补充表11包含收集的详细信息 ，并分析了每个基因家族的参数
，以下描述被概括。截至2022年7月1日，GenBank的所有公开基因组的预测蛋白质（429,896个基因组）使用HMMSEarch59筛选了与鸟可以代谢相关的基因的“收集HMMS”（图1） 。与一组可接受的“交叉检查HMMS ”一起 ，将所得基因用作一组PFAM，TIGRFAMS
，NCBIFAM和PANTHERFAM的查询序列
。使用特定的电子价值和覆盖范围进一步筛选基因。交叉检查的HMM名称用于查询Uniprot，并过滤结果以进行审查的条目 ，并在蛋白质级别上进行证据
，以识别功能性特征的蛋白质，并在数据集中尚未下载它们 。用指定的-ID和-Query_Cov值萃取并聚集了与“收集HMM
”对齐的蛋白质序列的一部分 ，以识别质心。在FastTree61中使用了从初始HMMSearch产生的基于HMM的质心序列
，以生成每个感兴趣的基因家族的系统发育树
。对于APC超家族渗透酶和同种水解酶，推断出所有通过电子价值和覆盖范围的蛋白质都具有预期功能。还需要在N. inopinata位置105（PF00491 HMM位置15） ，N 。Inopinata位置222（PF00491 HMM位置134）和N. Inopinata位置313（PF00491 HMM位置223）18
。需要在乳酸乳杆菌位置1,584（TIGR02712 HMM位置956）拥有保守的天冬氨酸
，并通过在K.乳乳杆菌位置具有天冬氨酸1,330（TIGR02712 HMM位置701）15。使用两个亚基的共同祖先（CGDA和CGDB）定义了羧基甘油氨酸脱节酶 在PF09347的一般树中 。然后，由于两个单属进化枝的定义 ，这种共同的祖传节点随后引起了CGDA和CGDB
。 　　使用地狱（v.1.1.3）62筛选来自氨氧化微生物的基因组62
，使用已建立的RFAM协方差模型I（RF00442），II（RF01068）（RF01068）和III（RF01763）和最近描述的GuosoSed watnal WASNADENS ribsanine IV ，‘ggam-1曲面。Sto’63 。记录脚手架ID，坐标和方向
，并针对GFF文件进行交叉引用，以识别下游基因
。如果基因与核糖开关相同 ，并且基因的5'端在核糖开关的1,000个核苷酸之内
，则认为该基因在核糖开关的控制之下。然后将推断的操纵子向下延伸，直到发现基因以相反的方向找到基因为止 。 　　在FastTree261中使用了基于HMM的质心序列对齐 ，默认参数用于生成系统发育树
。该树是使用Phangorn软件包中的函数中点（）扎根的中点
，并使用APE软件包中的getMRCA（）函数定义了功能进化枝，并使用R中的GGTREE包进行了可视化。 　　使用ape Package 64 ，使用descendant（）函数
，都使用后代（）函数在Ureohydrolase树（）函数中鉴定出所有鸟嘌呤酶的最新祖先（如上所述），并使用后代（）函数都从urehydrolase树（）函数鉴定出来 ，而后代质心则是从Ape Package64中收集的 。还需要使用后代（）函数收集的质心代表的所有HMM比对
，才能在其长度的90％的长度上覆盖PF00491，使用USEARCH（-ID 0.9 -QUERY_COVEN）覆盖。该序列数据集的HMM对准部分使用最佳模型（LG+I+I+R5）计算出使用IQ-Tree265的系统发育 ，并使用Ultrafast Bootstraps评估了两部分支持
。使用R中的ggseqlogo软件包生成了每个结果的鸟嘌呤酶和近亲的徽标。 　　为了对Comammox鸟苷酶和单加氧酶的共晶发育分析，筛选了comammox基因组的存在
，以存在AMOA和鸟嘌呤酶基因的存在 。由于大多数可用的基因组是MAGS，因此每个基因组都确定了每个基因的一个副本
。这导致了54个基因组进行分析。分校封装中的对流式溶液化和偏心函数分别用于对齐AMOA核苷酸和鸟苷酶氨基酸序列 。IQ-Tree2用于识别最佳模型（AMOA ，TPM3U+F+I+I+I+I+R3;鸟苷酶蛋白
，LG+I+G4），计算树木并使用超快引导程序进行评估两分
。使用Phytools软件包和GGTREE软件包的Cophylo函数的组合在R中可视化树。 　　以下化学物质购自Sigma-Aldrich：盐酸鸟嘌呤（≥99％ ，G3272）
，苯并（≥99％，8.01776） ，氢氧化钾（≥85％
，1.05033），乙醇（乙醇（≥99.8％） ，≥99.8％
，02851），形式 ，乙醇（1.05033），甲醇β-甲醇（≥99％
，8.05740）， - 精氨酸（≥99.5％ ，11009）和亚硫酸钠（≥98％
，239321） 。氯化氢溶液（32％，20254.321）和乙腈（≥99.9％ ，20060.320）购自VWR
。2-甲氧基乙醇（≥99.5％
，10582945）购自Thermo Fisher Scientific。从水纯化系统（0.071 µs cm -1; Elga Veolia，purelab合唱）获得Milliq水 。鸟嘌呤的衍生化方案改编自先前的研究29
。简而言之 ，将150 µl潜在含鸟嘌呤的水溶液冷却至0°C
，在0.5 ml塑料管（Eppendorf，eppendorf ，蛋白叶
