重悬式缓冲液：100 mm乙酸钠 ，50 mm NaCl
，0.1 mm EDTA，pH 5.0;脱氧缓冲液：50毫米Bicine pH 9.6 ，1毫米EDTA;缓冲液D：50 mm乙酸钠pH 5，150 mm NaCl
，10 mm MgCl2，0.1 mm EDTA;杂交缓冲液：10毫米Tris-HCl ，25 mm NaCl
，pH 7.4；klenow片段exo-master与CY5-11-DCTP（KMM – CY5）：17μl水，5μl10x Nebuffer 2.0 ，1μlKlenow碎片exo-（Neb）
，1 DNTPS-DCTP（10 mm），1μlCY5-11-DCTP（20μmmm）（20μm）;橙色染料：8 m尿素 ，橙色G；Klenow碎片Exo-主混合Mini（KMM -Mini）：3.35μl水
，1.2μl10x Nebuffer 2.0，0.1μlKlenow klenow碎片exo- ，0.25 dntps（10 mm）；Klenow碎片EXO-主混合使用CY5-11-DCTP mini（KMM – CY5-MINI）：2.1μl水
，1.2μl10x Nebuffer 2.0，0.2μlKlenow klenow碎片exo- ，0.5 dntps，0.5 dntps（5 mm
，无DCTP），1μlcy5-11-dctp（5 mm）;klenow片段与Bio-11-DCTP（KMM-BIO）混合：17μl水 ，5μl10x Nebuffer 2.0
，1μlKlenow碎片exo-，1 DNTPS-DCTP（10 mm） ，1μlBio-11-dctp（20μm）;洗涤缓冲液：10毫米Tris-HCl
，150毫米LICL，1毫米EDTA ，0.05％（v/v）Tween-20
，pH 7.5；绑定缓冲液：20 mm Tris-HCl，1 m Licl ，2 mM EDTA
，pH 7.5;甲酰胺加载缓冲液（FLB）：90％甲酰胺；SDS裂解缓冲液（SLB）：100 mM乙酸钠，50 mM NaCl ，0.1 mM EDTA，pH 5.0
，1％（v/v）十二烷基硫酸钠（SDS）；碱性洗涤缓冲液（AWB）：25毫米NaOH，4毫米EDTA ，0.05％（v/v）Tween-20；逆转录杂交混合物（RHM）：1μlDNA底漆（2μM）
，1μl10mM DNTPS，1μl10x10x杂交缓冲液 ，10μl水；逆转录主混合物（RMM）：4μLSSIV缓冲液
，1μLRNaseOut，1μLSSSIV逆转录酶 ，1μL0.1 M DITHIOTHREITOL（DTT）；酸性洗涤缓冲液1（AWB1）：100 mm乙酸钠pH 5；酸性洗涤缓冲液1加二20（AWB1-T）：100 mm乙酸钠pH 5
，0.01％（v/v）Tween-20；酸性洗涤缓冲液2（AWB2）：20毫米乙酸钠pH 5 。 　　SOC：超级汤加20毫米葡萄糖；2XYT-S：补充75μgml-1尺寸霉素的酵母提取物胰蛋白；2XYT-S-T：补充了75μgml-1镜头霉素和10μgml-1四环素的酵母提取物胰蛋白；2XYT-S-AP：补充了75μgml-1光霉素和50μgml-1 a​​pramycin的酵母提取物类酮；2XYT-AM：补充75μgml-1氨苄青霉素的酵母提取物胰蛋白
。 　　NCAA 1和2购自Bachem。NCAA 4购自Fluorochem 。NCAA 5购自Ambeed。NCAAS和NCMS 6、8 、14，S1 ，S4和S5购自Onamine
。NCAA 7购自Aablocks。NCAAS和NCMS 9
、10、12和S3购自默克 。NCMS 13 、15、16
、17、18 、20和S7购自BLD
。NCM S2购自Advanced Chemblock。NCM 19和S6购自Astatech 。如前所述3
