与以前在室温为4,25的SFX研究中一样
，制备了PSII微晶的样品，并进行了一些较小的调整。简而言之 ，在先前描述的培养基41,42,43,44中
，在八个5-L瓶中生长了嗜热蓝细菌的热核酸菌的细胞，在八个5-l瓶中生长至OD730 nm = 2.5-3.0的密度 ，并按照先前所述收集 。将细胞重悬于40 mM KH2PO4-KOH（pH 6.8）和0.4 m甘露醇的缓冲液中
，并在37°C下用1.21 g L-1溶菌酶（Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation）处理90分钟，持续摇动
。通过以13,700克离心处理处理的细胞15分钟 ，悬浮在25％（w/v）甘油中
，20 mM HEPES-NAOH（pH 7.0）和10 mM MGCL2（缓冲液A）（缓冲液A），并在-80°C下储存在-80°C下。 　　将冷冻细胞解冻 ，添加了十个含有30 mM HEPES-NAOH（pH 7.0）和10 mM MGCL2的缓冲液的折叠
，以通过冷冻和渗透性冲击来破坏细胞 。在13,700克离心15分钟后，将沉淀的类囊体悬浮在5％（w/v）甘油 ，20 mM Hepes-NaOH（pH 7.0）和10 mM MGCL2中
。通过用洗涤剂N，N-二甲基多二甲胺N氧化物（LDAO）（Sigma-Aldrich
，40236-250ml）的两步溶解从类囊体获得粗pSII颗粒。在第一步中，将类囊体用0.16％（w/v）LDAO处理5分钟 ，在冰上进行5分钟
，并以43,200克离心60分钟 。将获得的小球悬挂在缓冲液中，并再次用0.27％（w/v）LDAO处理5分钟
。将混合物以100,000克离心1小时 ，并回收上清液。在将50（w/v）聚乙烯乙二醇（PEG）1450添加到15％的最终浓度后
，通过以100,000g离心30分钟回收粗psii颗粒，并重悬于缓冲液A41,42,43,44中 。 　　用1.0％N-二烷基-β-d-maltoside（β-DDM）（Fujifilm Wako Wako Pure Chemical Corporation ，d316）处理PSII粗颗粒5分钟
，并加载到Q-Sepharose高度性能（cytiva）上，并与5％（W/V）30（w/v）Glyol ，30 mmmmmmmmm
，30 mmmmmm，per ，30 m
。CaCl2和0.03％β-DDM（缓冲液B）在6°C的冷却室中。用含有170 mM NaCl的缓冲液B的八到十折洗涤该色谱柱，并用BufferB中的170–300 mm NaCl的12.5倍折叠的衬里梯度洗脱 。在PSII MONOMER中
，PSII Dimer和PSI MONOMER中首先出现了PSII MONOMER的洗脱峰。将收集的PSII二聚体用无DDM的缓冲液B稀释三倍，将PEG 1450添加到最终浓度为13％
。将PSII二聚体以100,000g离心30分钟 ，将沉淀悬浮在没有DDM的缓冲液中
，并存储在液氮中，直到使用41,42,43,44。 　　To make microcrystals of the PSII dimer, the sample was diluted with 20 mM MES-NaOH (pH 6.0), 40 mM MgSO4, 20 mM NaCl and 10 mM CaCl2, followed by additions of n-heptyl-β-D-thioglucopyranoside (HTG) (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, H015) and PEG 1450 to final concentrations of0.85％（w/v）和约5.50–5.75％（w/v）的最终浓度分别为2.25 mg叶绿素 ，每毫升（参考文献4,6） 。在2.0毫升玻璃小瓶（J.G. Finneran Associates
，9800-1232）中生长微晶，并将150μlPSII二聚体样品放入每个小瓶中
。在20°C下站立20-30分钟后 ，将溶液轻轻地混合并静置10-30分钟
，以使微晶生长。如果微晶未出现或出现少量，则重复混合和依恋的步骤 ，直到出现足够的微晶 。 　　微晶出现后
，允许它们长到100μm，长达几个小时过夜 ，然后将150μl含有7％（w/v）PEG 1450，20 mm Mes-NaOH（pH 6.0）
，20 mm NaCl，20 mm NaCl ，10 mm Cacl2和0.85％（W/V）的晶体储存缓冲液（pH 6.0）添加了MIRSRY（w/v）
。收集微晶后
