E14 ES cells (129/Ola background) were maintained on 0.2% gelatin-coated plates in Glasgow minimum essential medium (GMEM, Sigma-Aldrich, G5154) containing 15% fetal bovine serum (Gibco, 26140079), supplemented with 1× penicillin–streptomycin (Thermo Fisher Scientific, 15140122), 2 mMGlutamax（Thermo Fisher Scientific，35050061） ，50 µMβ-羟基乙醇（Thermo Fisher Scientific
，21985023），0.1 mm非必需氨基酸（Thermo Fisher Scientific ，11140050）
，1毫米丙烯酸硫化酸盐（Thermo Fisherific Sc​​ientific，11336666363363636360070）1,000 U ml -1 ，Millipore）
，称为血清MES细胞培养基。每2天通过吸入培养基，将细胞通过培养基/EDTA溶液（TE）在室温下在MES细胞培养基中冲洗和解离 ，从而使细胞在室温下短暂地分离细胞 。通过以300克离心5分钟将细胞颗粒
。根据制造商的说明
，使用Lipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific，L3000-001）进行MES细胞转染。根据制造商的说明 ，使用10 µL细胞悬浮液和10 µL的细胞悬浮液和10 µL的Gibco Trypan蓝溶液（Gibco，15250061）使用Countess II自动细胞计数器（Thermo Fisher Scientific
，AMQAX1000）进行细胞计数 。对于全反击酸（RA，Sigma-Aldrich ，R2625-50mg）的处理
，用1μMRA诱导细胞，在指定的时间内无LIF
。在差异化过程中 ，RA培养基每24小时更换一次。For SILAC experiments, cells were cultured in SILAC DMEM (Thermo Fisher Scientific, A33822) containing 15% dialysed FBS (Thermo Fisher Scientific, 26400044), to which either 13C615N2 -lysine-2HCl (Thermo Fisher Scientific, 88209) and 13C615N4 -arginine-HCl (Thermo Fisher Scientific, 89990)（重）或-Lysine（Sigma -Aldrich
，L8662）和 - 精氨酸（Sigma -Aldrich，L8094） ，仅包含光同位素（光） 添加了 。所有细胞系都通过ATCC进行了STR认证
，并测试了支原体污染
。 　　为了生成用于dpy30 sgrna的生长素诱导的降解系统，将靶向量子型区域的靶向型sgrna克隆到ESPCAS9（1.1）-T2A-EGFP中。左右同源性臂以及MIAD-T2A-BFP中间部分使用融合内克隆套件（Takara ，638910）连接到修改后的PUC19矢量骨架（S. Pollard的礼物）中 。使用Lipofectamine 3000与SGRNA和供体载体共转染MES细胞
，并在48小时后用于GFP/BFP-Double-to阳性细胞
。然后，用PPB-Hygro-Ostir1-P2A-MCHERRY和PBASE质粒转染纯合子克隆 ，并选择100 µg ML-1湿霉素B（Thermo Fisher Scientific，10687010）选择。为了生成用于RBBP5的内源性DTAG诱导降解系统
，针对终止密码子区域的SGRNA共转染到细胞中并包含以下元素：左右同源性臂，以及FKBP12（FKBP12（F36V）（F36V）） ，2×HA标签
，P2A，P2A ，P2A和Nemomycin-nemomycin-emomycin-nomycin-GeneceNanceSistansessistansessistance gene 。选择转染的细胞使用100 µg ML-1遗传素选择性抗生素（G418硫酸盐）（Thermo Fisher Scientific
，10131027），单细胞排序以获得克隆细胞系并进行了筛选以进行正确的双乳杆菌整合。通过Sanger测序和Western印迹证实了所有纯合插入和敲击
。补充表1中提供了寡素的列表和SGRNA的序列。 　　用ESPCAS9（1.1）-T2A-EGFP或ESPCAS9（1.1）-T2A-MCHERRY载体转染细胞 ，分别针对特定基因组基因座的SGRNA
，并在转染后48 h对细胞进行单细胞分类 。为了在DPY30-MASEAD细胞系中生成KDM5A/B-DKO细胞，我们首先在DPY30-MAID系列中生成KDM5A-KO（KDM5A - / - ） ，由Cas9（SGRNA）（补充表1列出）
，然后在kdm5b interage中列出了kdm5b intimage kdm5b interage kdm5b intipaige kdm5b quotout in-pass
。KDM5A - / - 线）。随后，将两个具有KDM5A和KDM5B敲除的克隆（在这项研究中称为DPY30-MASED-MASED KDM5A/B-DKO）进行下游分析 。Sanger测序和Western印迹证实了所有纯合插入和敲除
。补充表1中提供了SGRNA的列表。DKO细胞系的进一步表征表明 ，它们没有可检测到的增殖变化，并且表达了正常的多能基因水平 。但是
，正如预期的那样，与野生型细胞相比 ，它们显示出H3K4ME3水平的升高
。 　　用停止的蛋白酶抑制剂在RIPA缓冲液中裂解细胞（Thermo Fisher Scientific
，78429）。使用丙烯酰胺凝胶（Biorad凝胶系统）通过SDS-PAGE分离的蛋白质被转移到硝基纤维素膜上（Li-Cor，926-31092） 。在PBS-T（PBS中为0.1％Tween-20）中 ，将膜封闭在5％的脱脂牛奶（Sigma-Aldrich）中