，NCAAS和NCMS 3和S8合成，NCAA 11被自定义合成 ，如前所述54
。NCMS S1和S5在二氧烷中的浓缩HCl中占主导地位。 　　参见补充数据2 。 　　有关所有构造，请参见补充数据2
。 　　根据制造商的指南
，Gibson组装使用Nebuilder HIFI DNA组装主组合（NEB）进行标准克隆。如前所述55,56，通过酶促逆PCR生成库 。简而言之 ，使用两个引物（请参阅引物列表）在所需的诱变位点和BSAI裂解位点放大模板质粒
。在自定义混合物的情况下
，将含有不同密码子的引物手动混合并用于PCR反应。使用BSAI和DPNI对PCR产物进行凝胶纯化并消化 。随后，将样品纯化 ，使用T4 DNA连接酶绑扎
，并转化为电动大肠杆菌DH10β细胞，以确保使用Sanger测序对单个菌落（> 10）进行最小的转化效率。总质粒DNA是从所得培养物中制备的 ，使用Sanger测序将其作为整体测序
，并用于随后的实验
。 　　该方案用于分离1-10 mL细胞培养的TRNA。用编码A pylrs变体和tRNA或圆形排列的分裂tRNA的PMB1质粒转化化学胜任的DH10β细胞，并在37°C ，700–1,000 rpm中在1 ml SOC中拯救1 h 。将细胞转移到选择性2XYT-S培养基中
，并在一夜之间生长
。隔夜培养物以1:20至1:40之间的比率稀释，并生长到0.5-1的OD600。将细胞在4,200 RCF下在4°C下离心12分钟 ，在200 µL重悬浮缓冲液中服用，转移到96孔板上
，并在4,200 RCF下在4°C下离心12分钟 。将细胞重悬于135 µL重悬浮缓冲液中，并加入15 µL液态苯酚
。通过以650 rpm的速度摇动细胞20分钟 ，然后在4200 RCF下在4°C下离心20分钟；将细胞裂解物添加到40 µL氯仿中
，并通过移动方式上下混合所得悬浮液。将混合物在4200 RCF下在4°C下离心10分钟，然后将115 µL水层转移到6 µL 0.1 M Naio4中 。将分离的RNA在冰上氧化1小时 ，并通过添加8 µL的0.1 m DTT淬灭氧化反应
。使用Zymo Research的ZR-96 Oligo Clean＆Comentator纯化TRNA。简而言之
，将250 µL的寡核酸结合缓冲液添加到氧化反应中，随后加入400 µL异丙醇 ，然后将混合物转移到96孔硅柱柱板上 。将板离心2分钟
，在室温下离心4,200 rcf，并加入800 µL的寡醇洗涤缓冲液
。将板离心2分钟 ，在室温下4,200 RCF
，在室温下再离心4,200 RCF，在室温下再离心4分钟。最后 ，当未加工样品或在50 µL水中，在样品进一步脱酰基时
，通过离心4分钟，在室温下4,200 rcf时将RNA洗脱 ，或在50 µL水中进行洗脱 。 　　如前所述22,57
，该方案中描述的体积用于分离5–25 mL细胞培养的TRNA。简而言之，如协议A中所述生长的细胞 ，并用800 µL重悬式缓冲液洗涤并转移至1.5 mL eppendorf管
。在225 µL重悬浮缓冲液中吸收细胞
，并加入25 µL液态苯酚。通过涡旋裂解一分钟，并孵育并用头尾旋转20分钟 。将裂解细胞离心15分钟 ，在室温下20,000 RCF
，将细胞裂解物添加到250 µL氯仿中，将样品涡旋一分钟 ，然后在室温下离心10分钟
，10分钟，20,000 RCF
。将两百微米的水层转移到10 µl 0.1 m Naio4中 ，并在冰上将RNA氧化1小时。最后，将氧化的RNA添加到440 µl乙醇中
，并在-20°C下至少沉淀20分钟 。将样品离心25分钟，在4°C下离心20,000 rcf并吸出
。将RNA颗粒在室温下干燥10分钟 ，并溶解在水或缓冲液中。 　　将45μl分离的RNA添加到5 µl 10 x脱酰化缓冲液中
，并在42°C下将TRNA脱氧36分钟 。通过添加6 µL 3 M乙酸钠淬灭反应，并使用Zymo研究中的ZR-96寡核和浓缩剂纯化TRNA ，如协议A中所述
