C57BL/6只小鼠（JAX 000664）
，CD45.1小鼠（B6.SJL-PTPRCA PEPCB/BOYJ，JAX 002014） ，CD90.1小鼠（B6.pl-thy1a/cyj
，Jax 0006），JAX 0006） ，CD11CCCER MICE（b6.cg-tg）（b6.cg-tg（jax）008068）
，I-ABFL/FL小鼠（B6.129×1-H2-AB1B-TM1KONI/J，JAX 013181）和ROSA26LSL-TDTOMATO/LSL-TDTOMATO/LSL-TDTOMATO小鼠（b6.cg-gt（rosa）26sortm14（Cag-jax）来自杰克逊实验室。RORCFL/FL ，RORC（T）GFP/GFP
，RORC（T）CRE和HH7-2TG小鼠在我们的实验室中产生，已描述为16,32,50,51 。M. Oukka提供了IL23RGFP小鼠52
。S. R. Schwab提供了OT-II; UBC-GFP; RAG1 - / - 小鼠53,54,55。B. Spiegelman提供了PRDM16FL/FL小鼠56 。如“生成Bac Transgenic Reporter和CRISPR敲除小鼠
”中所述产生的TG（δ +3 kb rorc（t）-mcherry） ，rorc（t）+6 kb - / - 和rorc（t）+7 kb - / - 小鼠
。在纽约大学医学院的亚历山大生命科学动物设施中
，在特定的无病原体疾病的亚历山大生命科学动物设施中饲养并维持小鼠。在治疗开始时，所有实验中使用的性别和年龄匹配的小鼠在治疗开始时均为6-12周 。样本量没有预先确定 ，但在每个结果中都列出，并且在同意识中发生随机分组
。所有动物程序均根据纽约大学医学院机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。 　　如先前所述
，产生了Tg（δ+3 kb rorc（t）-mcherry）小鼠 。以下引物用于生成用于galk重组的扩增子，并筛选正确插入和随后删除galk cassette：galk rec +3 kb f：ctgcctcccacgtgctgctaggtgctaggattgtgtaagtaagcatagcataggccatgccctgcctgctccctccccctcccctcccctgtgaccacttgacacaattaattcatcatcatccgggga一下；galk rec +3 kb r：acagacagataccattccttggcctgctgcttcctcctcctcctgtggtcctgctgtgtcagcactgtcctgtcctgctcctt;+3 kb ha f：ctgcctcccacgtgctaggtagtaataatagcatagcaggccctgctcctcca;+3 kb ha r：acagacagataccattccttgggcctgcttccttcctcctcagtggtcctggctg;+3 kb屏幕F：ctgcctcccacgtgctaggat;+3 kb屏幕r：acagacagataccattccttggg
。The following primers were used for the recombineering that led to scarless deletion of cis element: deletion template +3 kb HA F: CTGCCTCCCACGTGCTAGGATTGTAATATAGAGCATCAGGCCCTGCTCCACAGCCAGGACCACTGAGGGAAGCCAGGCCCAAGGAATGGTATCTGTCTGT;删除模板+3 kb ha r：acagacagataccattccttggcctgctgcttcctcctcagtggtcctggtgtgtggtggcaggcagggcctgcttgcttatatataTtacaAtcctagcaccgtggtggtggggaggaggcag。 　　单个指南RNA（SGRNA）是在+6 kb和+7 kb区域的侧翼保守区域设计的 ，该区域将使用成对的指南删除 。将SGRNA克隆到PX458中