，并与主要兴趣的主要抗体一起孵育（补充表2）
。作为二级抗体，使用IRDYE 800CW山羊抗兔IgG（925-32211 ，Li-Cor Bioscience
，1：15,000）或IRDYE 800CW山羊抗小鼠IgG（925-32210，Li-Cor Bioscience ，Li-Cor Bioscience
，1：15,000）。使用Image Studio Lite（Odyssey CLX成像仪，LI-COR Biosciences）对蛋白质进行成像 。补充图4中提供了免疫印迹源数据。 　　将MES细胞与胰蛋白酶/EDTA分离 ，重悬于培养基中，离心并重悬于PBS中
。对于细胞内流式细胞术
，添加0.5 mL冷固定缓冲液（Biolegend，420801） ，然后在室温下孵育10分钟。随后
，将细胞用未结合的兔DPY30抗体（贝尔特基实验室，A304-296A）标记 ，然后用FITC偶联的山羊抗兔IgG IgG抗体标记 。使用Beckman Coulter Cytoflex系统进行流式细胞仪
。补充图5中显示了E14样品的门控策略。 　　根据制造商的协议
，使用Rneasy Plus迷你套件（Qiagen，74134）提取总RNA 。使用转录器通用cDNA主（Sigma-Aldrich ，5893151001）对一微克总RNA进行逆转录
。使用Powerup Sybr Green Master Mix（Thermo Fisher Scientific
，A25778）和引物（补充表1列出），使用逆转录（RT – QPCR）反应的QPCR一式三份设置。如相应的图传说中所示 ，使用ΔΔCT方法对管家基因进行了相对定量 。使用GraphPad Prism v.7（GraphPad）进行统计分析
。 　　将细胞（每个处理条件1×106）重悬于350μl的缓冲液RLT Plus中
，并使用RNeasy Plus Mini Kit从细胞颗粒中提取总RNA（Qiagen，74134）。对于SLAM-SEQ实验24 ，将细胞与100μM4-硫脲（4SU; Biosynth，nt06186）一起孵育60分钟
，然后再分离 。将RNA（1μg）用10 mM碘乙酰胺在50μl反应体积中在50°C下用50 mm NAH2PO4（pH 8.0）和50％（v/v）DMSO处理15分钟，然后添加1μL的1μl1 m二硫代蛋白酶（DTT） ，以停止反应
。用1μL的糖布鲁（Thermo Fisher Scientific
，AM9515），5μL乙酸钠（pH 5.2）和180μL乙醇（≥99.0％） ，在-80°C下沉淀60分钟。将RNA在4°C（12,000g持续30分钟）下颗粒
，用1 ml的80％乙醇洗涤，并在4°C（12,000克持续30分钟）离心 。将RNA颗粒在室温下干燥10分钟 ，并重悬于20μl无核酸酶H2O中。使用2200 tapsestation（Agilent）评估RNA产量和质量
。使用Quartseq 3'-MRNA SEQ库Prep Kit FWD制备了测序文库
，用于Illumina（Lexogen，SKU：015.96） ，从500 ng或100 ng的总RNA升高了ERCC RNA Spike-In Mix 1（1：1,000
，Thermo Fisher Scientific，4556740）。简而言之 ，第一链（Oligo（dt））cDNA合成之后，通过随机启动进行RNA去除和第二链合成 。双链库被珠纯化
，以在PCR扩增前用i7单索引物进行10个循环，以去除反应成分
。根据制造商的协议 ，再次将放大的库被珠纯化
，并通过量子测定法测量浓度。在绘制75 bp或45 bp的单端读取测序之前，检查了所有样品的片段分布 ，以便在Illumina NextSeq 550平台上进行汇总 。 　　根据标准方案进行芯片实验
。简而言之
，通过在室温下添加1％甲醛（Sigma-Aldrich，252549-1L） ，在室温下添加1％甲醛（Sigma-Aldrich
，252549-1L）通过添加1％的ES细胞在室温下添加10分钟。用PBS洗涤固定细胞，并重悬于SDS缓冲液中（100 mM NaCl ，50 mM Tris-HCl pH 8.0
，5 mm EDTA，0.5％SDS ，1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒中的鸡尾酒） 。The resulting nuclei were precipitated, resuspended in the immunoprecipitation buffer at 1 ml per 16 million cells (SDS buffer and Triton dilution buffer (100 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA, 5% Triton X-100) mixed at a 2:1 ratio with the addition of 1× protease inhibitor cocktail from Roche) and processed on the Bioruptor再加上超声（Diaconode），达到平均碎片长度为200-300 bp
。根据制造商的协议
，使用纳米体估算染色质浓度。如下所示，在1 mL的免疫沉淀缓冲液中设置了免疫沉淀反应 ，并在4°C下孵育过夜 。第二天
，将BSA阻滞的蛋白质G dynabeads（Thermo Fisher Scientific，10004d）添加到反应中 ，并在4°C下孵育2小时
。然后用低盐洗涤缓冲液（150毫米NaCl
，1％Triton X-100
、0.1％SDS，2 mm EDTA ，20 mm Tris-HCl pH 8.0）和两次用高盐水洗涤缓冲液（500 mm NaCl
，1％Triton X-100，0.1％SDS ，2 mm EDTA）洗涤珠3次（150毫米NaCl
，1％Triton X-100、0.1％SD，2 mm EDTA ，20 mm EDTA，20 mm EDTA）和两次。然后将样品在洗脱缓冲液（1％SDS
