没有使用统计方法来预先确定样本量 。实验不是随机的 ，研究人员在实验和结果评估过程中并未对分配视而不见 。
重组野生型和突变体SARS-COV-2基于世界新兴病毒和arboviruses（WRCEVA）提供的USA-WA1/2020分离株序列 ，该中心最初是从美国疾病控制和预防中心（CDC）获得的，如前所述。野生型和突变体SARS-COV-2 ，以及重组小鼠适应的重组SARS-COV16,29 ，滴定并在表达TMPRSS2（SEKISUI Xenotech）的VERO E6细胞或Vero E6细胞上，在DMEM中生长为5％Fetal Bovine bib Cobine andotic co） 。Calu-3 2B4细胞在DMEM中生长 ，其定义为10％的胎牛血清 ，1％丙酮酸钠（Gibco）和1％抗生素 - 抗杀菌（Gibco） 。标准斑块测定法用于SARS-COV和SARS-COV-229,30。所有涉及传染病毒的实验均在德克萨斯大学医学分公司（UTMB），埃默里大学或华盛顿大学批准的生物安全水平（BSL）3实验室进行了常规医疗监控 。
如前所述15，野生型和突变病毒均来自SARS-COV-2 USA-WA1/2020传染性克隆 。对于ΔPrra构建 ，通过将重叠PCR与引物Δprra-f（5'-GactaAttcgtcgtagtgtgtgtagtagtagtagtcaatccatc-3''）和Δprra-R（5ʹ-gactagctacctacctaccatacgagagaagaagaagtctctc-gaggagtc-3''一起引入突变。通过限制酶消化和Sanger测序验证了所得的质粒。此后 ，通过限制酶扩增含有野生型和突变体SARS-COV-2基因组片段的质粒 。根据先前所述的程序15，将SARS-COV-2基因组片段纯化并在体外结扎以组装全长cDNA 。然后进行体外转录反应以合成全长基因组RNA。为了恢复病毒 ，将RNA转录物电穿孔到VERO E6细胞中 。感染后40小时收集的电穿孔细胞的培养基作为种子库存 ，以进行随后的实验 。使用前通过序列分析确认病毒突变体。Δprrasars-cov-2的合成结构得到了UTMB机构生物安全委员会的批准 。
如前所述15,31，在Vero E6和Calu-3 2B4细胞中进行病毒感染 。简而言之 ，用PBS洗涤细胞 ，并在37°C下以0.01的MOI为0.01，用SARS-COV或SARS-COV-2接种。接种后 ，洗涤细胞并添加新鲜培养基以表示时间0 。在每个描述的时间收集了三个或更多的生物学重复 。在任何样品收集中均未使用盲目性 ，样品也随机分配。Mac 2011的Microsoft Excel用于分析数据 。
Vero E6或Calu-3 2B4细胞以0.01的MOI感染了野生型或Δprra突变病毒 。感染后24或48小时，收集培养基并通过低速离心阐明。随后 ，使用Beckman SW28转子 ，通过20％的蔗糖垫子在26,000 rpm的20％蔗糖垫中通过超离心垫使上清液中的病毒颗粒颗粒。使用2×Laemmli样品缓冲液（CAT 。161-073，Biorad）从颗粒中制备蛋白质裂解物 。通过先前描述的16,32,33,34，通过SDS -PAGE ，然后进行蛋白质印迹分析确定相对病毒蛋白水平。简而言之 ，通过在Laemmeli Buffer中煮沸，使蔗糖纯化的SARS-COV ，SARS-COV-2和ΔPRRASARS-COV-2失活 。将样品等同量加入4–20％迷你螺旋体TGX凝胶（BioradNo 。4561093） ，并通过SDS-PAGE充电。将蛋白质转移到二氟乙烯（PVDF）膜中 。用SARS-COV S特异性抗体（Novus BiologicalsNo 。NB100-56578）覆盖膜，然后用辣根过氧化物酶（HRP）偶联的抗兔抗体（细胞信号技术7074S）探测。用SARS-COV N特异性抗体（由S. Makino提供）和HRP偶联的抗Rabbit二级IgG剥去印迹并重新探测印迹 。在这两种情况下 ，都通过在Chemidoc MP系统（Bio-RadNo 。12003154）上处理清晰的西ECL底物（Bio-RadNo。1705060）成像来开发信号 。使用Imagelab 6.0.1（Bio-RadNo 。2012931）进行光密度法。