，以用作PCR模板，以生成用于体外转录的模板。将体外转录的SGRNA和Cas9 mRNA微注射到Zygotes中 ，以生成通过PCR筛选缺失的创始人动物
。对于含有预期或有趣缺失的小鼠
，将PCR产物克隆到克隆并测序以确定缺失的位置。选择具有干净缺失的创始人小鼠将其繁殖至C57BL/6小鼠以生成线条 。以下引物用于克隆SGRNA序列到BBSI位点（小写字母代表BBSI同源）：+6/7 kb sgrna-1 f：caccgtttttttttttttttgtgtgataCccttc;+6/7 kb sgrna-1 r：aaacgaagggtatcacaaagaaaaac;+6/7 kb sgrna-2 f：caccggagacaactgaaatcgt;+6/7 kb sgrna-2 r：aaacacgatttcagttgtgtctcccc;+6/7 kb sgrna-3 f：caccgtggacccaagtgttactgcc;+6/7 kb sgrna-3 r：aaacggcagtaacacttgggtccac
。 　　以下单克隆抗体购自Thermo Fisher，BD Biosciences ，Biolegend或Abcam：CD3ε（145-2C11
，1：250），CD4（RM4-5 ，1：250）
，CD11b（CD11b（M1/70，1：250） ，CD11C（N418，1：250）
，CD25，CD25 ，PC61
，PC61，PC61。（3/23 ，1：250）
，CD44（IM7，1：250） ，CD45（30-F11
，1：100），CD45.1（A20 ，1：100）
，CD45.2（104，1：100） ，CD62L（MEL-14，1：1：250）
，CD90.1（CD90.1：51，1：250） ，1：250.2（530.2）（SB/199
，1：250），CXCR6（SA051D1和DANID2 ，1：250）
，CCR6（140706，1：250） ，NCR1（29A1.4
，1：250），MHCII I-A/I-E-E（M5/114.15.2 ，1：100）
，LY6G（1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：2250，1：1：1 A.8 ，1A 。（E50-2440，1：250）
，B220（RA3-6B2，1：250） ，TCRVα2（B20.1
，1：250），TCRβ（H57-597 ，1：250）
，TCRVβ5.1/5.2（MR9-4，1：250） ，TCRVβ6（MR9-4
，1：250）（Gl3）1:250), IL-22 (IL22JOP, 1:250), FOXP3 (FJK-16s, 1:250), RORγt (B2D and Q31-378, 1:250), GATA3 (TWAJ, 1:100), T-bet (O4-46, 1:100), BCL6 (K112-91, 1:100) and PRDM16（EPR24315-59，1：250）
。PE结合的F（AB'）2-Donkey抗兔IgG（H+L）（Thermo Fisher ，12-4739-81
，1：250）用作检测PRDM16的二级抗体。抗小鼠CD16/32（Bio X细胞克隆2.4G2，1：500）用于阻断FC受体 。活/死固定的蓝色（Thermo Fisher ，L34962，1：1,000）被用来排除死细胞
。NIH四聚体核心设施提供了I-AB OVA328–337四聚体（Haahaeinea）。 　　为了标记OVA特异性T细胞
，将细胞与四聚体（1：100）在表面染色之前在37°C下孵育60分钟 。对于细胞内染色，将细胞染色以进行表面标记 ，然后根据制造商的方案（Thermo Fisher设置的FOXP3染色缓冲液）在细胞内染色之前进行固定和透化
。为了进行细胞因子分析
，将细胞在完整的RPMI-1640培养基中（RPMI-1640（rpmi-1640）（含10％FBS，1％谷氨酰胺 ，1％甲状腺素1％二icicillin – Strypypylin-sod pyromcyrins）和1 mmmouvy sod sod sod sod sod sod sod sod sod sodymiuve和1 mmhepes