，0.1 M NAHCO3）中在65°C的65°C上进行反向交联，并使用Qiaquick PCR纯化试剂盒（Qiagen ，28506）纯化 。补充表2中提供了本研究中使用的抗体的列表。使用Nebnext Ulta II DNA库预备试剂盒（NEB
，E7645L）和Ampurexp珠（Beckman，A63881）制备了用于芯片seq的库
。使用Qubit高灵敏度DNA试剂盒（Agilent ，Q32854）对库进行定量 并评估挂毯。根据需要合并库
，变性并加载到具有高输出套件（75个周期）的Illumina NextSeq 550系统上 。补充表1中提供了用于芯片– QPCR的所有引物的列表
。对于尖刺芯片– Seq，5％的5％的交联果蝇染色质（自制）带有尖峰抗体（Active Motif ，61686）
，然后添加了免疫沉淀步骤，以根据制造商的指示。 　　为了在存在和不存在DPY30的情况下测量RNAPII相互作用的差异 ，将1×108 DPY30 -MAD -MASED细胞与生长素孵育8小时
，以诱导DPY30降解（8 h样品），而1×108 DPY30 -MAID细胞用DMSO处理为DMSO（0小时样品） 。收集细胞并将其冷冻在干冰上 ，并保持在-80°C直至免疫沉淀（IP）
。The cells were thawed at 37 °C for 30 s lysed in 1.6 ml of ice cold 50 mM EPPS pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100 with cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail (1 tablet per 20 ml of lysis buffer), 1:100 of Sigma-Aldrich phosphatase inhibitor 2 and 3 cocktails and 250 U μl−1 of苯甲酶。将裂解液在冰上孵育5分钟以允许DNA消化，以20,000克离心5分钟
，以去除不溶性材料，并以2,000g的1分钟过滤1分钟 。然后使用二甲酸酸测定法估计蛋白质的浓度
。对于每个样品（DMSO和生长素处理的细胞） ，进行了六个免疫沉淀反应：三种抗RNAPII抗体（ABCAM
，ABCAM，AB817 ，8WG16）
，三个具有IgG对照（Invitrogen，02-6102）。用3.3 g L-1裂解物浓度和5μg抗体与蛋白质G Sepharose结合的1 mg裂解物进行每个反应（Sigma-Aldrich ，17-0618-02） 。在4°C下以1,100 rpm的振动在4°C下进行孵育1小时
。然后将珠子转移到1100滤板（Orochem Technologies）中
，并使用真空歧管用冰冷的50 mm EPP pH 7.5，150 mm NaCl洗涤五次。然后 ，用20ngμl -1胰蛋白酶和1ngμl -1 lysc在每个孔中的珠子中添加了18μl10mM EPP pH 8.5
，在2,000 rpm的37°C下将1ngμl -1 lysc添加到37°C的珠子中 。然后将部分摘要收集到96孔PCR板中，然后在室温下过夜以完成消化。然后 ， 将4μl的22 g l -1 11 plex TMTPRO标签添加到每个样品中
。然后将样品拉出，并将合并样品的20μl列为一旁
，其余样品使用高pH相反的肽分级套件将其分配为六个分数，如制造商所建议的那样。将馏分连接为四个部分（第一和第五部分 ，第二和第六等分）
，并在速度VAC中蒸发（将0.5μl的DMSO添加到每个样品中以防止完全蒸发），并重悬于20μl0.1％TFA中 。为了进行数据采集 ，通过使用直接注射模式下的纳米含量2μM粒径
，75 mm×500 mm的easyspray柱分析了4.5μl未分流样品和每一个分数
。使用以下梯度在300 nl min -1的缓冲液A（水中0.1％甲酸）和缓冲液B（乙腈中的0.1％甲酸）中分离样品：10分钟内为0-7％，在92分钟内为7–30％ ，在92分钟内
，30-60％在18分钟内用95％B在95％B中洗涤，持续10分钟 ，在400 nl -1 min -1 nl -1 -1。将色谱柱保持在60°C 。使用MS3 SPS在Orbitrap Fusion Lumos仪器上分析洗脱肽
，并使用仪器制造商建议的TMT11 PLEX分析的设置进行了以下修改：（1）MS2的CID NCE设置为32；（2）MS3的HCD NCE设置为45；（3）C系列排除被禁用，因为在C系列排除节点中未启用TMTPRO试剂
。周期时间设置为3 s ，动态排除时间设置为15 s。 　　CRISPR – CAS9技术用于针对5'端的内源性RPB1，其中用编码FLAG AFFINETIONT-TAG和APEX2（flag-apex2）的盒式盒子靶向内源性RPB1
，从而导致RPB1在其N末端融合到FLAG-APEX2 。DPY30 – MASIR1 E14细胞与ESPCAS9质粒共转染和含有纯霉素耐药性选择基因，P2A自切除位点的供体质粒 ，Flag-apex2与相应靶基因相对应的同源臂侧翼
。在补充表1中提供了用于靶向RPB1的指南RNA和同源臂的序列。表达APEX2的细胞与4 mM Biotin-phenol试剂（IRIS Biotech
，LS-3500.1000）孵育2 h，持续2 h ，在标签反应开始之前 。用PBS（带有Ca ++和Mg ++）洗涤细胞
，并在室温下在PBS中加1 mM H2O2启动标记反应
。通过用含有10 mM叠氮化钠，10 mM抗坏血酸钠和5 mM trolox在PBS中的淬灭剂溶液清洗三次细胞终止反应。 　　如先前所述的53进行了一些修饰 ，制备了染色质级分 。简而言之
，在缓冲液A（10 mM碳酸氢铵pH 8.0 、1.5 mM MGCL2
、10 mM KCl，10 mM KCl ，10 mM抗坏血酸钠
，5 mM Trolox，10 mM Trolox ，10 mM磷酸钠，1倍蛋白酶抑制剂鸡尾酒和0.2％NP40）的缓冲液中裂解细胞。然后通过离心和化学裂解在缓冲液C（20 mM碳酸氢铵pH 8.0
，420 mm NaCl2，20％（v/v）甘油 ，2 mM mgcl2
，0.2 mm EDTA，0.1％NP40 ，0.1％NP40