，用于隔离和氧化TRNA的A A A A A隔离和氧化（除外，使用100 µL的寡头结合Buffer ，而不是250 µL）
。在14 µL水中洗脱脱酰化的TRNA。 　　该方案用于运行图2c所示的实验和补充图4 。将RNA浓度调节到最低的共同点
，将10 µL的RNA添加到2.5 µl 10x 10x杂交缓冲液，11.5 µl水和11.5 µl水和1 µl Cy3-cy3标记的延伸启动剂（2 µM）的方法中 ，这些方法是在探针中（2 µM;注意）
。扩展
，本身并非扩展）。在添加25 µl kmm -cy5之前，将DNA底漆在65℃下杂交5分钟 ，并在37°C下延伸6分钟 。使用10 µg NEB Monarch RNA清理套件（NEB）纯化样品，并在12 µL水中洗脱。加入12 µL橙色载体染料
，将样品加载到6 M尿素10或15％的页面凝胶（Invitrogen）上，并在270 V的0.5倍三型螺旋体 - EDTA（TBE）缓冲液中运行36分钟
。使用Amersham Typhoon Biomolecular Imomolecular Immolecular Immotifer（GE）cy5和Cy5 Emodision 3和Cy5 Emodiss cy5 gel。然后用SYBR金（Invitrogen）对凝胶染色 ，并使用相同的过滤器再次成像 。 　　除非另有说明
，否则所有Fluoro-Trex实验均使用Mini-Fluoro-Trex方案进行
。将六个微量的RNA添加到0.5 µL 10倍杂交缓冲液中，并将0.5 µL Cy3标记的延伸引物（2 µM）添加到0.5 µl。在添加5 µl kmm-cy5-mini之前 ，将DNA底漆在65°C下杂交5分钟
，并在37°C下延伸6分钟 。如描述的Fluoro-Trex所述分析样品
。 　　该协议改编自Cervettini等人22。如协议A中所述分离总tRNA并脱酰基化 。将一到两个微克的RNA稀释到总体积为6 µL中，并将其添加到0.5 µl 10倍杂交缓冲液中 ，并添加0.5 µL Cy5标记的延伸引物（2 µM）
。将DNA底漆在65°C杂交5分钟
，然后再添加5 µl kmm-Mini，并在37°C下延伸6分钟。通过运行15％丙烯酰胺1x TBE凝胶（运行200 V ，40-80分钟）来分析样品 。 　　调整RNA浓度以匹配要比较的样品中最低的浓度
。将十微晶的RNA添加到2.5 µl 10x杂交缓冲液
，11.5 µl水和1 µL延伸引物（2 µM）中。将DNA探针在65°C杂交5分钟，然后再添加25 µl kmm-bio ，并在37°C下延伸6分钟 。10 µL肌链霉素C1磁珠（Invitrogen）用200 µL洗涤缓冲液洗涤3次，重悬于50 µL结合缓冲液中；将珠子添加到延伸反应中
，并在4°C下至少进行30分钟，并以头为尾旋转。除去上清液 ，并用200 µL洗涤缓冲液洗涤珠4次
。将洗涤的珠子重悬于10 µL FLB中
，并加热至98°C 3分钟以释放TRNA。除去珠子，并将上清液直接加载到6 M尿素 ，10％或15％的页面凝胶（Invitrogen）上
，并在270 V时在0.5倍TBE中运行36分钟 。凝胶用Sybr Gold（Invitrogen）染色，并在Amersham Typhoon Biomolecular Imomolecular Imalolemolecular Imalolemolecular Imalimolecular ImeSife（gee）上染色 ，并在使用Amersham typhoon typhoon typhoon typhoon typhoon typhoon（ge）染色
。 　　按照一般方案A或B分离TRNA