，在完整rpmi-1640培养基中，用IL-23（10 ng ml-1; R＆D系统）和戈尔吉斯托普（BD Biosciences）刺激细胞3 h 3小时。使用FACSDIVA V8.0.1（BD Biosciences）或使用Spectroflo v3.03（Cytek Biosciences）（Cytek Biosciences）在LSR II和ARIA上进行流式细胞仪 ，并使用FlowJo软件（Tree Star）进行分析 。 　　为了从淋巴结和脾脏分离细胞
，用1-ml注射器的柱塞机械地破坏了组织，并通过70μm的细胞滤网。使用带有RPMI-1640洗涤培养基的注射器（RPMI-1640 ，含3％FBS
，10 mM HEPES，1％谷氨酰胺 ，1％戊二酰胺，1 mM钠钠钠和1％的青霉素 - 链霉菌素）
，通过使用股骨骨骼从股骨骨头冲洗骨髓来分离骨髓细胞
。红细胞用ACK裂解缓冲液（Thermo Fisher）裂解。通过插入气管中的导管用0.75 mL PBS冲洗肺两次通过冲洗肺两次收集支气管肺泡灌洗液 。 　　将肺组织切成小碎片，在37°C下消化45分钟 ，在RPMI-1640洗涤培养基中摇动
，其中含有0.5 mg Ml-1胶原酶D（Sigma）和0.25 mg ml-1-1 DNase I（Sigma）
。去除佩耶的斑块和盲肠斑块后，纵向打开肠子 ，切成0.5厘米的碎片
，然后用PBS洗涤两次。然后在HBSS洗涤培养基（没有Ca2+和Mg2+，含3％FBS和10 mM HEPE的HBSS WASH培养基中摇动肠道组织 ，在37°C下用1 mM DTT和5 mM EDTA持续20分钟
，重复两次 。用HBSS洗涤培养基（无DTT和EDTA）洗涤后，将组织在RPMI-1640洗涤培养基中消化 ，其中包含1 mg Ml-1胶原酶D（Sigma）
，0.25 mg ml-1 dnase I（Sigma），Sigma）和0.1 U ml-1 Dispase（worthington）在37°C中较小（35）肠）
。在40％/80％的Percoll梯度（GE Healthcare）的界面上收集白细胞。 　　C.啮齿动物菌株DBS100（ATCC51459; American Type Coruture Coluston）在LB肉汤中生长在37°C 。通过口服饲料接种0.2 mL细菌悬浮液（2×109 CFU）的小鼠
。在接下来的14天内遵循小鼠 ，以测量体重改变。收集粪便颗粒，并用于测量MacConkey琼脂板上的连续稀释液的啮齿动物负担 。 　　HH由J. Fox提供
。如先前所述32
，对HH进行了培养和给药。将冷冻的HH库存等分试样储存在布鲁氏菌肉汤中，含20％甘油 ，在-80°C下冷冻 。将细菌在血琼脂板上生长（TSA
，绵羊血液5％，Thermo Fisher）。将接种板放入缺氧室（Billups-Rothenberg）中 ，并将厌氧气体混合物组成
，包括80％氮，10％氢和10％二氧化碳（AIRGAS）的氧化物添加以产生微氧化物氛围 ，其中氧气浓度为3-5％
。在动物接种前
，将含有细菌板的微氧化罐放在37°C下4天。对于口腔感染，将HH重悬于布鲁氏菌肉汤中 ，通过将无菌棉签涂抹器的尖端施加到菌落表面 。通过口服烤器对每只小鼠施用0.2 mL细菌悬浮液
。4天后将小鼠接种二剂。 　　如先前所述的32
，对HH7-2TG CD4+ T细胞的过继转移进行了较小的修改 。接收器转移前8天，用口腔堵嘴将受体小鼠与HH定殖
。收集了CD90.1; HH7-2 TCR-转基因小鼠的淋巴结并机械拆卸。在ARIA II（BD Biosciences）上 ，将幼稚的HH7-2TG CD4+T细胞分选为CD4+TCRβ+CD44LOW/-CD62L+CD25-Vβ6+CD90.1+（HH7-2TG） 。将细胞重悬于冰上的PBS中，然后将100,000个细胞通过恢复轨道注射转移到同类同种型受体小鼠中
。转移后14天对细胞进行分析。 　　如先前所述的57
，对OT-II CD4+ T细胞的产物转移进行了较小的修改 。收集了来自OT-II; UBC-GFP; RAG1 - / - 小鼠的淋巴结并机械解离