，10 mm sodium sodium sodium sodiuium sodyery，5 mmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmMMMMMMMMMMMMMMM ，抑制剂鸡尾酒和0.5毫米DTT）
。在4°C下以20,800克离心45分钟。颗粒包含不溶性染色质馏分
，由与染色质紧密结合的DNA和蛋白质组成 。为了溶解染色质颗粒，加入了750 U苯甲酶（Sigma-Aldrich） ，然后在冰上孵育10分钟
，在室温下搅拌5分钟
。收集澄清的裂解物，并使用Brad Bradford试剂对蛋白质浓度进行定量。将大约4毫克的SILAC重或轻细胞裂解物混合1：1 ，并在4°C的旋转轮上与50μl链霉亲和素磁珠（Pierce，88817）一起孵育过夜 。将珠子用Ripa缓冲液洗涤四次
。 　　将生物素下拉的洗脱液转移到新鲜的微型试管中。将Nupage样品加载缓冲液添加到珠子中
，并在90°C加热5分钟 。使用磁性机架将珠子与蛋白质分开
。然后将上清液以SDS-PAGE凝胶（Bis-Tris，4-12％）运行 ，足以将样品进入凝胶。切除凝胶切片
，洗涤，用DTT还原 ，用碘乙酰胺烷基化
，并在37°C下用胰蛋白酶消化过夜（参考文献54） 。如前所述，制备自制的C18 stagetips ，并用50μL甲醇洗涤
，50μl的70％乙腈/0.1％三氟乙酸洗涤50μl，并在1,000g处洗涤两次50μL三氟乙酸洗涤
。然后将肽加载到Stagetips上 ，并用50μl0.1％甲酸洗涤
，并用60μl的70％乙腈/0.1％甲酸洗脱。然后，使用SpeedVac对样品进行真空离心 ，并在0.1％的甲酸中重构LC – MS/MS，并使用微毛细血管LC-MS/MS使用纳米含量系统（Waters）通过微毛细血管LC – MS/MS进行分析
，并用100μm的内部直径×10 cm长度C18列（1.7μm）（1.7μmBehers）cmmm contress c c18 contress conters c c18 conters a a 180 cmmm conters a 。耦合到Q-激活加质谱仪（Thermo Fisher Scientific）。使用4 h乙腈梯度（0.1％甲酸）在300 NL min -1下洗脱肽
。Q-激活加质谱仪以数据依赖性的MS/MS采集模式以70,000质量分辨率进行自动，数据依赖性的MS/MS采集模式（380-1,600 m/z） ，最多可用于从每个调查扫描中选择的十个最激烈的峰进行十个同时进行的MS/MS扫描。在轮廓模式下进行了调查扫描
，并以17,500个分辨率以1.5 AMU的隔离窗口以1.5 AMU，归一化碰撞能量为27；对于MS1和5×104的AGC设置为1×106 ，最大为50 ms的MS2；无分配
，+1和大于6的电荷排除启用了15 s的动态排除 。 　　如前所述32，我们进行了ttchem-seq
。简而言之 ，在指定的时间点
，在生物重复物中处理了10 cm盘中的10 cm盘子的细胞。经过指定的处理后，我们用1 mM 4SU补充了治疗培养基 ，并将其代谢标记为10分钟 。将细胞裂解在Qiazol（Qiagen
，79306）中，并根据制造商的说明分离总RNA ，然后再添加100 ng的RNA Spike-In与Qiazol一起添加100 ng
。使用4SU从果蝇S2细胞中提取RNA尖峰，将其代谢标记20分钟。100μgRNA（总体积为100μl）通过添加20μl的1 M NaOH碎片
，并在冰上放置20分钟 。根据制造商的说明，通过添加160μl的0.5 m Tris pH 6.8添加了碎片 ，并使用微型生物旋转P-30凝胶柱（Biorad
，7326223）进行了两次清洁
。4su延伸的生物素化在总体积为250μl中进行，含有10 mM Tris-HCl pH 7.4、1 mM EDTA和5 mg MTSEA Biotin-XX接头（Biotium ，BT90066）在黑暗的室温下在室温下30分钟。然后
，通过苯酚 - 氯仿提取纯化RNA，通过在65°C下孵育10分钟 ，并将其添加到200μlμmacs链霉亲素微粒（Milentyl
，130-074-101）中 。将RNA与珠子在室温下孵育15分钟，并将珠子应用于μmacs磁分离器的磁场中的μColumn
。用拉出洗涤缓冲液（100 mm Tris-HCl ，pH 7.4 、10 mm EDTA
，1 M NaCl和0.1％Tween-20）将珠洗涤两次。通过添加100 mM DTT将生物素化的RNA洗脱两次，并使用Rneasy MineLute试剂盒（Qiagen ，74204）使用1,050μl乙醇（≥99％）每200μl乙醇（≥99％）加入后加入700μL的RLT料理后，将RLT的RNA添加到700μl
，从而沉淀出较少200核苷的RNA 。然后将共有200 ng的纯化的4su标记的RNA用作Truseq绞合的总RNA试剂盒的输入（Illumina，20020596） 用于图书馆准备。如前所述32 ，根据制造商的说明对图书馆进行了修改
。使用高灵敏度DNA试剂盒对贴纸（Agilent）进行10个PCR循环的放大
，并在NextSeq 550（Illumina）系统上进行配合和配对末端测序。 　　对于DRB/TTCHEM-SEQ，将细胞在100 µM DRB（Sigma-Aldrich ，D1916）中孵育3.5 h 。然后将细胞在PBS中洗涤两次
，并添加预热的新鲜DRB培养基以重新启动转录
。在添加Qiazol之前，将RNA用1 mM 4sU在体内标记10分钟 ，该氮唑用于在所需的时间点停止反应。 　　我们对原始协议进行了少量修改
，进行了MNET -SEQ27 。将FLAG表位标签添加到DPY30 -MASED -MASED DEGRON DEGRON细胞（RPB1 – APEX2细胞）中的第一个RNAPII亚基（RPB1）的N末端
。在实验的前一天，将细胞播种 ，第二天每样品获得1亿个细胞。在提取结合染色质的RNAPII之前