，从而省略NAIO4的氧化。将两到三个微克的RNA加载到酸性尿素页凝胶上（9％丙烯酰胺（19：1），乙酸钠100 mm pH 5 ，8 m尿素）
，并使用100 mm乙酸钠作为跑步缓冲液，以6 W恒定的功率运行12-16小时 。用SYBR金（Invitrogen）对凝胶染色 ，以鉴定TRNA，并使用Iblet DNA转移堆栈（Invitrogen）用Iblet Dry印迹系统切开凝胶的适当部分
。将TRNA交联至膜（StratalInker UV交叉链接2400）
，随后在Ambion Ultrahyb-Oligo缓冲液（Invitrogen）中阻止了30分钟。将生物素化的DNA探针添加到0.2 µg ml -1的终浓度中，并在37°C和160 rpm下杂交过夜 。将膜用20 mL 0.5倍TBE缓冲液洗涤3次 ，并将膜转移到15 mL Odyssey阻止缓冲液中20分钟
，然后再添加IRDYE 800CW链霉亲和素（LI-COR），以最终浓度为0.2 µg Ml-Ml-1
。最后 ，用20 mL 0.5倍TBE洗涤膜3次
，并使用IR远程发射滤波器在Amersham Typhoon二元生物分子成像仪（GE）上成像。 　　给定的体积适合2至3 mL的细胞培养，并在需要时按比例调整 。用编码STMRNA构建体的PCOLE1质粒转化化学胜任的BL21细胞 ，该构建体在T7启动子和T7终结剂的控制下
，在SOC中救出，在220 rpm ，37°C下摇动1小时
，将其稀释为2xyt-am，并在2xyt-am上稀释
。在不存在或存在NCM的情况下以1:20的比例稀释过隔夜培养物 ，并在37°C下生长，220 rpm至0.5-0.8的OD600。通过添加异丙基β-1-甲状腺乳乙酰糖苷（IPTG）诱导塔的产生
，并将细胞在37°C下生长20分钟，220 rpm生长为220 rpm 。 　　将细胞在4200 RCF下在4°C下离心12分钟 ，重悬于800 µL的重悬式缓冲液中
，转移到96孔板上，并在4,200 RCF ，4°C离心12分钟。随后
，遵循了Agenadvance Cell V2 RNA隔离试剂盒（Beckman）的用户手册中概述的过程
。简而言之，使用含有10 µL蛋白酶K的200 µL LBE在室温下裂解1小时。将244μlBBC珠与266 µL异丙醇混合 ，添加到裂解液中
，RNA在室温下与珠子结合10分钟 。最终洗涤后，用200 µl 80％乙醇洗涤珠3次 ，小心地干燥珠
，然后将RNA在80 µL水中洗脱
。 　　将70μL的RNA溶液添加到40 µL重悬浮缓冲液和7.5 µL 0.1 M Naio4中。氧化在冰上持续1小时，并用10.5 µl 100 mm DTT淬火 。对于氧化的RNA ，加入了1.5 µl 1.6 m Na2CO3和16.5 µL DNase I缓冲液（Ambion DNase I，Thermofisher）的混合物
，并重新悬浮了样品
。随后，加入18 µL的DNase I ，并将RNA在37°C下孵育30分钟。在冰上冷却消化
，并添加300 µL Agencourt rnaclean XP珠（Beckman），并在室温下将RNA结合10分钟 。将珠子用80％乙醇洗涤3次
。最终洗涤后 ，将珠子小心干燥
，然后将RNA在25 µL水中洗脱。 　　遵循了与过程A中概述的一个方案相似的方案，但是使用酸苯酚/氯仿提取分离RNA 。简而言之 ，在NCM存在或不存在OD600 0.5-0.9的情况下
，在5 mL的2xyt-AM中生长了携带stMRNA的BL21大肠杆菌
。此时，通过将1 M IPTG添加到最终浓度为1 mm ，可以诱导StMRNA表达。20分钟后
，通过在4°C下以4,200 RCF离心12分钟收集细胞 。将细胞颗粒重悬于800 µL重悬浮缓冲液中，转移到1.5 mL eppendorf管中 ，并在室温下在4,200 RCF下离心3分钟。除去上清液，并将颗粒重悬于500 µL SLB中