，0030108434）中冷却至0°C，并用75 µL氧气中的苯甲醇溶液（4 mm）和75 µL溶液（75 mm）均匀（75 µL）均匀（75 µL）均匀亚硫酸钠（0.2 m）和150 µL氢氧化钾水溶液（1.6 m）。将所得的溶液混合 ，在沸水浴中加热10分钟，然后在冰浴中冷却2分钟 。随后
，加入了25 µL的氯化氢水溶液（4.8 m）。将所得的溶液混合并转移到1.5 mL塑料管（Eppendorf，0030120086）中 ，并以10,000g离心2分钟
。在分析之前
，将上清液稀释以在分析仪器的最佳定量范围内获得分析物浓度（即0.05-5μm）。使用液相色谱法（Agilent 1290 Infinity II）分析了主要的衍生化产物（补充图1C中提出的结构），并以3.73分钟的保留时间耦合到三倍四极杆质谱法（AgiLent ，6470） 。我们使用InfinityLab Poroshell 120奖励RP（Agilent
，2.7 µm，2.1×150 mm）的柱进行分离 ，注入体积为2 µL
，流速为0.4 ml min-1， 柱室温度为40°C和以下洗脱液：水溶液（a）：0.1％（v/v）甲酸的milliq水；有机（B）：乙腈 ，甲酸0.1％（v/v）
。洗脱梯度如下：0–1.5分钟
，5％b；1.5–4分钟，5–61％b;4–4.5分钟 ，61–95％b;4.5–7分钟，95％b;7-8分钟
，95-5％b;8–10分钟，5％B。设置源参数如下：正模式电喷雾电离；气温为250°C；气流 ，10 l min -1;雾化器
，45 psi；鞘气温，280°C；鞘气流 ，11 L min -1;毛细管电压
，3.5 kV;喷嘴电压，0.5 kV 。监测衍生产物的以下产物离子（父离子：252.2的M/z）：m/z：182.1（量词）和m/z：104.1（预选赛）
。使用MassHunter（Agilent ，V.10.1）整合了所得的色谱仪。为了绝对定量
，我们使用了一系列在0.05至5 µm之间稀释后浓度范围的鸟选择溶液 。对于纯培养基，活性污泥和土壤提取物 ，在各个基质中制备了校准溶液
。用水中的校准溶液对动物尿液和粪便进行定量。通过将20 µm鸟胺尖刺到动物粪便样品中
，恢复> 83％，可以证实动物样品的准确定量 。将动物粪便样品冷冻干燥 ，并将子样本分散在2 M KCl溶液中（每100 mg样品1 mL），并在裂解基质A管（MPBIOMEDICALES）中珠珠15分钟
，然后在20,000克以20,000克离心15分钟
。通过标准添加对废水处理厂的进水进行了量化。校准溶液以与各自样品并行的方式衍生和分析 。对于Orbitrap（高分辨率）MS分析，我们使用了与热QECACTIVE质谱仪耦合的液相色谱 ，具有以下参数：阳性电喷雾电离；毛细管温度
，275°C；鞘气，15；辅助气 ，10；扫气1；S-Lens RF
，50.0;决议，140 ，000（MS全扫）
，17,500（MS/MS）;NCE（步进），10,20,30。对于含有重与同位素标记的鸟嘌呤的生长实验样品 ，通过假设测得的同位素无标记的鸟根浓度对应于90％（我们使用了10％的同位素标记的鸟苷）
，可以推断鸟嘌呤的总浓度
。 　　将细胞生长在含有54.4 mg l -1 kh2po4 、74.4 mg l -1 kCl，49.3 mg l -1 mgSO4·7 H2O ，584 mg l -1 nacl，147 mg l -1 nacl
，147 mg l -1 cacl2
、34.4μg l -1 mnso4 nacl2、154μg l -1 mnso4·1h2o，584 mg l -1 cacl2 ，584 mg l -1 nacl
，584 mg l -1 nacl，584 mg l -1 nacl ，584 mg l -1 nacl
，584 mg l -1 nacl2ZnCl2，72.6μg L -1 Na2moo4·2 H2O ，1 mg L -1 Feso4·7 H2O
，20.0μgL -1 Cucl2·2 H2O，80μgL −1 Cocl2·6 H2·6 H2O ，3μgL -1 Na2 Seoo3 h2oNa2WO4·2H2O
，24μgl -1 NICL2·6 H2O和0.5 mm丙酮酸。通过添加4毫米肝素来缓冲该培养基，pH值设置为8 。对于常规的培养物进行维护 ，将培养物保存在37°C的Schott瓶中，而不会在黑暗中摇动
。当指示时
，盐酸盐酸盐是从滤光的0.1 m储备溶液中添加到最终浓度50μm的。 　　为了比较N. inopinata和AOB的纯培养物的鸟嘌呤利用，在1 L批量培养物中诱导了所有菌株 ，持续6周
，每周喂养0.5 mM铵和1 µM鸟根 。随后，每种培养物的生物量与使用Pierce BCA蛋白定量试剂盒（Thermo Fisher Scientific;在孵育中计算出的最终浓度 ，10 µg ML-1）确定的相同数量的生物量
。收集
，洗涤10 µg ML-1），并以相等的体积中的新鲜培养基置于新鲜培养基中 ，并转移至96孔
，平面底板（Greiner Bio Bio Bio Bio Bio-noer Bio-one）。在这些板中，仅用50 µm鸟苷进行以下孵育 。50 µm鸟嘌呤加150 µm铵；或150 µm铵在黑暗中仅在28°C下仅持续14天 ，而无需搅拌（氧化生物的最佳生长条件使用
，而9°C比N. Inopinata的最佳含量比最佳的9°C更冷
。 　　对于生长实验，N。n 。inopinata纯培养细胞预先生产10 µM鸟嘌呤和0.5 mM氨（每周补充）1个月 ，通过离心（4,500G，30分钟）收集
