-transcribed tSA1T5.治疗六个小时后 ，将小鼠用3％的异氟烷​​在兽医吸入麻醉系统腔中进行麻醉。由于小鼠仍在麻醉下通过鼻锥吸入
，进行胸切开术以剖析肝脏和肺组织，并立即冷冻组织 。用PBS处理的小鼠持续时间相同 ，用作阴性对照
。The whole organs were pulverized in liquid nitrogen and lysed by grinding in 360 µl 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) supplemented with 5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 1% NP-40, 2 mM DTT, 100 µg ml−1 cycloheximide topped with 40 µl 10% sodium deoxycholate.每个动物器官的裂解物都用于产生一个独立的文库。 　　使用Lipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific）与400 ng CFTRR553X质粒和400 ng野生型CFTR质粒共转染了2000万CFBE41O-细胞 。转染后二十四小时
，收集细胞并用裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 7.4，5 mM MGCl2 ，100 mM KCl
，1％NP-40，2 mM DTT）。 　　裂解后 ，将小鼠器官或CFBE41O-细胞的裂解物补充在RNase I消化过程中稳定核糖体 - mRNA复合物（1.5 µl每OD260 5 U 30分钟）
。使用RNase I消化衍生的受核糖体保护片段（RPF）的测序库是使用微RNA的方案制备了适配器的直接连接的协议。67 。 　　测序的读数是使用fastx-toolkit（0.0.13.2）选择的质量，其阈值为20
。通过cusadapt（1.8.3）除去适配器序列
，而最小重叠为1 nt。将库耗尽的读数映射到rRNA参考序列（Bowtie 1.2.2; -y – un），并且读取分别映射到人（GRCH38）和小鼠（GRCM38）参考基因组 。使用STAR68（2.5.4B）进行映射 ，允许最大一个不匹配并过滤读取读取映射到多个位置（ - outfiltermismatchnmax 1 – outfiltermentimapnmax 1）
。在参考注释文件中
，选择了每个成绩单的最长注释CD。对于两个相同CD长度的转录本，我们选择了最长的转录本 ，包括5'和3'非翻译区域 。将唯一的映射读数标准化为RPM或RPKM
。 　　为了评估鼠标库中的终止密码子读取
，我们使用了参考文献中描述的过程。29 。我们绘制了RPF的中间核苷酸或奇数长度读取终止密码子，上游100 nt和终止密码子下游100 nt的区域的上游的核苷酸读取
。考虑了读数为25-32 NT。对于CFBE41O-细胞培养库 ，我们首先按照沿其中的脚本沿着所述步骤将RPF校准为每个RPF中的A位点密码子 。在这些分析中
，考虑了表达高于0.1 rpkm的转录本。 　　为了选择经过读取的成绩单，我们使用了26中描述的核糖体读数分数（RRT）
。RRT是CD上平均读取密度的比率（每千倍酶（RPK） ，标准化为CD长度）
，以及自然终止密码子与下一个固定终止密码子之间的平均读取密度（RPK（RPK）（RPK）（rpk归一化，归一化 ，至至少在4 nT中分离的两个停止代码之间的3'未转移区域的长度）。CFTR成绩单（ENSEMBL：ENSG00000001626; ENST00000003084.11）的覆盖范围表示为RPM 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得
。