。迅速添加500 µL酸 - 苯酚
，并在室温下将管涡流1分钟，然后离心6分钟 ，21,000 RCF。回收450μl水层
，并加入50 µL的2.5 m kCl 。重复酸 - 苯酚氯仿提取，检索400 µL水层
。加入400μl氯仿 ，并将样品涡旋1分钟
，然后在室温下6分钟以21,000 RCF离心。回收300μl水层，并用300 µL氯仿重复氯仿提取 。将200 µL水相转移到新的1.5 mL eppendorf管中 ，并加入10 µL 0.1 m Naio4
。在冰上进行氧化反应1小时。加入440μl的乙醇
，并在-20°C下沉淀至少20分钟 。通过在4°C下以21,000 RCF离心30分钟，将RNA固定
。除去上清液 ，然后将颗粒气干10分钟。将RNA重悬于50 µL水中 。将30μl的每个RNA样品在120 µl 1x Ambion DNase I缓冲液中消化
，包括12 µL Ambion DNase I酶
。用50 µg君主RNA清理试剂盒（NEB）纯化样品，并洗脱20 µL水。我们注意到 ，当通过酸 - 苯酚氯仿提取分离RNA时， 需要在解脱缓冲液中的额外脱酰化步骤
，以测量具有非α氨基酸单体的STMRNA的酰化 。 　　调整所有样品的RNA浓度，以匹配要比较的样品中最低的浓度。将6至12微克RNA的RNA添加到1 µL DNA探针（2 µM） ，2.5 µL 10倍杂交缓冲液和水的混合物中（添加到最终体积25 µL）
。将底漆在65°C退火5分钟。添加了25 µl kmm -cy5 。将底漆延长6分钟
，37°C
。使用10 µg NEB Monarch RNA清理套件（NEB）纯化样品，并在12 µL水中洗脱。将12μl的橙色加载染料添加到每个样品中 。使用1％琼脂糖凝胶（使用运行的北马拖把铸造）在北玛克斯拖把的135 V（42分钟）中进行凝胶电泳
。用SYBR金（Invitrogen）对凝胶染色 ，并使用CY2和CY5发射过滤器在Amersham Typhoon二元分子成像仪（GE）上成像。 　　调节RNA提取和氧化后所有样品的RNA浓度（方法）
，以匹配要比较样品中的最低浓度 。 　　为了执行下拉，将6-12 µg的RNA添加到1 µL DNA探针（2 µM） ，2.5 µL 10倍杂交缓冲液和水的混合物中（添加到最终体积25 µL）
。将底漆在65°C退火5分钟。添加了25 µL KMM-BIO 。将底漆延长6分钟
，37°C
。将十微粒的Dynabeads Myone C1链霉亲和素珠（Invitrogen）用洗涤缓冲液洗涤2次，并重悬于50 µL的结合缓冲液中。将重悬的珠子添加到延伸反应中 ，并带有尾巴旋转的生物素化的stmRNA与珠子结合1小时
，4°C 。将珠子洗在带有3×200 µL洗涤缓冲液的磁性台上，两次200 µl AWB ，一次200 µL洗涤缓冲液，一次200 µl水
，最后重悬于13 µL的RHM中。AWB洗涤后，在用洗涤缓冲液进行最后一次洗涤后 ，将珠子转移到新的塑料管中
。将底漆在65°C退火5分钟。加入7 µL RMM
，RNA在50°C下反转录10分钟 。加入一微升的RNase H，并将混合物加热至37°C 15分钟和98°C ，持续3分钟
，以从珠子中释放cDNA
。最后，将cDNA与珠子分离 ，并用于通过qPCR
，NGS或作为进一步克隆的模板进行定量。 　　为了确定在13 µL RHM中提取和氧化的RNA样品的输入中分子的数量，使用与降低的stmRNA相同的步骤进行了反转录 。根据QPCR确定（（（在下拉后的分子数/输入中分子数）×100）确定 ，在下拉中回收的输入stmRNA分子的百分比是根据分子的数量确定的
。 　　对于每个生物– Mrex样品
，一式三份运行QPCR反应，由2 µL cDNA ，10 µL Powerup Sybr绿色主混合物（Applied Biosystems），0.4 µL每个引物和7.2 µL水组成。由MMPYLRS基因的PCR产生的标准