，用无N-Free中等中等含量洗涤3次，并在新鲜的培养基中固定3次
。将200毫升的等分试样分配到250 mL血清瓶中。在底物添加之前 ，将用作死去对照的等分试样（120°C
，20分钟） 。将以下N底物（始终为150 µm n）添加到五个复制瓶中：（a）15N-瓜烷定（10％15N-瓜烷氢巴胺，90％盐酸盐酸盐）；（b）鸟选择素（作为盐酸鸟胺盐酸盐）；（c）15N-瓜氨酸（10％15N-瓜氨酸氢酰胺 ，90％盐酸盐酸盐）和铵（每个150 µM N）；（d）仅铵；（e）没有n添加（饥饿的对照）；（f）用15N-瓜奈胺（10％15N-瓜氨酸氢溴胺
，90％盐酸盐酸盐）用15N-瓜烷定的死亡（高压灭菌）对照。此外，所有瓶子都接受了13C双碳酸盐酸盐添加（13C-NAHCO3; 1 mm终浓度 ，99％13C）
，以检测Chemolithoautolopolphic的生长和0.5 mM丙酮酸钠作为反应性氧氧气种类的Scavenger66
。血清瓶用无菌，hcl洁净的蓝丁基橡胶塞（Chemglass）封闭 ，并在黑暗中在37°C下孵育而不会搅拌。用无菌注射器和针头测定细胞数（使用QPCR）和N-化合物浓度的2 mL样品
，每1至14天用空气替换（在实验开始时频繁进行采样，在含有氨水的孵化后进行了更加间隔的采样） ，在126天的时间（126天）中（含126天）（含有12天的含量） 。耗竭后补充底物
。孵育107天后，从处理A
，B，E和F中除去10 mL样品 ，并在室温下用3％甲醛（终浓度）固定30分钟
，过滤到聚碳酸酯过滤器上（0.2 µm孔径，GTTP ，GTTP
，GTTP，40 nm Gold Spptered） ，用纯平的1×PBS
，40 nm的金色溅射）， 干燥并储存冷冻 ，直到进一步使用。使用共聚焦激光扫描显微镜（倒置的Leica TCS SP8X CLSM配备了405 nm UV uv diode）
，用4'，6-Diamidino-2-苯基吲哚（DAPI ，10 µg mL-1，5分钟）染色后可视化细胞 。在生长实验结束时
，通过接种到异养生长培养基（LB和TSY）中，证实了异育污染物的缺失
。 　　铵 ，尿素
，亚硝酸盐和硝酸盐浓度是通过先前发表的比色方案测量的67。简而言之，使用indophenol蓝色方法确定氨和铵浓度 。与磺基尼酰胺和N-1-萘基 - 乙二胺二氯化物反应后 ，使用Griess方法通过分光光度法测量亚硝酸盐浓度
。用氯化钒还原为亚硝酸盐后
，通过相同方法测量硝酸盐。根据先前的研究18，使用硫代二乙酰基二乙酰基氧霉素方法测量尿素浓度 。18
。 　　为了定量n孢菌细胞数 ，使用引物515F/806R进行了qPCR
，如先前所述，针对16S rRNA基因的V4区域6,70。标准标准是由纯化的n 。inopinata基因组DNA作为模板产生的纯化PCR产物产生的。根据Qubit DSDNA HS分析套件说明对标准进行量化
。将含有109个基因拷贝的标准排列成等分 ，并在-20°C下冷冻直至进一步使用。使用每个标准等分试样
，并仅将一次除霜一次以新鲜准备十倍的连续稀释液（每µL 108-102个基因拷贝） 。QPCR测定如下：冷冻培养等分试样被冻融四倍以进行细胞破坏
。总共使用0.25 µm的每种底漆，用于10 µL SYBR绿色超级粘合（Bio-Rad） ，2 µL细胞裂解物或标准配置的混合物中，最终体积为22 µl
，每个反应的最终体积为22 µl。QPCR循环仪（C1000-CFX96，Bio-RAD）设置如下：95°C持续15分钟；40循环为95°C ，持续30 s
，50°C 1分钟和72°C 45 s（板读）；并以72°C的速度完成2分钟，熔融曲线的性能从40°C到95°C ，每5 s增加0.5°C 。标准曲线的效率平均为86％
，R2为0.999
。增长率（分区率）计算如下： 　　其中v是除法速率（d -1），n是时间点i+1和i的qPCR确定的单元格数 ，而t是时间点i+1和i在几天内的时间间隔。 　　为了可视化稳定的N和C同位素同化从提供的15n-瓜氨酸和13C-双碳酸盐和13C-碳酸氢盐
，含有两个复制瓶（治疗A，Replicate A1和A2）和A2和A NA NATURANACY（Na）控制的细胞的金属含量的过滤器（7.11）的活性×7.1.11×7.11 MEM ，使用SuperGlue（Loctide） 。在维也纳大学的大型环境和同位素质谱学设施的纳米仪50L仪器（CAMECA）上进行了纳米菌素测量
。在获取图像之前
，每个分析区域均通过高离子和极端低离子撞击能（EXLIE）CS+沉积的顺序进行预处理，如下所示：高能量（16 KeV）在50 pa梁电流下 ，到5×1014离子CM -2的通知；Exlie（50 eV）在400 pA梁电流下为5×1016离子cm -2的通量；高能量到2.5×1014离子cm -2的额外通量。通过在45×45μm2区域内具有512×512像素图像分辨率的45×45μm2区域，通过焦点焦点的主CS+离子束（约80 nm探针大小）的顺序扫描作为多层图像堆栈 。每个循环每个像素的原发离子束停留时间在1 ms（A1 、74平面； NA
，50平面）和5 ms（A2，21平面）之间变化
。将多次聚会组件的检测器定位为实现12C2- ，12C13C-
，12C14N-，12C15N- ，31P-和32S-辅助离子的平行检测。使用OpenMIMS ImageJ插件（OpenMIMS v.3.0.5