，我们将每种处理的烧瓶随机分配给每种处理，并仅使用DMSO或生长素配体处理 。The cells were first washed with ice-cold DPBS, resuspended in 4 ml of ice-cold HLB + N buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 0.5% (v/v) NP-40 and 1× proteinase inhibitor) and incubated on ice for 5 min, then cells were scraped to a 15 ml centrifugate tube.然后用1 ml HLB+NS缓冲液（10 mM Tris-HCl PH 7.5 ，10 mM NaCl，2.5 mm MgCl2
，0.5％（V/V）NP-40，10％（w/v）蔗糖和1×蛋白酶抑制剂）和核列中的中心c.在400G上进行
。然后除去上清液和膜碎屑 ，并将核重悬于125μl的NUN1裂解缓冲液中（20 mm Tris-HCl PH 8.0
，75 mm NaCl，0.5 mm EDTA ，0.5 mm EDTA
，50％（V/V/V）甘油和1°×蛋白酶抑制剂（我们添加了1.2 me），将其添加到1.2 mehek（我们）。300 mM NaCl ，0.2 mM EDTA
，7.5 mM MGCL2，1％（v/v）NP-40 ，1 m尿素和1倍蛋白酶抑制剂）以沉淀染色质
，并在偶尔涡旋上在冰上在冰上孵育15分钟 。然后将裂解物在4°C下以16,000克离心10分钟，以颗粒染色质
。然后将染色质颗粒用1×MNase缓冲液洗涤 ，然后用50 U MNase（NEB，M0247s）在37°C下用1,400 rpm在Thermomixer上消化2分钟。通过添加5μl500mM EGTA（最终浓度为25 mm； Thermo Fisher Scientific
，50-255-956）并转移到冰上来停止消化 。然后将反应在4°C下以16,000g离心5分钟，然后将上清液用1 mL Net-2缓冲液稀释。 （50 mM Tris-HCl pH 7.4 ，150 mm NaCl
，0.05％（v/v）NP-40）每分，而N末端FLAG-RNAPII IP的每个样品合并
。我们添加了50μl的抗flag M2亲和力凝胶（Sigma-Aldrich ，A2220）
，并在寒冷室中孵育1小时。接下来是用Net-2缓冲液洗涤8次，并用500 µL含有1×T4多核苷酸激酶（PNK）缓冲液（NEB ，M0201L）和0.1％（V/V）Tween-20的PNKT缓冲液洗涤（Thermo Fisher Scientific
，bp337-100） 。将珠子在含有1×PNK缓冲液的100 µL PNK反应混合物中孵育，0.1％（v/v）Tween-20 ，1 mm ATP和T4 PNK 3''PNK 3'磷酸酶减去（NEB
，M0236L）在37°C下10分钟
。我们通过在提取缓冲液中添加350μl350μl的缓冲液RLT和1 ng碎片的果蝇S2 mRNA尖峰来洗脱RNA。接下来，使用RNeasy Plus Mini Kit和Rneasy MineLute清理套件从动物细胞中纯化miRNA后 ，根据制造商的协议将短尺寸的免疫沉淀RNA片段（在200个核苷酸下）进行了大小选择（低于200个核苷酸），并根据制造商的协议从洗脱液中纯化（Qiagen
，74204），并在14μlepeepepeepepepepleepepepepepepepepepepepepepeptiance中 。我们在贴纸上检查了1μl洗脱的RNA的RNA质量 ，并使用NEBNEXT多重小RNA库准备套件（NEB
，NC0477293）进行了NGS库制备
。两者都是根据制造商的协议进行的，其输入材料低 ，图书馆放大步骤有14个PCR周期。我们使用君主试剂盒（NEB）清理并浓缩了DNA
，并在6％TBE凝胶上分离了库，并通过在147和307核苷酸之间进行涂片（根据Quick-Load PBR322 DNA-MSPI梯子（NEB）） ，进行了尺寸选择 。这些库是使用贴纸对质量检查和量化的
。在NextSeq 550（Illumina）系统上使用配对末端测序进行汇总并测序样品。 　　对于由MNET – SEQ确定的启动子型RNAPII半衰期实验
，从用DMSO或生长素预处理的细胞中分离染色质，然后在DMSO/AUXIN的存在下与1 µM Triptolide孵育0
、5、10 、20或40分钟 ，并使用MNET-SEQ进行分析 。用微球菌核酸酶（MNase
，Scissor）消化染色质，以释放RNAPII从不溶性染色质中散布RNA ，然后使用抗Flag-RNAPII抗体进行免疫沉淀
。 　　在Proteome Discoverer v.3.1中分析了数据。使用鼠标搜索引擎使用鼠标Uniprot数据库进行数据库搜索，该数据库仅包含审核的条目和规范的同工型（于2019年10月10日检索） 。将氧化（M）设置为可变修饰
，而TMT则将其设置为固定修饰。最多允许两次错过的分裂
。前体和片段质量公差分别为10 ppm和0.6 da。肽光谱匹配（PSM）通过渗透剂验证，具有0.01后误差概率阈值 。只有具有隔离干扰的PSM <25% and at least 5 MS2 fragments matched to the peptide sequence selected for MS3 were considered. The quantification results of PSMs were combined into protein-level quantification using the MSstatsTMT R package56. Only proteins with at least three peptides were reported. To identify interactors, we performed differential abundance analysis between the IP samples and their corresponding controls (that is, 0 h IP was compared to 0 h IgG control and 8 h IP was compared to 8 h IgG control). A protein was considered to be an interactor if in one or both comparisons its levels were statistically significantly different (Q ≤ 0.05, limma test, with P values adjusted by the Storey method) and at least twice higher in IP reactions than in the corresponding IG control (Supplementary Table 3). 　　