除了在18°C升高的跨tang​​o tango tracing Flies外
，在12 h/12 h LD周期下在标准玉米面培养基上饲养苍蝇
。在Eclosion后1-2天，无论性别如何 ，苍蝇被用于贴片钳记录。RH6-HID的记录
，RPR苍蝇在Eclosion后的第三天进行 。 　　蝇源的细节在补充表3中列出，并且在补充表1中列出了Fly基因型
。 　　为了生成RH6-HID ，RPR构建体
，从添加到引物中的Hindiiii（5'）和Noti（3'）位点的Rh6 – EGFP Flies（BDSC7461）中扩增了2.9 kilobase增强子。引物序列如下：前传：5'-GCACCCGTGGCCAGGCGCCGCAGCCAGCTTATATATGAACATGTGCCTCTCATTGAATC-3';反向：5'-TCGATCCCCGGGCGAGCTC GGCGCCCACCACCACCCCATCATTTGCTCAGTGCATCT-3' 。从UAS-HID，NOTI（5'）和XBAI（3'）位点添加到引物中的UAS-HID ，RPR放大了头部不足2A（HID
，RPR）序列
。引物序列如下：前传：5'-AccagtaccagccattcagcgcgcgcgcgcgcgccaCcAccAccAtggccgtgcgtgcccttt-3';反向：5'-GTTATTTTAAAAAAAAACGATTCATTCATCATCATTGCGATGGCTTGCGATA-3'。然后将RH6-HID，RPR片段插入到puastattb载体中 ，然后将P10序列插入HID
，RPR序列的下游 。为了产生转基因苍蝇，将上述构建体注入并通过PHIC31介导的基因整合整合到ATTP5着陆点中
。 　　为了生成ORT-QS构建体 ，用Hindiii（5'）和添加到引物中的Noti（3'）位点从ORTC1-3-GAL4 Fly38放大ORT启动子。底漆序列如下：前传：5'-Acccgtggccgccgcagccgccagcccaaaacaagtaaaaaaaaaaaaaaagtttgc-3';反向：5'-GGTGTGTGTTCATTTTGCGGCCGCCGCTTTAATGTGAGCTTTTCTTCTGTGTGG-3' 。然后将启动子片段插入到puastattb载体中，并将​​QS-P10序列插入ORT启动子的下游
。为了产生转基因苍蝇
，将上述构建体被注入并通过PHIC31介导的基因整合整合到VK00005着陆点中。 　　为了生成Lexaop2-Post-GFP11构建体，从UAS-POST-GFP1-10飞行中放大了小鼠神经素1（NLGN1）片段序列 ，并在引物中添加了Noti（5'）位点 。引物序列如下：前传：5'-CTTATCCTTCTTCAGGCGCGCGCCGCAAAAATGGCACTTCCTAGATGTATGTATGTGGCCTA-3';反向：5'-cacatattcgtgcagcaccatgtggtgcggcgggcggcgtcatcagcatcagcttcttctgtgaaag-3'。Telencephalin (TLN) and the linker sequence was amplified from the UAS-post-GFP1–10 fly, with XbaI (3′) sites added to the primers: Primer sequences were as follows—forward: 5′-GGTGCTGCACGAATATGTGAACGCTGCTGGCATCACAGGGACGGGCGGATCTGGCGGATCT-3′;反向：5'-GTTATTTTAAAAAAAACGATTCATCATCAGATCAGGAAGAGAGTGTCAGCTGGATA-3'
。然后使用上述两个序列作为模板扩增NLGN1-GFP11-TLN序列。引物序列如下：前传：5'-CTTATCCTTCTTCAGGCGCGCGCCGCAAAAATGGCACTTCCTAGATGTATGTATGTGGCCTA-3';反向：5'-GTTATTTTAAAAAAAACGATTCATCATCAGATCAGGAAGAGAGTGTCAGCTGGATA-3' 。 　　然后将上述序列插入Lexaop2-IVS-P10载体（由Addgene构建
，36431）
。为了产生转基因苍蝇，然后通过PHIC31介导的基因整合注入上述构建体并整合到VK00005着陆点中。 　　UAS-CHAT-SGRNA和UAS-VACHT-SGRNA构建体的设计是通过将单个指南RNA（SGRNA）插入基于PACU2的PMT：SGRNA3×向量中 ，用大米传递RNA用于分离不同的SGRNA 。 　　如先前所述