，将上清液丢弃，并将微晶在20°C下存储在晶体存储缓冲液中 ，直到X射线游离电子激光器（XFEL）实验。重要的是将微晶存储在晶体存储缓冲液中超过24小时以确保高分辨率
，并且它们在晶体存储缓冲液中至少稳定三天，但不超过7天4,6 。 　　在进行衍射实验之前 ，将10 mM的铁酰钾溶液添加到昏暗绿光下的PSII微晶溶液中
，并在20°C下用激光在532 nm的波长和52 mJ cm-2的能量下给出一个前闪光
。随后将微晶体转移至7％（w/v）PEG 1450，20 mm Mes-NaOH（pH 6.0） ，20 mm NaCl
，10 mm CACL2，0.85％（w/v）HTG ，2％二甲基磺代（DMSO）和10 mm Potassium ferricyanide和10分钟°C in 20 min g。最终，该溶液被含有10％（w/v）PEG 1450
，10％（w/v）PEG单甲基5000，23％（w/v）甘油 ，20 mm NaCl
，10 mm Cacl2，10 mm Cacl2 ，20％（w/v）的冷冻保护剂替代
，均可用于六个htg，2％dmso和10 mmmmso pots ins pot ferrricim caCl2 ，10 mm cacl2
，10 mm cacl2，23％（w/v） ，10 mm cacl2
，23％（w/v）甘油，10 mm cacl2 ，23％（w/v），甘油乙醇5000
，23％（w/v）甘油，甘油乙醚5000 ，23％（W/V（参考文献4,6） 。 　　用冷冻保护剂溶液代替溶液后
，将PSII微晶与核电级的真空润滑脂轻轻混合（Super Lube，42150）45
。油脂与微晶的比率为200μl至50μl（从4-5 mg叶绿素获得） ，为避免对微晶体的物理损害
，将混合进行2分钟。将混合物在20°C下暴露于30–60分钟左右的空气中，以进一步脱水 ，然后在室温下用于黑暗中的衍射实验 。从冷冻保护剂替换到XFEL实验的总时间是一到两个小时。 　　在两个独立的实验中收集了黑暗和1F数据
，以及1F和2F时间删除的数据，总共有14个实验数据集（扩展数据表1）
。除非另有说明 ，否则在两个光束时实验设置都是相同的。使用在弹簧8ÅNGSTROM紧凑的自由电子激光器（SACLA）46中收集的单发XFEL获得衍射图像 。XFEL脉冲的参数如下：脉冲持续时间10 fs
，能量10 keV，梁尺寸3.0μm（h）×3.0μm（W）和重复速率10 Hz（参考文献4）
。使用具有以下参数的泵激光器激发PSII微晶：脉冲持续时间6 ns（FWHM ，Gaussian），能量42 MJ CM-2
，聚焦点尺寸240μM（顶部率），波长532 nm和频率速率和频率速率10 Hz（参考4）。为了确保有效的激发 ，将一个激光束分成两个光束
，这些光束从两个不同方向的样品的同一点分开，分别为160°（参考文献4） 。 　　将含有PSII微晶和油脂混合物的注射器仔细插入样品室中 ，其中使用液压从注射器弹出混合物
，最终形成微米尺寸的液体流47,48
。 　　通过调节喷油器中的流体压力来调节样品流速。对于“黑暗
”样品，流速为1.99μlmin -1 ，而对于“光”样品
，其流量为7.80μlmin -1 。如前所述，通过维持此流量 ，有效避免了先前激光器的污染25
。通过将样品流直接暴露于Xfels获得深色数据集
，而1F和2F数据集则是通过首先用泵激光器照亮样品流来获得的，然后在指定的延迟时间ΔT之后接触XFELS。ΔT1和ΔT2的值分别设置为20 ns ，200 ns，1μs
，30μs，200μs和5 ms（扩展数据图1D） 。另外 ，在2F时间段实验中
，将第一闪存和第二闪存之间的时间间隔设置为5 ms（扩展数据图1D），足以将S1状态完全转换为1F后的S2状态
。激光器和XFEL的焦点中心对于20 ns –200μs的数据是相同的 ，但是对于5 ms的数据
，激光焦点的焦点比Xfels设置了60μm，以防止光启用的微晶升高xfel xfel the xfel after aflast aflath after aflath afly after xfel。使用Rayonix MX300-HS检测器记录衍射斑 ，该检测器位于样品中240 mm 。 　　在梁时
，我们使用Cheetah49（https://github.com/keitaroyam/cheetah）和Crystfel（V.0.6.3）50,51来观察和分析衍射图像。分析提供了每个数据集的命中率，索引图像的数量和近似分辨率 ，这极大地帮助了我们设计有效的数据收集策略
。为了在梁线上处理衍射图像