，并使用量子2荧光计（Life Technologies）和Qubit 1X DSDNA HS Assay试剂盒（Invitrogen）进行定量 。使用五步的五倍连续稀释来生成QPCR标准曲线
。这允许计算QPCR效率和每个样品中的分子数量。使用SYBR Green（Invitrogen）的标准供应商方案（Invitrogen）在VIIA 7实时PCR系统（Applied Biosystems）上运行QPCR 。 　　来自20 µL的来自Bio-Trex的20 µL逆转录反应的cDNA被添加到含有25 µL Q5 Q5高效率2倍的2x主混合物，12 µL水和2 µL的索引引物的10 µM预定义混合物的PCR混合物中（请参阅补充数据2）
。使用了29个扩增周期和60°C退火温度的标准PCR程序。根据制造商的指南 ，延长时间适应了扩增子长度 。DNA与100 µL的琼脂敏XP（Beckman）结合10分钟
，并用200 µl 80％乙醇洗涤珠3次。将珠干燥，并在25 µL水中洗脱DNA
。使用Qubit 2荧光计（Life Technologies）和Qubit 1X DSDNA HS分析试剂盒（Invitrogen）测量DNA浓度 ，并将每个扩增子的80 ng组合到NGS库中。将联合文库在HT1杂交缓冲液（Illumina）中稀释至2 nm的浓度 。添加phix（Illumina）以以20％的摩尔比增加图书馆的多样性
。将12 µL库添加到18 µL HT1杂交缓冲液（Illumina）中
，并将20 µL稀释的混合物用于NGS分析。 　　来自20 µl逆转录反应的一半cDNA来自Bio-Trex，将其加入含有25 µL Q5高效率2倍2次主混合物 ，12 µL水和2 µL的10 µm预定的金色栅极组件混合物的PCR混合物中（请参阅补充数据2） 。使用了达阵PCR程序
。每个周期的初始退火温度在10个周期内降低了0.5°C。随后
，使用58°C的退火温度进行了20个常规循环 。根据制造商的指南，延长时间适应了扩增子长度
。DNA与100 µL的琼脂敏XP（Beckman）结合10分钟 ，并用200 µl 80％乙醇洗涤珠3次。将珠干燥
，并在25 µL水中洗脱DNA 。然后将扩增子克隆到一个新的PCOLE1主链中，该骨架先前由Golden Gate Primers（补充数据2）放大 ，并根据新英格兰Biolabs的指南，由两件式的Golden Gate组装放大
。 　　NGS是在Miseq系统上进行的（在使用库1和基板2的测试演化的情况下）或NextSeq2000系统（在所有其他情况下）进行。使用寡素NGS A（1-8）和NGS_B（1-8）（补充数据2）放大了来自TRNA显示的cDNA
，其中包含通过PCR进行NEXTERA测序条形码的不同组合 。将样品纯化，定量和等摩尔量。首先使用Pear58配对配对的端读 ，并使用Bowtie259对齐MMPYLRS的参考序列
。提取相关的库位置并翻译成氨基酸
，并使用R脚本计数所得的变体。使用每个库中每个变体的频率进行后续操作，该曲线被计算为计数值除以该库的计数总数 。使用R脚本 ，计算所有变体的富集和选择性得分
，如下所示
。首先，仅考虑所有正面重复中存在的变体（使用表和操作员合并表）。假设高度富集的序列可能不会覆盖为负和输入样本 ，但仍可能是感兴趣的
，则使用或操作员将负复制和幼稚的重复序列合并到正表中 。在复制不涵盖特定变体的情况下，采用了0.95个计数的占位符值
。所得的数据集用于在存在的情况下和不存在NCAA或NCM的情况下计算平均富集 ，该数据集在一个条件和输入条件下计算为平均频率的商。所得的正和负富集用于计算每个变体的选择性值（相当于正频率和负频率的商） 。为了进一步分析
，使用经验确定的阈值对正频率的标准偏差（加分底物条件下的分散误差）过滤变体