All SILAC/MS data were processed using the MaxQuant software (Max Planck Institute of Biochemistry; v.1.5.3.30). The default values were used for the first search tolerance and main search tolerance—20 ppm and 6 ppm, respectively. Labels were set to Arg10 and Lys8. MaxQuant was set up to search the reference mouse proteome database downloaded from UniProt on 9 January 2020. MaxQuant performed the search assuming trypsin digestion with up to two missed cleavages. Peptide, site and protein false-discovery rate (FDR) were all set to 1% with a minimum of one peptide needed for identification but two peptides needed to calculate a protein level ratio. The following modifications were used as variable modifications for identifications and included for protein quantification: oxidation of methionine, acetylation of the protein N terminus, ubiquitination of lysine, phosphorylation of serine, threonine and tyrosine residues, and carbamidomethyl on cystine. Intensity values measured in all replicates were log2-transformed (Supplementary Table 4), P values were computed using Fisher’s tests and corrected using Benjamini–Hochberg FDR correction. All raw MS data files have been deposited to the ProteomeXchange Consortium (and PXD039176). The Gene Ontology term enrichment analysis was performed using Enrichr online tool (https://maayanlab.cloud/Enrichr/), STRING (https://string-db.org) and clusterProfiler57. 　　The sequenced reads were demultiplexed using bcl2fastq (v.2.19.0.316), and basic quality control was performed on the resulting FASTQ files using FastQC (v.0.11.8). FASTQ reads were mapped to the GRCm38 (mm10) genome using Bowtie2 (v.2.4.1) using the standard settings. The resulting SAM files were converted to BAM files using the SAMtools (v.1.10) view command, after which the BAM files were sorted and indexed, and potential PCR duplicates were removed using the rmdup function. DeepTools (v.3.3.0) was used to generate occupancy heat maps, and the resulting normalized occupancy matrix was used as input for public R scripts to generate average profile plots and to calculate processivity indices. In brief, the BAM files were converted into BigWig files using the bamCoverage function (bamCoverage -p 8 --normalizeUsing RPGC --effectiveGenomeSize mm10 --centerReads -e --scaleFactor X --blackListFileName mm10.blacklist.bed). For comparison, quantitative ChIP–seq data using spike-in normalization were used, normalization to the Drosophila