，ImageJ v.1.54f）进行图像数据分析，其中所获得的数据集对齐 ，deadtime和QSA校正
，处理，处理（例如 ，累积
，稳定的同位素比率），并以13c和13n Enlich和13c（AS 13C和15C）导出 ，并在13C和15C中导出 。 　　为了蛋白质分析，将生物量溶于裂解缓冲液（8 m尿素
，2 m硫脲，1 mM PMSF）。蛋白质提取是通过在95°C下孵育 ，同时以1,400 rpm摇动5分钟
。随后
，将样品在超声水浴（Elmasonic S30 h）中处理3分钟。在细胞悬浮液中，加入6.75 µL 25 mm 1,4二硫代醇（在20毫米碳酸氢铵中） ，并在60°C和1,400 rpm摇动时孵育1小时 。接下来
，加入150 µL 10 mM碘乙酰胺（在20毫米碳酸氢铵中），并在37°C下在黑暗中摇动1,400 rpm在37°C下孵育30分钟
。最后 ，加入200 µL 20毫米碳酸氢铵
，并用胰蛋白酶（2.5 µL 0.1 µg 0.1 µg µl -1胰蛋白酶，Promega）在37°C下将蛋白质裂解物蛋白水解裂解过夜。通过添加50 µl 10％甲酸来停止裂解 。使用ZiptipμC18尖端（Merck Millipore）脱盐肽裂解物
。将肽裂解物重悬于15 µL 0.1％甲酸中 ，并使用纳米液体色谱-MS（Ultimate 3000 RSLCNANO
，DIONEX，DIONEX ，THERMO FISHER SCIENTIFIFIFIFIFIFIFIFIFIFIFIFIFIFIFIFIFIFIFIFIFIFIC）分析。对洗脱肽裂解物的MS分析在Q精确的HF质谱仪（Thermo Fisher Scientific）和Triversa Nanomate（Advion）上进行 。将肽裂解物注入诱捕柱（pepmap 100 c18，3μm
，纳米植物，75μm×2 cm ，Thermo Fisher Scientific）
，使用98％水/2％水/2％actonitrile，用0.5％trifluoro酸和分析（在分析中分析） ，使用98％水/2％actonitrile（均为100％）Nanoviper
，75μm×25 cm，Thermo Fisher Scientific） ，流速为300 nl min -1
。流动相在水中为0.1％甲酸（A）和80％乙腈/0.08％甲酸（B）。在Orbitrap中以120,000的分辨率获得了全MS光谱（350–1,550 m/z）
，自动增益控制目标值为3×106离子 。 　　使用sequest HT使用蛋白质组发现者（V.2.5，Thermo Fischer Scientific）分析获得的LC -MS数据 ，并推断出逆转
。使用从显微镜71下载的N. inopinata的预测蛋白质构建的数据库进行蛋白质识别。进行了以下参数进行搜索：胰蛋白酶作为酶特异性
，允许两次漏洞 。使用了10 ppm的肽离子耐受性，MS/MS耐受性为0.02 DA。作为修饰 ，选择了氧化（蛋氨酸）和氨基甲基甲基化（半胱氨酸）
。根据诱饵数据库和肽等级为1的Q> 1％的肽被确定。使用DEQMS72评估蛋白质的差异表达 。还仅用于可视化目的，还计算了归一化光谱丰度
。 　　N. inopinata的鸟苷酶基因被自设计的
，特定的PCR引物放大，该引物已经包含了Gibson Cloning的矢量特异性接头悬垂器（5'-CTGGAAGTTCTGTCTGTTCCAGGGGGCCCATGGCCATGGCCATGGCAAAAAAAAAAAAGAAGAAGAACGAACGAACGAACCC-3'''''''5'-CCCCAGAACATCAGGTTAATGGCGTCGTTTCTTCGTTCGATTGCC-3'） ，使用高效率Phusion Plus PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific）。根据制造商的协议
，将纯化的产物克隆到PCOOFY4（PEM44; HIS6-MBP）表达矢量中 。通过Sanger测序验证了插入物的序列
。 　　在37°C的自动诱导ZYP-5052培养基中培养培养物，并补充了0.5μm ，20μm或1 mm Niso4
，持续5小时，然后在4°C冷却15分钟 ，然后在20°C下过夜表达。在50 mM HEPES
，200 mM NaCl，5％甘油 ，pH 7.4的蛋白酶抑制剂鸡尾酒的存在下
，将细胞裂解，使用细胞破坏器（恒定系统） ，并在4°C和45,000G处离心30分钟 。使用MBPTRAP HP柱（Cytiva）通过亲和力色谱法（Cytiva）纯化N端与His-MBP-TAG融合的N-终端融合
。随后，将HIS-MBP-TAG用HRV-3C蛋白酶在质量比蛋白质与蛋白质的质量比为1:50的质量比裂解过夜。通过MBPTRAP HP柱（Cytiva）进一步纯化鸟嘌呤酶
，然后在HILOAD SUPERDEX 200 26/600pg柱（Cytiva）上进行尺寸 - 排斥色谱法（Cytiva），用20 mM HEPES ，200 mm NACL
，NACL，5％甘油 ，5％甘油
，pH 7.4 。对于表达批次的20μM镍，在纯化过程中 ，该镍浓度保持在所有缓冲液中
。 　　通过使用vivaspin离心浓缩器（sartorius）和闪光灯将样品浓缩至10 mg ml-1