。 　　在一般方案B省略Naio4的氧化后，从8 mL细胞中分离出TRNA。将RNA颗粒重悬于90 µL缓冲液D中 ，并调整了RNA浓度以匹配要比较样品中最低的浓度 。将0.5 µL的生物素化DNA探针（100 µM）添加到RNA中，并将DNA探针在65°C杂交5分钟
。将40μl链霉亲和素dynabeads MyOne C1（Invitrogen）用缓冲液D-T（带有0.05％的缓冲液D（V/V）育成）洗涤两次
，并将其添加到10 µL缓冲液D中。将珠添加到杂交反应中，并将探针粘结到质量上 ，以在4°Cover-new-cover-sever-severation the Bead中以最小的30分钟粘结 。将样品用200 µL的ACW1-T洗涤3次
，用200 µL ACW1用200 µL的ACW2洗涤3次，一次用200 µl的ACW2洗涤 ，均在200 µL水中
，全部在磁性台上。加入24 µL的脱酰固定缓冲液，并在42°C下孵育一小时
。将12 µL的脱酰化混合物加入3 µL 6-氨基喹啉基-N-羟基糖氨基酰亚胺氨基甲酸酯（AQC ，3 mg ML-1中的乙腈）
，并在55°C下在55°C下孵育15分钟。使用单个离子监测，对Agilent Technologies 6130四极杆LC – MS分析样品 。 　　具有p15a质粒（150TAG）HIS6 HIS6或GFP（3TAG）HIS6的化学能力的DH10β细胞（两个版本的p15a质粒的两个版本 ，具有四环素或Apramycin抗性盒
，导致相似的结果，与efcod cunted contrast contrast contrast contrast contrast in a pmsod contrans contres in cons in consyl and pmm1它和M. Mazei在SOC中救出并在2xyts-t或2xyts-ap中生长过夜
。将20μl的过夜培养物稀释为480 µl 2XYTS-T或2XYTS-AP ，在存在的情况下，在96孔板格式中含有0.2-阿拉伯糖和2至4 mm的NCM。将细胞在37°C下在700 rpm的37°C下生长16-20小时
，将板离心12分钟，在4°C下4,200 rcf ，并将细胞重悬于150 µL PBS中 。将重悬的细胞的一百微晶转移到Costar 96孔平板板中
，并使用Pherastar FS读取器测量GFP荧光
。 　　如上所述产生的蛋白质的三种重复是在1.5 mL的Eppendorf管中组合，在4,200 RCF下离心3分钟 ，在-20°C下冷冻
，解冻并重悬于150 µL Bugbuster（Millipore）中。将细胞裂解1小时，并用头旋转 。将裂解的细胞离心20分钟 ，在4°C下离心20 000 rcf
，并将裂解液添加到20 µl的Ni-NTA珠中
。GFP（150X）–HIS6在室温下与尾部旋转时与珠子结合了20分钟。将珠子用PBS中的60 µL 30 mM咪唑洗涤6次，并用PBS中的300 µL 300毫米咪唑洗脱蛋白质 。 　　对于NCM 13的低活性突变体 ，将5-15​​ mL的细胞培养物用于蛋白质的产生
。对错误的量进行了比例调整
，所有其他卷都保持不变。 　　如前所述29,33进行ESI -MS和MS/MS 。 　　具有编码GFP（150TAG）HIS6的P15A质粒的化学能力DH10β细胞和编码MMPYLS（13_1）和MMTRNAPYL的PMB1质粒，在SOC中获救 ，并在2xyts-ap中恢复过夜。将10 mL的过夜培养物稀释到1 L 2xyts -AP中，含有5 mm 13的情况下
，含有0.2％的阿拉伯糖
。 　　GFP（150（s）β3MBRF）–HIS6的1 L表达培养物的细菌颗粒通过超声处理裂解，以142,000 rcf离心30分钟 ，上清液与Ni-NTA珠（Qiagen）结合。在蛋白质洗脱之前