对于竞争分析 ，比率（50：50，90：10和10:90野生类型：ΔPrra）由源自病毒量的PFU确定。如“体外感染”中所述 ，以0.1（野生型和ΔPRRA）感染Vero细胞 。使用Trizol试剂（Invitrogen）收集来自细胞裂解物的RNA 。然后根据制造商的指导 ，使用Direct-Zol RNA Miniprep Plus套件（Zymo ResearchNo。R2072）从三唑中提取RNA 。然后将提取的RNA用iScript cDNA合成试剂盒转化为cDNA（BioradNo 。1708891）。使用CFX Connect仪器（Bio-RadNo 。1855200）在Luna Univers QPCR Master Mix（New England BiolabsNo 。M3003）中进行RT – QPCR。为了区分竞争实验中的野生型SARS-COV-2和ΔPRRASARS-COV-2基因组，底漆1（正向：AATGTTTTTTTTTTTCAAACGTGCAG）和引物2（反向：Tacactacgtgccccccgccgcgcgcggg）仅用于检测野生型基因组 。为了检测总基因组 ，使用了底漆1和底漆3（反向：GaattttttccaCcaagtgaca） 。使用八点标准曲线（每μL的1×101至1×108副本）来量化信号。所有测定的引物退火温度为63°C 。
为了检测病毒RNA ，用野生型SARS-COV-2或ΔPRRASARS-COV-2，RNA提取，cDNA合成和RT-QPCR感染了鼻腔洗涤和口腔拭子 ，如前一段中所述进行 。对于RT – QPCR ，用于所有仓鼠样品，使用底漆1和底漆3。
如前所述 ，使用Click-Seq协议使用300 ng的RNA制备RNA库 ，如先前所述35，使用瓷砖引物与SARS-COV-2基因组相关（登录号NC_045512.2）和Truseq I7 LT Adapter系列和I5 HEXAMER系列和I5 HEXAMER辅助器 ，其中包含12N Ne norecular diquarular diquarular diquarular diquarular diquarular。在Illumina Miseq平台上使用Miseq Reagent Kit v.2进行了测序 。使用Miseq Reporter软件使用TRUSEQ索引将原始数据脱离了磁性数据 。FastP v.0.1236用于修剪适配器序列和低质量读取（Q <25） ，以删除长度少于40 nt的读取，并将唯一的分子标识符序列复制到读取名称上。使用 - 最佳参数将读取与Bowtie对齐 ，最多允许两个不匹配 。对齐索引是由单个.fasta文件生成的 ，该文件包含两个600-NT参考序列，涵盖了wild型的PRRA基因座（23,603–23,616）（登录号NC_045512.2）和ΔPRRA基因组 。使用samtools v.1.937对对齐进行排序和索引 ，使用umi_tools38删除了PCR重复项。用BedTools v.2.25.039中的GenomeCov功能确定每个位置的覆盖范围 。