，并储存在-80°C下。使用SDS -PAGE分析蛋白质的身份和纯度 。 　　使用SuperDex 200增加10/300 GL（Cytiva）在20°C下在1260 Infinity HPLC系统（Agilent Technologies）上进行的SEC-MALS进行，并与Minidawn Treos Mals teking（Wyatt Technolty）耦合。将样品注入（1 mg ml -1时80μL） ，用20 mM HEPE
，150 mM NaCl，pH 7.4进行广泛平衡
。使用BSA作为对照进行测量。用RI-101折射率检测器（Shodex）测量蛋白质浓度 ，并使用程序ASTRA（WYATT技术）计算平均分子质量 。一阶拟合ZIMM形式主义用于分析光散射数据作为ASTRA中的数据过程，并且使用0.185 mL G-1的通用蛋白DN/DC值用于鸟嘌呤酶和BSA
。 　　Prometheus nt.48仪器（纳米机技术）用于确定熔融温度（TM）。在测量之前
，将用0.5 µM Ni2+表达的鸟苷酶的样品在4°C下在16,000g下离心10分钟，以去除任何大骨料 。为了识别蛋白质的TM最高的缓冲液/pH ，使用含有不同缓冲液和pH值的DSF-buffer/pH屏幕稀释蛋白质74
。毛细血管填充了10μl样品
，并将其放在样品持有器上。从20到95°C施加1°C min -1的温度梯度，并记录330和350 nm处的内在蛋白质荧光 。使用MoltenProt75处理数据 ，其中使用两态可逆的展开模型估算了曲线的熔化温度
。 　　通过完整的蛋白质质谱法验证了蛋白质的身份和纯度。总共将40 ng的样品注入了LC -MS系统上的一列：Dionex Nano HPLC
，Waters Xbridge C4，流速250μlmin -1阶梯梯度12–40-80％ACN ACN Sentapt G2SI ，分辨率模式 。使用Maxent1Software76进行平均质量的重建
。 　　为了量化纯化的鸟嘌呤酶的Ni2+和Mn2+浓度
，使用ICP-MS对样品进行酸消化并测量。对于酸消化，使用了30％的HCl（Supelco Suprapur ，100318
，Merck），HNO3 65％（3倍亚沸腾 ，以分析纯质量提供； 1.00441.1000，默克） 。H2O2（31％
，Rotipuran Ultra，HN69.1）购自Carl Roth。使用Elga Veolia ，Purelab Chorus 3 Ro用0.075 µs cm -1产生去离子水
。将180 µL样品吸入到7 ml PFA小瓶（Savillex）中
，对应于2至2.5 mg之间的总样本量。随后，添加了0.5 mL HCl和1.5 mL HNO3 。关闭小瓶的气体紧密后 ，将其加热到热板（Savillex）上的120°C
。温度保持恒定12小时。样品冷却至室温后
，以50 µL步骤添加了总共500 µL H2O2 。小瓶再次关闭，并在120°C加热12小时
。随后 ，打开小瓶
，样品在120°C下干燥。冷却后，将消化溶解在2 ml HNO3中 ，并在140°C下再次干燥 。最后
，将消化溶解在1 ml HNO3中，并溶于2 ml的水
。关闭小瓶并在120°C再次加热12小时 ，以确保完全溶解。然后将消化定量转移到15 mL离心管（聚丙烯，金属不含金属）中
，并用去离子水填充10 mL 。在NO-GAS模式下，用Agilent 7900单四Quad ICP-MS仪器（安捷伦技术）测量了消化的双重稀释液
。等离子体的操作参数设置为以下值：RF功率：1,550 W；RF匹配 ，1.80 V;样品深度
，10毫米；雾化器气体流量为0.8 L min -1;化妆/稀释气，0.4 L min -1。数据采集​​的参数如下：采集模式 ，频谱；扫描/重复80；复制
，3;集成时间/质量， 0.1秒元素浓度为0.025至25 µg L -1的外部校准标准用于定量 。MN2+和Ni2+达到的定量值的极限分别为≤0.17µg l -1和≤0.61µg l -1。对于MN2+的检测极限（LOD）≤0.05µg L -1 ，Ni2+的检测限为≤0.18µg L -1
。MN2+的测量稀释消化浓度范围为1.9至21.6 µg L -1 30 min, 37 °C). Samples were taken for chemical analysis to ensure the absence of detectable ammonium, nitrite, nitrate and urea before MR experiments. All chemical species were determined photometrically as described above. 　　