，进行了苍蝇解剖，制备可视化和斑块钳记录
。12,44。 　　AMA神经元和时钟神经元表现出强大的节奏爆发活动44 。为了减少对光引起响应的分析的干扰 ，我们选择了具有弱节奏爆发活性的电压记录
，或通过扁平基线来平均为当前记录的15个以上的痕迹
。Data were processed and visualized with Clampfit v10 (https://www.moleculardevices.com/), Matlab R2020b (https://www.mathworks.com/products/matlab.html), Origin 2018 (https://www.originlab.com/) and GraphPad Prism 9（https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/）。 　　至于AMA神经元上的录音，我们在附件髓质区域中选择了十对vt037867标记的神经元 ，用于贴片钳记录
，它们的形态特征与AMA神经元具有相同的形态特征，基于其单细胞形态 ，其单细胞形态是MCFO标记（扩展数据 。图4C）
。此外，我们证实了这组神经元的确是AMA神经元
，基于其单细胞形态，在整个细胞记录后 ，神经益元注射12通过斑块录制电极揭示了这组神经元（扩展数据图4D）。 　　与上面的单个贴片钳记录相似地进行了双贴片钳记录 。根据GFP表达鉴定了两个靶神经元
，并在贴片钳记录之前暴露了其细胞体。细胞体暴露后，将两个记录电极依次放置在靶神经元上方约50μm的位置
。然后 ，通过两个电极依次将靶神经元一个一个一个一个逐渐修补。 　　如前所述进行光刺激12 。光源是由LED驱动器（LED D1B和DC 4100
，Thorlabs）控制的470 nm LED（M470L4，Thorlabs） ，并通过液体照明连接到A1 MP+显微镜的荧光端口
。将光点（直径为400μm）投射到制剂上
，大致覆盖了同侧复合眼。在实验之前和之后，用功率计（1936-R ，918D-ST-UV
，纽波特）校准光强度 。在电生理记录和钙成像中，在光子μm -2 s -1的单位中报道了光强度
。例如 ，对于单色470 nm光斑（直径为400 µm），3 MW等于5.65×107光子μm-2 s-1。短暂或短脉冲通常用于我们的电生理记录和钙成像中 。在细胞记录和行为研究中
，无法达到相同的光条件
。 　　从大脑制备中将三桶管（SF77B，华纳仪器）放置约200μm ，并由步进器（SF77B
，Warner Instruments）控制。外部盐水通过中桶进行灌注以覆盖大脑的制备，侧桶中的药物使用毫秒内实现的阶梯电机切换以覆盖制剂 。药物施用的时间和持续时间由夹具和Digidata 1440a控制
。使用了以下内容：100μMCDCL2（20899 ，Fluka Sigma-Aldrich）51
，50μMMCA（M9020，Sigma-Aldrich）51 ，2 mm CIM（C4522
，Sigma-Aldrich）52，1 mmmmmmmmmmmmmmmmMmmmmmine（H7250 ，h7250
，sigma-achma-achmma-aldreich）5252525252.A.AN65（16）Sigma-Aldrich）53。注意，除了某些电压门控钾通道外 ，CD2+是电压门控钙通道的非特异性阻滞剂 。根据https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/mers/maxchelator/camgatpegta-nist.htm提供的程序来计算自由钙浓度。 　　Cschrimson在目标神经元中用特定的GAL4驱动器表达
。所有亲本蝇均在含有0.4毫米全反视网膜（ATR，R2500
，Sigma-Aldrich）的食物上饲养，后代在ECOLOSION后3天内还喂了0.4 mm ATR食品。将蝇小瓶保持在黑暗中 ，以避免ATR变性和Cschrimson激活 。在昏暗的蓝光下解剖了孤立的大脑（无复合眼）
，并在贴片钳记录期间使用了625 nm LED（M625L4，Thorlabs）进行光遗传学刺激
。 　　用于体内成像的腔室是根据已发布的版本54修改的。腔室的底部由一个不锈钢板（20 µm厚） ，带有矩形孔（800μm×1,200μm） 。将苍蝇在冰上麻醉1分钟
，然后迅速插入室孔中，背侧大脑面向上
。用低熔点石蜡稳定腿和胸部。头部向下弯曲以暴露于后大脑 ，使化合物的眼睛在腔室下方 。腔室充满了果蝇盐水