如前所述23 ，使用Mneongreen SARS-COV-2报告基因中和分析进行中和测定 。简而言之，将VERO E6细胞铺在黑色μCLEAR平底96孔板上（Greiner Bio-One）。第二天，将血清或单克隆抗体从1/20稀释 ，9双稀释液以1/5,120的最终稀释度稀释 ，并与Mneongreen SARS-COV-2或ΔPRRA孵育，在37°C下表达Mneongreen 1 h 。将病毒 - 体系混合物转移到最终MOI 0.5的Vero E6细胞板上 。20小时后 ，添加Hoechst 33342溶液（在Hank平衡盐溶液（Gibco）中稀释400倍以染色细胞核 ，并用呼吸呼吸的密封膜（多样化的生物技术）密封，在37°C下孵育20分钟 ，并在37°C下孵育20分钟 ，并在染色体上量化了均荧光7（Biototek）。使用默认设置进行处理和缝合的4倍物镜，将原始图像（2×2蒙太奇）获取 。对每个孔定量了总细胞（用核染色表示）和绿红阳性细胞 。通过将孟生部阳性细胞数除以总细胞数来确定感染率。通过将经血清处理组的感染率标准化到非官员处理的对照组的感染率来获得相对感染率。使用Prism 8（GraphPad）绘制了相对感染率与血清稀释液（Log10转化值）的曲线 。使用非线性回归方法来确定中和50％的芒果荧光（NT50）的稀释褶皱 。每种血清均以重复物进行测试。
使用与邻居搭配的系统发育树配对的一组代表性的2B冠状病毒构建热图（v.9.1.5）（v.9.1.5） ，使用S氨基酸序列得出以下登录号：QHU79204（SARS-COV-2 WA1）（SARS-COV-2 WA1） ，QHR6333300.2（QHR633300.2）（QHR633300.2（QHR63300.2）（rathr633300.2），QND（rathu） ，qnd ndd ndd ndd ndd ndd nd.AGZ48828.1（WIV1） ，AGZ48806（RSSHC014），ALK02457（WIV16）和AYV99817.1（SARS-COV URBANI） 。使用Evolview（http://www.evolgenius.info/）和SARS-COV CO-V-2 WA1可视化序列身份 。使用Swiss-Model40,41生成结构模型，以根据SARS-COV-1 TRIMER结构（蛋白质数据库代码6ACD）生成带有和没有Furin裂解位点的SARS-COV-2 S蛋白的同源模型。在Macpymol（1.3版）中对同源模型进行了可视化和操纵 。
将SARS-COV-2感染细胞的上清液在3,000g下离心10分钟 ，以去除大细胞碎片 。将镍网格与澄清的上清液一起孵育10分钟 ，然后进行戊二醛固定和2％乙酸铀酰染色。使用JEM 14000（美国JEOL）拍摄显微照片 。成像几个随机选择的场以获得无偏的粒子计数 。
叙利亚仓鼠（7-8周大，86-127 g）购自Envigo。所有程序均根据由UTMB机构动物护理和使用委员会批准的动物协议进行 ，并遵守美国农业部指南 ，并在经过评估和认证实验室动物护理协会认可的实验室中 。在加尔维斯顿国家实验室BSL-4实验室进行了与仓鼠的感染性SARS-COV-2合作 。仓鼠被安置在BSL-4实验室中配备有HEPA过滤器的微型固定器笼中。仓鼠通过鼻内接种的105 PFU野生型或Δprrasars-cov-2挑战。每天观察仓鼠的临床疾病发展，并且在研究的前10天 ，然后每天第三天服用体重 。对于每种操作（病毒感染 ，恢复轨道出血，鼻洗或口腔拭子） ，用异氟烷（胸肌）麻醉仓鼠 。
根据《国家卫生研究院的实验动物的护理和使用指南》中的建议进行了小鼠研究。这些方案得到了华盛顿大学医学院的机构动物护理和使用委员会的批准（保证号A3381-01） ，并在ABSL-3设施中进行 。从杰克逊实验室获得了杂合K18-HACE C57BL/6J小鼠（菌株2B6.CG-TG（K18-ACE2）2PRLMN/J），并在到达后随机分配 。将小鼠置于7.5×11.5×5'''笼中≤5的组和喂养标准的盘子饮食（Picolab啮齿动物饮食5053 ，Purina）。笼子每周更换 。ABSL-3房间保持在20.0至23.3°C之间 ，30-60％和12 h – 12-h灯光循环（06:00至18:00 h） 。两性小鼠均用于实验。将小鼠组为≤5个个体的组中的小鼠，在维持20.0至23.3°C的房间中，湿度为30–60％ 。随意获得水和Picolab啮齿动物饮食5053 Chow（Purina） 。病毒接种是在麻醉下进行的 ，该麻醉是用氯化氯化氯化物和甲苯嗪诱导和维持的。尽一切努力使小鼠的痛苦最小化 。在50μl的鼻内剂量中 ，将不同年龄的小鼠（5-9周龄）和两个性别的小鼠施用了103 PFU的SARS-COV-2 。