MR experiments were conducted in a glass MR chamber (~2 ml) containing a glass-coated magnetic stir bar, on an MR2 stirring rack (350 rpm), in a recirculating water bath (37 °C). MR chambers were overfilled with concentrated biomass to ensure the absence of a gaseous headspace, closed with an MR injection lid and submerged in the water bath. An O2 MicroOptode was inserted into each MR chamber and left to equilibrate (~1 h), before a stable background signal was determined (15–30 min). The background rate of oxygen depletion was subtracted from all subsequent rate determinations in each MR chamber. A Hamilton syringe (10 μl; Hamilton) was used for all substrate (ammonium, urea, guanidine) injections. Both single- and multiple-trace oxygen uptake measurements were performed. 　　For single-trace measurements, a single-substrate injection was performed, and the oxygen uptake was recorded until complete substrate depletion in the presence of excess O2 (>30μmO2）。单个注射方案用于确定每O2消耗的尿素和鸟选择素的摩尔比 。N. inopinata的全细胞动力学分别用尿素和鸟根作为底物进行了单次注射痕迹
。在此
，进行了单个注入尿素（约20μm）或鸟苷（约20μm）的MR腔室。此外，用尿素（0.5 mm）或铵加甘表示（1 mm和〜20μM）在N. inopinata中的总铵氧化的全细胞动力学由单迹径测量确定 。这里进行了单个注射NH4CL（〜25μM）
。在所有情况下 ，在存在多余的O2（>30μmO2）的情况下
，将实验在完全底物耗竭后停止。硝酸盐是所有用于全细胞尿素和鸟选择动力学计算的MR Chambers中唯一可检测到的最终产物 。 　　多迹径测量用于确定鸟嘌呤对N. inopinata中最大铵氧化速率的抑制作用
。通过初始注射NH4CL（250-500μM），实现了铵氧化的最大速率。随后 ，进行了几种不同注射鸟嘌呤浓度的注射，并在每次注射后计算氧气耗竭的离散斜率（〜2-5分钟） 。 　　在所有情况下
，对于单次注射和多次注射，MR腔室含量在测量结果后立即离心（19,000g ，15分钟
，20°C），并且分别存储细胞粒和上清液进行蛋白质和化学分析（-20°C）
。为了蛋白质分析 ，使用Pierce BCA蛋白质试剂盒（Thermo Fisher Scientific）对总蛋白质含量进行光学测定。如上所述
，进行了化学分析（铵，亚硝酸盐 ，硝酸盐和尿素） 。 　　在含有20 mM Tris-HCl和50 mM NaCl的缓冲液中测量25分钟的尿素
，在37°C，pH 7.5中测量了异源表达和纯化的鸟嘌呤酶（在存在不同Ni2+浓度的存在下；见上文）的鸟嘌呤降解。在1 mM Ni2+存在下表达的酶的测量是在1 mM Ni2+存在下进行的
。动力学是根据50、100
、250、500 、1,000
、2,500、5,000 、10,000
、25,000、25,000 、50,000和100,000μm鸟选择的起始浓度计算的。为了筛选替代底物的使用 ，使用了在1 mM Ni2+存在下表达的鸟嘌呤酶 。然后
，将10毫米的甲基瓜氨酸，氨木他 ，精氨酸，肌酸
，鸟丁丁酸酯和鸟苷丙酸酸酯和鸟类肾上腺素在37°C下与纯化的鸟苷酶酶或BSA孵育30分钟，在三个或六个重复的情况下孵育30分钟
。在37°C下以pH 5.5
、6、6.5 、7
、7.5、8 、8、8.5
、9、9.5 、10
、10、10 、10.5和11（通过添加HCl或NaOH设置）在37°C下筛选鸟嘌呤酶pH依赖性。在14
、20、28 、37
、46、50 、55
、60、65 、70、80和90°C的14
、28、37 、46
、50、55 、60
、65、65 、65
、65、65 、65
、65、65 、65、80和90°C下筛选温度依赖性 。这些孵育是一式三份完成的
。 　　总铵 ，尿素和鸟苷氧化的细胞动力学特性是根据单轨底物依赖性氧摄取测量值计算的。底物氧化速率是根据使用底物对氧的消耗率来计算的 。对于总铵氧化
，使用了1：2的底物与氧气比
。单轨实验用于确认尿素（3.9±0.31，n = 3）和鸟选择素（6.17±0.24 ，n = 4）氧化的底物与氧的比率。因此
，对于总尿素氧化和总鸟嘌呤氧化，底物与氧气比分别使用1：4和1：6 。将所有底物氧化速率标准化为每个MR腔中的总细胞蛋白
。在总铵氧化的情况下 ，根据km（APP）计算了无周到的NH3的KM（APP）