，我们首先使用了大约10,000个溶菌酶晶体的索引衍射图像来准确确定梁中心和摄像头长度。然后将这些参数提供给Crytfel，以处理PSII衍射图像 。PSII衍射图像使用“ IndexamaJig ”索引 ，使用DiRAX50,51索引方法A =124.7Å，B =229.89Å
，C =285.5Å，α=β=β=γ=γ=γ=γ=γ= 90°PDB Code 5ws5Ws5（参考4）
。使用“ process_hkl
”合并了所得的个体强度 ，并使用“ compare_hkl”评估反射数据（参考文献50,51）。 　　在数据收集后
，使用“ CCTBX.XFEL ”进行衍射图像的索引和集成，以及合并反射52,53 。通过使用程序“ CSPAD.CBF_METROGOL
”（参考文献52,53）来验证梁中心的准确性和从水晶获得的相机长度的准确性
。使用“ Dials.Stills_process”（参考文献54）对PSII衍射图像进行了索引和集成 ，并结合了上述确定的检测器信息和靶向单位细胞参数。程序“ CXI.Merge ”（参考文献52,53）将单个反射与后RS2算法合并
，并且未应用基于I/Sigma的值的过滤器，以包括高分辨率下的弱信号 。从同一实验中收集的所有数据集中计算出的平均单位单元格再次合并了每个单独的数据集
。根据约50％的CC1/2的标准 ，将所有数据集处理为2.15–2.30Å的分辨率（扩展数据表1）。 　　使用来自Phenix55的Shix55的相位MR进行黑暗数据的分子替换
，其PSII结构以2.35-Å分辨率求解，并在室温下（PDB代码：5WS5）作为搜索模型 ，其中水分子和OEC删除了OEC44 。接下来
，将刚性的细化应用于一个周期的结果模型
。随后，该模型中所有原子的B因子设置为20 ，并且原子的原子坐标和温度因子通过“ phenix.refine
”在2.15–20.0Å的分辨率范围内进行了完善，并通过COOT56与手动修饰。我们使用“ phenix.refine”和真实空间进行了使用COOT进行互补的空间细化
，直到将残基和辅因子的结构限制在限制为止 。然后，将OEC和水分子添加到模型中。Geometric restraints of the OEC are based on the Mn4CaO5 cluster solved at 2.15 Å using microcrystals at cryo-temperature (PDB code: 6JLJ)6, with a loose distance restraint of σ = 0.06 Å on Mn–O and Ca–O distances, whereas no restraints were provided for the Mn–Mn and Mn–Ca distances.从模型中删除了任何表现出负MFO-DFC信号或缺乏2MFO-DFC信号的预先存在的水分子
。在阳性球形MFO-DFC信号的位置构建了新的水分子 ，并在随后的倒数和真实空间修补后进行了检查以确认这些水分子。最后
，应用了TLS细化 。 　　为了在两弹性的时间延迟实验中改进1F模型，考虑到S1和S2状态之间的OEC几何形状并没有太大差异 ，我们对OEC和配体分配了一个构象
。在改进过程中
，MN -MN和MN – CA的距离不受限制，而Mn – O和Ca -O的距离将其限制为在2.15Å（PDB代码：6JLK）6的1F模型中观察到的值 ，并以宽松的约束（σ=0.06Å）进行了完善。由于存在W16时
，即使在低占用率时，由于MFO-DFC信号的出现 ，因此从模型中删除了W16 。相反
，保留W10是因为其缺失导致相应位置的显着正MFO-DFC信号
。 　　从精心设计的黑暗和1F模型中获得的相位用于计算黑暗和1F时间删除数据之间以及1F和2F时间删除的数据之间的同构差傅立叶图。在每个时间点的QA – QB，P680 ，Yz和OEC通道区域中检测到实质差异密度，其位置随时间而动态变化（图1-4和扩展数据图7） 。为了方便
，有效地完善动态中间结构，我们为所有残基 ，水分子和配体的双重构象在球形范围内的20Å范围内
，以OEC和非Haem铁的CA为中心，并具有与基态和中间状态的结构相对应的A和B构象
。在这种情况下 ，在结构中还内置了中间状态的不稳定水分子和残基。是否保存或删除这些水分子是通过检查MFO-DFC信号决定的 。例如
，对于W16，在1F之后变得非常不稳定 ，建立两个构型会导致W16上的强信号
。因此
，我们删除了W16的B构象。另一方面，对于其他不稳定的水分子（例如W7和W10） ，建立两个构型并没有导致MFO-DFC信号特别强
，因此保留了B构象 。根据闪存诱导的傅立叶变换红外（FTIR）测量值4,6,57，估计1F后S1/S2中的SI状态量为S1/S2 ，S2/S3的S1/0.6/0.51为0.4/0.6/0.51。根据这些比率，我们通过对S1和S2之间的那些原子或残基采用两个构象来构建1F结构