将肺匀浆与Triton-X-100（最终浓度1％）在室温下孵育1小时，以使SARS-COV-2灭活。然后 ，使用EVE技术分析了匀浆的细胞因子和趋化因子 ，使用其小鼠细胞因子阵列和趋化因子阵列31-PLEX（MD31）平台。
用氯胺酮和甲基嗪（分别为100 mg kg -1和10 mg kg -1腹膜内）麻醉小鼠 。通过解剖颈部区域分离气管，并使用18号钝器金属套管（典型的0.18 cmh2O每毫升典型电阻）插管 ，该套管用尼龙缝合线固定在适当的位置 。然后 ，将鼠标通过套管连接到弹性计算机控制的活塞呼吸机（SCIREQ），该插管连接到FX适配器Y-Tubing上。开始机械通气 ，并通过腹膜内途径为小鼠提供额外的100 mg kg -kg -1氯胺酮和每只小鼠的瘫痪胰腺溴化胰腺溴化胰岛 ，以防止针对呼吸机和测量过程中进行呼吸 。使用小鼠的默认设置对小鼠进行通风，其中包括在3 CMH2O时的正末端呼气压力 ，10 ml kg-1潮汐体积 ，每分钟150次呼吸的呼吸速度和0.21的灵感氧气（即房间空气） 。如前所述42，使用强制振荡技术评估了呼吸力学，并使用最新版本的Flexivent操作软件（Flexiware v.8.1.3）评估了呼吸技师。还进行了压力 - 体积回路和灵感能力的测量 。
在1,000μL的DMEM中 ，在含2％热灭活的FBS的1,000μLDMEM中称重小鼠组织并用锆石珠（Roche Life Science）中的锆珠匀浆 。通过以10,000 rpm离心3分钟来阐明组织匀浆 ，并使用Magmax mirvana总RNA分离试剂盒（Thermo Scientific）上从50μL上清液中提取RNA，上源于翠鸟fisherer弹性提取机器人（Thermo Scientific）。使用Taqman RNA至CT 1步套件（Thermofisher）对RNA进行反转录和扩增 。在48°C下进行逆转录15分钟 ，然后在95°C下进行2分钟 。在50个周期中完成扩增：95°C 15 s和60°C持续1分钟。使用先前发表的分析确定样品中SARS-COV-2 N基因RNA的副本22 。简而言之 ，塔克曼测定法旨在靶向n基因的高度保守区域（正向引物：atgctgcaatcgtgctacaa;反向引物：gactgccgcctctgctc; probe; probe：/56-fam/tcaaggaac/tcaaggaac/zen/zen/aacattgccaaa/aacattgccaa/aacattgccaa/3aibkfq/） 。该区域被包括在RNA标准中，以使每个反应的副本测定下降至10份。反应混合物分别含有底漆的最终浓度和500和100 nm的探针。
在安乐死时 ，使用3毫升注射器和插入气管中的导管用大约1.2 mL中性缓冲福尔马林膨胀肺 。将气道 ，肺部和心脏移除，并转移到含有40 ml 10％中性缓冲福尔马林的圆锥烧瓶中 ，其中允许组织固定以悬挂中性的中性福尔马林缓冲福尔马林≥7天 。将组织嵌入石蜡中 ，华盛顿大学肺形态核心将切片用降血石和曙红染色。使用华盛顿大学Alafi神经影像核心的纳米室（Hamamatsu）捕获图像 。
本文中描述的重组野生型和突变体SARS-COV-2可以通过材料转移一致性通过UTMB的WRCEVA获得 。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。
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