，用于总铵，孵育温度 ，pH和盐度85。 　　The cellular kinetic properties of total ammonium, urea and guanidine oxidation were determined with a Michaelis–Menten model fit to the data using equation (2) where V is the reaction rate (μM per mg protein per h), Vmax is the maximum reaction rate (μM per mg protein per h), S is the total substrate concentration (μM), and Km(app) is the reaction half saturation concentration（μm） 。使用无约束的非线性最小二乘回归分析来估计KM（APP）和VMAX值86,87。 　　还确定了对鸟选择氨酸抑制的总铵氧化（Ki
，μm）的反应半抑制浓度
。用Dixon图分析以图形方式确定Ki 88。绘制了总铵氧化速率与总鸟嘌呤浓度绘制 。这些分析使用了总氧化速率，导致线性趋势
。来自每个生物学重复的线性最佳拟合趋势线用于确定相交焦点并估计Ki值。此外 ，使用不同鸟嘌呤浓度的总铵氧化速率百分比的线性回归用于确定Ki 。 　　使用方程式（3）计算了铵，尿素和鸟选择剂氧化的特定底物亲和力（AO；每H湿细胞）的特异性底物亲和力
。每克蛋白质的湿细胞重量为5.7 g湿细胞的因子32,48,89。 　　RIBE WWTP（GPS坐标：55.33
，8.74）具有生物N和P去除（增强的生物磷去除），并治疗与20％工业贡献（有机负荷）相对应的25,000人等效物的市政废水 。它是通过再循环设计的 ，并具有返回的污泥边术水解
。它没有主要解决。抽样时间左右的悬浮固体为〜3.1 g l -1 。Haderslev WWTP（GPS坐标：55.25
，9.51）具有生物N和P的去除，并处理5％工业贡献的市政废水 ，对应于100,000人的等效物
。它的设计具有交替条件
，包括侧流水解。它没有主要解决 。抽样左右的悬浮固体为〜3.2 g l -1。Klosterneuburg WWTP（GPS坐标：48.29，16.34）治疗与总计50,000人等效物具有两级生物混合过程的市政废水
。抽样时间左右的悬浮固体为〜4.4 g l -1。 　　为了表征社区结构 ，对来自MIDAS Biobank Collection的Ribe和Haderslev WWTPS进行了细菌16S rRNA基因的V1至V3区域的扩增子测序 。施加的PCR引物为27F（5'-AgagtttgatCctggctCag-3'）和534R（5'-AttAccgcggcgtgctgctgg-3'）
，带有条形码和Illumina适配器（IDT）
。使用1×PCRBIO Ultra Mix（PCR生物系统），正向和反向引物的400 nm和10 ng模板DNA ，使用1×PCRBIO Ultra Mix（PCR生物系统）和10 ng模板DNA以每样本的重复进行PCR反应（25μL）。PCR条件为95°C持续2分钟；然后是20°C的20个循环20 s
，56°C 30 s和72°C 60 s；并在72°C下进行最终伸长步骤5分钟 。使用0.8×CleanNGS珠纯化PCR产物，并在无核酸酶的水中洗脱
。使用V3化学（Illumina）在Illumina Miseq Sequencer上分别以等摩尔浓度分别汇总 ，并将其稀释至4 nm，并在Illumina Miseq Sequencer上进行配对末端测序（2×300 bp）。添加了20％的噬菌体phix控制库
，以减轻低多样性库的效果 。使用软件USEARCH60与-fastq_mergepairs命令合并了正向和反向序列读取，使用usearch -filter_phix删除phix序列 ，并使用usearch -fastq_filter与参数-fastq_maxee设置为1.0
。使用选项-sizeOut和Amplicon序列变体（ASVS）通过USEARCH -FASTX_NIQUES进行删除 使用usearch -unoise3命令解决。通过使用usearch -otutab命令使用-Zotus和-srand Plus选项将质量滤波的读取映射到ASV
，从而创建了一个ASV表 。使用参数-strand和-sintax_cutoff 0.8，使用USEARCH -SINTAX命令将分类法分配给ASV
。PCR使用Comammox Crade A和C层B特异性底漆套件证实了样品中的Comammox生物在样品中的不存在用于鸟选择降解测量的klosterneuburg。在相同浓度下的RIB和HADERSLEV样品DNA用作阳性对照 。 　　2021年10月22日 ，从肋骨和Haderslev WWTPS的充气罐中收集活化的污泥样品。将每个WWTP的四升污泥sc入大型无菌塑料瓶中
。样品在同一天将样品运送到实验室
，并在黑暗中存储在环境温度下，即4至10°C ，直到启动孵育。与Ribe的污泥一起孵育是在收集的同一天开始的
，与Haderslev的样品一起在收集后的第二天开始 。在每次孵育之前，将污泥稀释约1：4 ，如下：允许污泥完全沉降（1小时）
，然后将1.5 L的透明上清液轻轻地收集到新的无菌烧瓶中，而不会干扰絮凝物 ，最后，剩余的污泥的0.5 L完全重新下降并添加到1.5升上超级耐用的超级耐药剂
。然后将混合的100 mL稀释污泥的等分试样分配到200 mL无菌玻璃微观效中
，并用铝箔覆盖，以使气体与大气交换。将底物添加到以下最终浓度中：鸟选择素 ，50 µm；氨
，150 µm；和尿素，75 µm 。选择了这些不同的浓度来说明分子之间的氨基群数