，将珠洗涤3次，并使用SuperDex 75 HiloAD 26/60 pg柱（GE Healthcare）在25 mM Tris pH 7.4
、200 mm NaCl和0.06％NAN3中进一步纯化 。使用Vivaspin 20 ，10,000 MWCO（Sartorius）浓缩纯化的蛋白质
，至6 mg ml -1
。用50：1的比例用测序级改良胰蛋白酶（Promega）消化样品。将样品在37°C下孵育1小时，以21,000 rcf离心10分钟 ，然后在晶体盘中镀板 。在18°C的96孔坐落式蒸气扩散板（分子尺寸）中
，在18°C的96孔坐落式蒸气扩散板（分子尺寸）中进行了结晶试验，并使用蚊子HTS机器人（TTP LabTech）进行
。0.2μl蛋白质溶液加上0.2μl储液溶液的下降比用于筛选。唯一有用的数据集是从从融合屏幕（分子尺寸）60收集的晶体中收集的 ，其组成：37.5％PEG 3350/PEG 3350/PEG 1 K/MPD（1：1：1）
，0.1 M Bicine/trizine/trizma ph 8.5，0.8％（W/V）Morpheus III III III III III III III III Alkaloids和0.11 Alkaloids和0.12 M Morpheus Morpheus Morpheus 。收集晶体并在液氮中闪烁
。 　　在梁线ID23-2上以14.2 keV的能量收集衍射数据。通过管道AutoProc（全局分阶段）使用XDS61处理数据62 。使用同源物型PDB 2B3P用Molrep63的分子替换来溶解该结构
。使用COOT64 ，REFMAC565进行改进，并用Molprobity66进行迭代建筑。用Pymol（Pymol Molecular图形系统
，Schrödinger）制备结构的数字 。 　　如图11所述进行选择。分离RNA并如一般程序中所述进行氧化A. Bio -Mrex如一般程序中的指定进行
。选择第一轮之后，如上所述 ，从扩增的cDNA组装了新的库。在第二轮选择后
，如上所述，从分离的cDNA中制备NGS样品 ，使用P2 600循环弹药筒运行NGS
，并按照上述指定分析数据 。 　　选择如补充图2所述进行
。如一般程序中所述分离并氧化了22和35。如上所述，从分离的cDNA中制备NGS样品 ，使用P1 600循环弹药筒运行的NGS
，并按照上面的指定分析数据 。 　　通过量子2荧光计（Life Technologies）和Qubit 1X DSDNA HS分析试剂盒（Invitrogen）和质粒以等极量的质量测量，用量子2荧光计（Life Technologies）和Qubit 1X DSDNA HS分析试剂盒（Life Technologies）和Qubit 1X DSDNA HS分析试剂盒（Life Technologies）和Qubit 1X DSDNA HS分析试剂盒（Life Technologies）测量了编码塔的PMB1质粒的浓度
。使用金门引物（补充数据2）和Genemorph II试剂盒（Agilent） ，在导致最大数量随机突变的条件下
，使用合并的质粒用于Pylrs活性位点的误差PCR。根据NEB（新英格兰Biolabs）指南，将扩增子通过两件式金门组件将其克隆到新的PCOLE1主链中 。按照补充图33所述进行选择
。分离RNA并如一般过程中所述氧化A. Bio -Mrex如一般程序中所指定的。如上所述 ，从分离的cDNA中制备NGS样品，使用P2 600循环弹药筒运行NGS
，并按照上述规定分析数据 。 　　GraphPad Prism版本9用于生成本研究中的所有条形图
。为了进行序列对齐和进一步处理NGS数据，使用了自定义脚本。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。