S2 spike-in was performed at this stage according to the manufacturer’s instructions (Active Motif, 61686; https://www.activemotif.com/catalog/1091/chip-normalization). The computeMatrix function was used to quantify the occupancy of reads across the specified intervals, and the plotProfile and plotHeatmap functions were used to plot the data. Reproducibility of replicates is shown in Supplementary Fig. 3. 　　Gene and 3′ untranslated region (UTR) annotations were obtained from the UCSC table browser (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables, mm10 vM14 3′ UTR). Adapters were trimmed from raw reads using cutadapt through the trim_galore wrapper tool with adapter overlaps set to 3 bp for trimming. For Quant-seq, concatenated fastq files were trimmed for adapter sequences, and masked for low-complexity or low-quality sequences using trim_galore, then mapped to the mm10 whole genome using HISAT v.2.2.1 with the default parameters. The number of reads mapped to the 3′ UTR of genes was determined using featureCounts. Raw reads were normalized to CPM. SLAM-seq analysis was performed as previously described58 using the SlamDunk package59. Trimmed reads were further processed with SlamDunk (v.0.3.4 16). The ‘Slamdunk all’ command was executed with the default parameters except ‘-rl 74 -t 8 fastq.gz -n 100 -m -mv 0.2 -o Slamdunk2’, running the full analysis procedure (slamdunk all) and aligning against the mouse genome (GRCm38), filtering for variants with a variant fraction of 0.2. Unless indicated otherwise, reads were filtered for having ≥2 T>C转换
。其余参数留为默认值。 　　差异基因表达的分析仅限于至少一个条件下≥10个读取的基因 。使用DESEQ2和默认设置进行≥2t> c转换的原始读数计数进行差异基因表达调用 ，并在相应的总mRNA读取中估计全局归一化的尺寸因子
。下游分析仅限于通过所有内部滤波器通过DESEQ2进行FDR估计的基因。使用具有重要基因的R中的GGPLOT2封装可视化差异基因表达的图（P值P值< 0.05, |log2FC| ≥ 1). Reproducibility of replicates is shown in Supplementary Fig. 3. 　　Reads were demultiplexed using bcl2fastq, then trimmed for adapter content with cutadapt (-m 10 -e 0.05 --match-read-wildcards -n 1), and mapped with STAR to the GRCm38 (mm10) genome assembly. Further data processing was performed using the R/Bioconductor environment. Coverage tracks for further analysis were restricted to the last nucleotide incorporated by the RNAPII in the aligned mNET–seq reads as described60. To calculate the half-life of paused RNAPII for each gene by mNET–seq, RNAPII density was calculated in a 300 bp window downstream of the TSS. RNAPII time-course measurements were fitted into an exponential decay model using the RNAdecay R package (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/RNAdecay.html). We selected genes fulfilling the current criteria: (1) detectable RNAPII levels (reads per kilobase of transcript, per million mapped reads >1）