，在背脑中打开一个小窗户，以暴露R8感光体的轴突末端
。 　　成像是使用配备Maitai DeepSee Ti：Sapphire Ultrafast激光（Spectra-Physics）的Nikon A1 MP+显微镜进行的。GCAMP6F的激发是通过920 nm的两光子激光器来实现的 ，并以8 Hz的DU4 PMT检测器获取图像（256×128像素分辨率） 。通过冷凝器将全场光刺激（460 nm）投射到化合物的眼睛上
，其持续时间和时间由D1B LED驱动器通过NIS-Element（https://www.microscope.healthcare.healthcare.nikon.com/）和夹具（分子设备）控制
。使用NIS元素分析了手动选择区域（ROI）的荧光（ΔF/F）的相对变化。 　　记录室类似于体内成像室，除了较小的腔室孔（500μm×500μm） ，该腔室比复合眼大一点 。剖析了具有完整复合眼睛的苍蝇大脑，并将一只复合眼插入室孔中并暴露在空气中。用真空润滑脂（陶•康宁）稳定了另一只复合眼
。将半球形屏幕（直径40毫米）放在腔室下方
，裸露的化合物眼面朝屏幕中心。将光斑投射到屏幕上，通过反射镜从后投影仪投射到屏幕上 。视觉刺激的持续时间和时间由MATLAB控制
。使用460 nm的光刺激来避免干扰荧光成像检测器。GCAMP6M报告的钙反应是用配备有25倍水浸泡物镜的Nikon A1 MP+显微镜获取的 ，并通过920 nm的两光激光激光进行荧光激发 。 　　VT037867-GAL4
，UAS-TDOMATO/UAS-MSPA-GFP用于光活化（PA）GFP55 AMA神经元的标记
。在腔室中稳定了体内脑部制剂，后脑面向向上 ，以暴露tdtomato标记的AMA神经元的骨膜连相轨道。使用Nikon A1 MP+显微镜和720 nm的两光子激光器实现PA-GFP的光活化 。连合条轨道的光激活周期包括30个光激活脉冲
，每个光激活脉冲的时间为每像素为4.8μs，间隔为8​​ s
。该周期用30秒的间隔重复10次 ，以进行完整的光激活发作。在等待GFP扩散的10分钟后
，将大脑制剂与前侧的前侧重新定位，并使用920 nm的两光激光器获得光活化细胞体的图像 。 　　首先在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中解剖蝇 ，并在4％（w/v）多聚甲醛（PFA
，157-8，电子显微镜科学）中固定1小时
。然后在PBST中将大脑和复合眼睛洗涤3次（每次洗涤15分钟）（PBS中的0.5％V/V Triton X-100）。将固定的样品与渗透 - 遮盖缓冲液（10％正常山羊血清和PBS中的2％Triton X-100）在室温下孵育2小时 ，然后与一抗初级抗体（Rat Anti Anti Anti抗体，1：100
，T 。Wang; T. Wang; Rabbit Anti-Ha，Rabbit Anti-Ha ，1：200
，3724，Cell Signal Migals Antbi Mouse Anti; Mouse Anti; Mouse Anti;抗PDF ，1：4,000
，PDF C7，DSHB;抗V5 Dylight 549 ，1：100
，MCA2894D549GA，Bio-Rad;在PBST中洗涤3次后 ，将样品与继发抗体孵育（山羊抗鼠Alexa Fluor 568
，1：200，AB175710 ，ABCAM； ABCAM；山羊抗兔alexa Fluor 488，1：200
，A27034山羊抗小鼠Alexa Fluor 568，1：200 ，A11004
，Thermo Fisher）在4°C过夜。将抗体在抗体稀释缓冲液中稀释（1％正常山羊血清和0.25％Triton X-100在PBS中）
。将样品洗涤3次，然后再安装在聚焦（FC101 ，Cedarlane Labs）中。 　　对于AMA神经元的单细胞标记
，将VT037867-GAL4 FLIE与MCFO-1 FLIES交叉56 。将苍蝇在25°C下饲养，并将1天大的成年后代放在空的小瓶中 ，并在37°C的水浴中孵育3分钟
，以诱导Flippase的表达
。在热休克后的第三天，将苍蝇固定为免疫染色。 　　在PBS中剖析飞脑 ，并在冰上固定4％PFA 。然后将大脑在PBST中洗涤3次
。在室温下
，将固定的大脑与穿透性 - 烧毁缓冲液一起孵育2小时。 　　对于单细胞标记，将大脑与Dylight549偶联的小鼠抗V5（1：100 ，MCA2894D549GA，Bio-Rad）在4°C孵育过夜 。为了与PR8和YR8光感受器共同标记