。S2状态结构针对密度图进行了完善
，而S1状态结构取自本研究中解决的黑暗结构。另一方面，在2F数据中 ， 未进入S3状态的PSII的结构是S1和S2的混合物 。由于S1和S2之间的较小的结构变化
，我们将结构固定在2F后未向S3状态的S2状态固定，并针对密度图改进了S3状态结构
。这些分配并不构成根据获得的密度对结构进行建模的主要问题。我们完善了B构象的XYZ坐标 ，然后完善了A和B构象的B因子
，最后施加了TLS细化 。 　　O6*被建模为具有0.51占用率的水分子，而不会在其与CA和附近水分子的距离上施加人工限制
。使用三种不同的O5 – O6距离研究了ΔT2=200μs和ΔT2= 5 ms的O6的结构：1.9Å ，2.2Å和2.4Å
，如理论计算37,58所示。通过评估相邻MFO-DFC信号的大小来确定最佳距离（扩展数据图6） 。 　　我们需要指出的是，尽管本研究中收集的XFEL数据具有很高的质量 ，并且获得的分辨率很高
，但在S1 -S2 -S3转变期间发生的细微结构变化方面存在不确定性，并且重要的是不要过度解释本研究中列出的晶体学数据
。 　　为了估计原子间距离中的错误 ，我们使用了重采样方法，创建了十个具有减少数据多重性的子结构。随后
，我们计算了这十个子结构中原子 - 原子距离的标准偏差 。我们通过JackKnifing Method59重新采样了XFEL数据
。我们从一个由100％图像组成的数据集开始，并通过合并75％随机选择的图像来创建十个子数据集。随后 ，我们针对这些子数据集完善了十个子结构 。为了启动子结构的完善
，我们使用了源自100％图像数据集的精心设计的结构作为开始模型，将所有原子的温度因子重置为20Å2 ，并应用模拟退火。之后
，我们对刚体，原子位置坐标 ，温度因子和TLS进行了改进
。在十个子结构中计算了原子 - 原子距离的标准偏差
，这些偏差用作与确定的结构中与相应的原子 - 原子距离相关的误差的估计（扩展数据图3）。 　　S3状态的密度功能理论（DFT）计算的OEC模型是根据PSII（PDB代码：6JLL）的XFEL模型（单体A）构建的 。This model comprises 408 atoms, including the inorganic Mn4CaO5 cluster, 4 terminal aqua/hydroxo ligands at Ca and Mn4, 15 crystal waters along with one extra hydroxide anion referred to as O6*, one chloride anion, and the following amino acid residues: D1-D61, D1-N87, Yz, D1-Q165, D1-S169,D1-D170, D1-N181, D1-V185, D1-F182 (backbone only), D1-E189, D1-H190, D1-N296, D1-N298 (fragment), D2-K317 (fragment), D1-H332, D1-E333, D1-A336, D1-H337, D1-D342,D1-A344（C Terminus），CP43-E354 ，CP43-R357
，CP43-L401，CP43-V410和CP43-A411
。对以前的计算型6,37进行的修订涉及将其掺入O6*旁边的五个水分子（称为“水轮 ”）以及四个支持氨基酸残基（D1-N296 ，CP43-L401，CP43-V410和CP43-A411）。使用B3Lyp Hybrid functional 60增强了D3版本的Grimme的经验分散式校正和Becke -Jojohnson domjjohnson domjohnson doom611111111111111111111111111111111111111111111111111111111111622AGN SON -622（LANL2DZ）CA和MN的伪基基集和6-31G（D）的所有其他原子63,64,65,66 。在扩展数据中显示的O6*的元稳定Ca2+型羟基形式的至关重要的需求是缺乏Yz激进分子（Tyrz – O•…+HN – HIS190）
，作为Ca2+含水较高的PKA值（在较高的PKA）中（较高的12..7 sque in Misties）67,67,67,67 aby 67,67,67,67,67,67（6.0）（参考文献69），甚至在蛋白质环境中
。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。