。还没有包括底物控制。将样品在23°C下以100 rpm的振动孵育 。所有底物和对照处理均以一式三份进行
。在T0处添加初始底物之前和之后 ，将缩影次采样。在3
、6、12和24小时以RIBE孵育系列中的其他子样本进行 。在2.5 、4
、8、16 、24和48小时以2.5
、4、8 、16
、24和48 h进行了其他子样本
。立即用液体-N2闪烁的元转录组样本
，并在-80°C下存储直至处理。将平行样品（1 mL）用于化学分析以12,000g离心5分钟， 并在-80°C立即取上中清液并立即冷冻 。 　　从活化的污泥样品（500 µL）中提取总核酸 ，该样品在冰上解冻并离心（5分钟
，最大速度，4°C） ，使用rneasy powermicrobiome套件（QIAGEN（QIAGEN））根据制造商的说明
，并添加了酚类：25：25：25：25：25：25：25：25：25：25：25：25：25：25：15：25：25：25：25：25：（10μlml -1终浓度）。在FastPREP FP120（MP BioMedicals）上进行珠子跳动（在6 m s -1时，在冰上进行2分钟的间隔为4次 ，用于细胞裂解，而不是涡旋
，以改善用刚性细胞壁的细菌裂解
。将总核酸提取物对DNase处理进行DNase处理，以使用无涡轮DNA的试剂盒（Invitrogen）去除DNA污染物 ，并在rRNA DETLETIOTIN前进一步清洁并用Rnaclean XP珠（Beckman Coulter）浓缩。用Agilent RNA筛选（Agilent）系统评估了纯化的总RNA的完整性和质量
，并使用Qubit RNA BR分析套件（Thermo Fisher Scientific）测量浓度 。所有样品的平均RNA完整性数均高于7.0
。 　　使用NEBNEXT RRNA耗竭试剂盒（新英格兰Biolabs）以100-300 ng总RNA作为输入，将总RNA耗尽。Nebnext Ulta II定向RNA库预备套件（新英格兰Biolabs）用于根据制造商的说明来制备cDNA测序库 。使用v1.5 300循环试剂盒（Illumina ，20012863）
，在Novaseq 6000平台（Illumina）上的S4流动池上测序2.0 nm的文库
。 　　使用bbmap v.38.92进行了适配器筛选，质量过滤并映射到已发表的mags的启动读取。使用BBDUK进行转移和质量过滤（KTRIM = R K = 21 Mink = 11 HDist = 2 MinLen = 119 QTRIM = R Trimq = 15） 。从WWTP RIBE映射到基因组登录GCA_016722055.1 ，WWTP HadersLev的读数映射到基因组登录GCA_016712165.1
，这是各自的wwtp37中的主要COMAMMOX MAGS
。这两个映射均使用BBMAP（最小= 0.98 IDFILTER = 0.98模棱两可= TOSS配对= T KillBadpairs = t mapedonly = t bamscript = bs.sh）产生bamfiles。使用BBMAP和从GenBank下载的每个基因组下载的BAM文件的BAM文件计算每个基因的计数 。对每个编码基因的计数进行了潜在异常值的检查，这些异常值确定了MBK8278324.1和MBK9947797.1为潜在误宣传的小RNA ，并从随后的计算中删除
。通过将不同的时间点作为重复和使用DESEQ290的因素进行比较来评估差异转录。计算TPM并仅用于可视化目的 。 　　土壤是从2023年5月由位于Ritzlhof野外实验的奥地利健康和食品安全机构管理的长期施肥实验（48°11'17.9''n 14°15'16.5'E）的收集。土壤孵育是在用灰丁基塞子盖的125毫升惠顿瓶中进行的
。简而言之
，将30 g土壤添加到每个复制（n = 3）瓶中，并用820 µl水 ，铵，鸟嘌呤或铵 +鸟嘌呤修改
，最终浓度为30 µg n每克干燥土壤。将土壤在23°C下孵育，并在0、1 、2
、3、5 、7、12和27天进行采样 。乙炔（0.02％ ，V/V）用于抑制所有岩性氨氧化
。通过向密封瓶中添加0.3 ml 10％乙炔气体来提供乙炔。每1-3天打开一次瓶子
，然后对乙炔进行补充 。对于化学分析，将大约2 g土壤提取在水中 ，并在2 m kCl中萃取
，并在-20°C中冷冻提取物直至分析
。如上所述，在水提取物和铵 ，尿素和鸟根中定量硝酸盐和亚硝酸盐。对大约1 g土壤进行采样进行分子分析
，并在-80°C下冷冻直至分析 。根据制造商的说明，使用Zymobiomics DNA/RNA微型套件进行DNA提取物
。如前所述38,92,93进行了AOB ，AOA和COMAMMOX进化枝A和B AMOA QPCR。 　　对Sigmaplot v.14.5中的两尾t检验进行了从生理实验和WWTP样品孵化的化学
，蛋白质和QPCR数据的统计分析，并未使用统计方法来预先确定样本大小 ，并且未使用样品的盲和随机化 。 　　这项研究的所有合作者都符合自然期刊所要求的作者身份标准，因为他们的工作对于设计和执行研究至关重要
。在研究之前
，合作者之间的角色和责任是在合作者中达成的。除了掉落的动物粪便和尿液外，本研究中没有使用活的动物或动物来源的材料 。动物没有被迫排泄。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得
。