，将大脑与Dylight647偶联的小鼠抗V5（1:10，MCA1360A647 ，Bio-Rad）在4°C下孵育过夜
。对于两细胞标记
，首先将大脑与兔抗HA初级抗体（1：100，3724 ，细胞信号技术）在4°C下孵育过夜。在室温下用PBST洗涤3次后
，将大脑与山羊抗兔IgG偶联的Alexa Fluor 488（1：200，A27034 ，Thermo Fisher）和Dylight549结合的小鼠抗-V5（1：100）孵育24小时 。然后将大脑在PBST中洗涤3次
，并安装在聚焦中
。 　　我们使用交点策略来识别R8光感受器和AMA神经元使用的神经递质。将flp敲入蝇（CHAT-FLP，VGLUT-FLP ，TRH-FLP
，TH-FLP，GAD1-LEXA ，LEXAOP-FLP，VGAT-FLP
，VGAT-FLP和LEXAOP-FLP）与RH5-GAL4，RH6-GAL4交叉；UAS-FRT-Stop-frt-GFP苍蝇 。与UAS-FRT-Stop-frt-GFP交叉Chat-flp Flies；VT037867-GAL4苍蝇。蝇在25°C下饲养 ，并在eClose后2-3天内进行解剖
。将固定样品用PBST洗涤3次
，然后将其安装在聚焦中，而无需免疫染色。 　　我们使用了UAS-MYRGFP ，Quas-Mtdomato（3×ha）； trans-Tango Flies进行R8光感受器和AMA神经元的顺行跟踪 。后代果蝇在ECLOSION后18°C保持在12 h/12-h LD循环中
，并在Eclosion后10或更多天进行解剖
。我们使用了ORT-Q来标记R8光感受器的非目标。然后将大脑固定在4％PFA上，在冰上固定1小时 。为了直接观察荧光 ，用PBST洗涤3次后将样品安装在聚焦中
。 　　对于与时钟神经元共贴的标签
，将整个苍蝇固定在ZT20上，PFA为4％ ，在PBS中固定0.1％Triton X-100在室温下持续2.5 h。然后用PBST洗涤苍蝇
，并在PBST中解剖 。随后，将大脑与10％的正常山羊血清和0.1％Triton X在室温下在PBS中孵育4小时 ，然后在4°C下在4°C下与兔抗TIM（1：250）过夜，或与小鼠抗PDF（1：4,000
，PDF C7，DSHB）一起孵育
。用PBST洗涤3次（每次洗涤20分钟）后 ，将大脑与山羊抗兔IgG孵育与Alexa Fluor 488（1：200
，A27034，Thermo Fisher）或山羊抗小鼠IgG一起孵育 ，与Alexa Fluor 647（1：200 A2121212121235
，HUMO）一起孵育。然后用PBST（每次洗涤20分钟）将大脑冲洗三次，并安装在聚焦中 。 　　Bactrace逆行跟踪用于识别时钟神经元与AMA神经元之间的连接
。VT037867-ILEXA ，DVPDF-GAL4 FLIE与Lexaop2-Syb :: GFP-P10（VK37）Lexaop-Qf2 :: Snap25 :: Hivnes :: Hivnes :: Syntaxin（vk18）;UAS-B3Recombinase（ATTP2）UAS <b3stop <bont/a（vk5）uas <b3stop <bont/a（vk27）quas-mtdtomato :: ha flies。在25°C下饲养苍蝇
，并在ECLOSIN后2-3天内解剖后代并固定 。用PBST洗涤3次后，将样品安装在聚焦中 ，而无需免疫染色。 　　GRASP57用于检查光感受器与L1
，TM5，TM9 ，TM20和AMA神经元之间的单突触连接
。Lexaop-MCD4 :: SPGFP11和UAS-MCD4 :: SPGFP1-10由特定的Lexa和Gal4驱动程序驱动。蝇是在eClosion后1周解剖的 。在PBS中解剖苍蝇大脑，并在冰上固定4％PFA
。然后将大脑在PBST中洗涤3次。在室温下
，将固定的大脑与穿透性 - 烧毁缓冲液一起孵育2小时 。然后将大脑与小鼠抗NC82初级抗体（1：100，DSHB）在4°C孵育过夜
。在室温下用PBST洗涤3次后 ，将大脑与山羊抗小鼠IgG一起孵育与Alexa Fluor 568（1：200
，A11004，Thermo Fisher）一起孵育过夜。然后将大脑在PBST中洗涤3次 ，并安装在聚焦中进行成像 。 　　HID和RPR的凋亡基因用于消融HB孔眼
。我们首先使用RH6启动子产生了具有HID和RPR表达的转基因苍蝇。我们发现RH6-HID RPR苍蝇在ECOLOSION后的第三天丢失了HB孔眼 。然而
，在ECLOSIM后2周内，也表达RH6的PR8光感受器仍保持部分功能