，（2）NO triptolide（0分钟）条件下的最高RNAPII密度和（3）重复之间的较低方差（σ< 0.05). Genes fitting the above criteria (n = 6,338) were used to calculate the RNAPII half-life. Reproducibility of replicates is shown in Supplementary Fig. 3. 　　Paired-end reads were demultiplexed using bcl2fastq. TTchem-seq raw data were processed essentially as described previously32. Raw reads were aligned to the mouse mm10 genome assembly using STAR. Mapped reads with a mapping quality score <10 were discarded with SAMtools. All further processing was performed using the R/Bioconductor framework. Antisense bias, sequencing depth and cross-contamination rates were calculated as described previously32. Reads were mapped to transcription units, which represent the union of all annotated UCSC RefSeq isoforms per gene. The number of transcribed bases per transcription unit was calculated as the sum of the coverage of evident (sequenced) fragment parts (read pairs only) for all fragments in addition to the sum of the coverage of the inner mate interval if not entirely overlapping a RefSeq annotated intron (UCSC RefSeq GRCm38). Computational analysis DRB/TTchem-seq data were processed using a previously published protocol32. In brief, reads were aligned to human GRCm38 (mm10). Read depth coverage was normalized to account for differences between samples using a scale factor derived from a spike-in aligned and counted against Drosophila melanogaster. Biological replicate alignments were combined for the purpose of visualization and wave-peak analysis to increase read-depth coverage. 　　A set of non-overlapping protein-coding genes of >60 kb和 <300 kb was selected for wave-peak analysis. A meta-gene profile was calculated by taking a trimmed mean of each base-pair coverage in the region around the TSS. This was further smoothened using a spline. Wave peaks were called at the maximum points on the spline, with the stipulation that the peak must advance with time before being subjected to manual review. Elongation rates (kb per min) were calculated by fitting a linear model to the wave-peak positions as a function of time. For elongation-rate analysis, the following criteria were used to filter genes: The 0 min timepoint DMSO control sample was required to show expression of the gene (mean expression of >tt-seq 100 rpm），必须在暂停峰区域的10 kb内具有一个波峰以去除伪影 。通过要求0分钟样品中的波峰在10分钟的时间点波峰中的波峰小于波峰 ，而10分钟样品中的波峰在20分钟的时间点中
，在20分钟的波峰中，在DMSO对照样品中显示了时间过程的转录增加的基因 ，而在20分钟中的波峰则小于30分钟时的波峰
。这导致了855个基因的鉴定
，以通过将波峰位置除以时点来计算样品的伸长率。复制的可重复性在补充图3中显示 。 　　实验的统计细节可以在图传说和方法中找到
。图2中的蛋白质印迹。1b，c ，f – h
，3a和5b，c ，j独立执行了三次，结果相似
，并且在扩展数据图中进行了蛋白质印迹 。8c，f ，g和9c
，E作为生物学独立实验的两倍。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得
。