。因此 ，我们来自RH6-HID的记录是在Eclosion后的第三天进行HB孔眼丢失的
，但大多数YR8光感受器仍然具有功能。 　　对于HB孔眼轴突的激光消融，我们遵循了以前已建立的方法12 。 　　实验前30分钟 ，将苍蝇（Eclosion后1天）进行了黑暗适应。在氧气化的果蝇解剖盐水中解剖飞行头
。在解剖显微镜（M125
，Leica）中仔细去除复合眼和薄片，并带有昏暗的光照明 ，由于它们位于复合眼视网膜和薄片之间，因此它们也去除了HB孔眼。 　　使用配备有25倍水免疫物镜（CFI75 Apochromat 25×C W
，Nikon）的Nikon A1 MP+显微镜在1 µM切片中依次获取图像 。为了共同标记单个AMA神经元和PR8和YR8光感受器，以及VT037867-GAL4-GAL4驱动的Trans-Tango ，抗TIM和抗PDF的共标记
，在配备40×OlimMersion的龙式旋转式式式式Micromoscope上，在1-μm截面中获得了图像
。使用NIS-元素（Nikon）和ImageJ（Fiji ，https://fiji.sc/）处理图像并呈现。 　　我们在ECLOSION后2-4天内使用果蝇进行运动检测测定 。在冰上麻醉20 s后
，将苍蝇绑在带有HistoAcryl的细铂金属丝上（B. Braun Medical）
。在几秒钟内从麻醉中恢复的苍蝇用于进一步实验。然后将铂金属丝固定在三轴线性微型手持量上，该微管杆有助于苍蝇在空气支持的塑料球上的位置54 。使用校准摄像头 ，将每个苍蝇放在中心
，球上方0.4毫米处，使其自由行走
。球运动由两个带有ADNS-6090芯片的摄像机跟踪 ，并使用MATLAB记录实时数据并保存在PC上。使用TTL信号同步记录 。 　　通过精神盒3控制的DMD投影仪（DLP4710EVM-LC
，Texas Instruments）进行了视觉刺激
。圆柱屏幕覆盖了苍蝇的前180°方位角。投影仪的绿色和蓝色通道用作视觉刺激，刷新速率为120 Hz 。为了进行运动检测刺激 ，空间波长为30°，角速度为180°S -1或60°S -1。每次试验持续5 s
，随机包括顺时针和逆时针旋转刺激
。提出刺激1 s。如果苍蝇不到总试验时间的50％，则放弃了试验 ，如果超过一半的试验失败
，则将苍蝇删除 。总共测试了每只苍蝇30分钟
。 　　使用DAM2系统（Trikinetics）测量运动活性。将单个雄性果蝇放在25°C的玻璃管中，湿度为60％ 。苍蝇首先受到三个12 h/12-h LD循环（200勒克斯 ，白光
，相当于3.55×106光子在470 nm时的强度为3.55×106光子µm-2 s-1），与25°C/18°C温度循环相结合 ，然后受到10 ld2循环（约0.05 Lux
，白色，白色 ，白色的强度
，2.29×103光子µm-2 s-1在470 nm），在25°C下为8小时相延迟 ，然后在25°C下恒定黑暗
。LD2循环中0.05 Lux的光强度用于研究Eye PhotoRepectors的NORPA依赖性光探针。 　　For pulse light photoentrainment, the flies were first subjected to three 12-h/12-h LD1 cycles (200 lux, white light) combined with 25 °C/18 °C temperature cycles, followed by nine LD2 cycles with 8-h phase delay at 25 °C (with the light phase composed of 0.2-, 1-, 2- or 5-Hz light pulses of 100-ms duration, 0.05 lux, white light), and then subjected在25°C下恒定黑暗 。光脉冲由微控制器（UNO，Arduino）产生和控制
。分析数据并使用ImageJ插件Actogram J69进行可视化。 　　所有实验数据均报告为平均值±S.E.M.Shapiro -Wilk正态性测试用于确定样品的正态分布 。使用两尾配对或未配对的学生的t检验（正态分布）或Mann-Whitney U检验（非正常分布）进行了两组之间的比较
。使用单向方差分析
，然后进行Tukey的事后检验（非正常分布）或Kruskal-Wallis检验（非正常分布），然后进行邓恩测试 ，对多个组的比较进行了比较。补充表2详细介绍了统计分析 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。