。在ARIA II（BD Biosciences）上，将天真的OT-II CD4+T细胞分选为CD4+TCRβ+CD44LOW/-CD62L+CD25-Vα2+Vβ5.1/5.2+GFP+（OT-II）。将细胞重悬于冰上的PBS中 ，然后通过恢复轨道注射将100,000个细胞转移到受体小鼠中 。接收者小鼠连续4天通过口服烤肉（50 mg; A5378; Sigma）接收OVA
，然后在转移后7天后再饮用含有OVA（2.5 mg ML -1）的饮用水。转移后5天对来自MLN的细胞进行分析，并在转移后12天分析肠细胞
。 　　为了产生嵌合小鼠 ，将4至5周龄的野生型CD45.1小鼠用2-5小时的每只小鼠500 rad辐照两次（X-RAD 320 X-RAY辐照器）。一天后
，将小鼠与野生型CD45.1/2小鼠获得的骨髓细胞（3至4×106）重构，与CD45.2Δ+7 kb突变体或窝窝对照骨髓细胞混合在一起 ，以达到50:50嵌合体 。在广谱抗生素（0.8 mg -1磺胺甲恶唑和0.16 mg ML -1甲氧苄啶）上
，将小鼠保存一周，然后将小鼠保存一周 ，然后进行微生物组重建
。至少8周后
，收集组织进行分析。 　　连续4天用50毫克的OVA口服口服耐受小鼠 。最后一次野牛六天后，将小鼠敏感3次 ，相距1周，腹膜内注射100μg的OVA与1 mg校友混合（1：1; Alhydrogel辅助2％; vac-alu-50; Invivogen）
。最终敏化后的七天
，每隔一天，每隔40μg的OVA就鼻内挑战小鼠 ，总共面临三个挑战。上次鼻内给药后24小时分析小鼠 。 　　为了诱导耐受性
，每天通过口服烤一次给小鼠50毫克的OVA，持续四天
。最后烤后六天 ，通过口服5 mg的OVA与10μg霍乱毒素（C8052; Sigma）相结合
，将小鼠敏感，每周每周进行三次施用。最后一个敏化后的七天 ，给予了200μgOVA的腹膜内挑战 。挑战后
，每15分钟每15分钟测量一次直肠温度，共75分钟 ，使用J/K/T型热电偶温度计（Kent Scientific）
。第二天收集血清
，以测量抗OVA IgE和IgG1水平。 　　将肺组织灌注并用10％缓冲的福尔马林磷酸盐固定，嵌入石蜡中并切开 。如前所述58 ，对肺部的肺切片进行染色，并以盲目的方式对组织病理学进行了评分
，并进行了较小的修饰。简而言之，通过在气道和血管周围评分细胞浸润来评估肺部炎症：0 ，无浸润；1
，一些炎性细胞；2，炎性细胞的环1细胞层深；3 ，炎性细胞的环2-3个细胞深；4
，炎性细胞的环4-5个细胞深；和5，炎性细胞的环大于5细胞
。每只小鼠的炎症评分计算为来自五个肺叶的得分的平均值。 　　用4％多聚甲醛固定肠道组织 ，嵌入石蜡中并切开 。如前所述59
，用H＆E对肠道染色，并以盲目的方式对组织病理学进行了评分
。 　　根据制造商的建议 ，测量了总IgE（432404; Biolegend）
，抗OVA IGE（439807; BIOLEGEND）和抗OVA IgG1（500830; Cayman Chemical）的水平。 　　如前所述23,60 。简而言之，将20-50,000个排序纯化的细胞在500克的固定转子离心机中颗粒5分钟 ，用50μl冷PBS缓冲液洗一次，然后在500克再次向下旋转5分钟
。轻轻吸管细胞以将细胞沉淀重悬于50μl冷裂解缓冲液中（10 mM Tris-HCl
，PH7.4，10 mM NaCl ，3 mM MGCL2
，0.1％Igepal Ca-630）持续10分钟。然后在500G下立即向下旋转10分钟和4°C，然后将上清液丢弃并立即进行TN5换位反应 。轻轻的移液器重新悬浮核中的核反应混合物中
。将37°C的转座反应孵育30分钟。转座后立即使用Qiagen Minelute试剂盒进行纯化 。在10μL洗脱缓冲液（10 mM Tris缓冲液 ，pH 8.0）中洗脱转置DNA
。然后
，使用NEBNEXT高保真2×PCR主混合物进行5个周期的高保真。为了减少PCR中的GC和尺寸偏差，使用定量PCR（QPCR）监测PCR反应 ，以使用QPCR侧反应在饱和之前停止扩增 。其余45μlPCR反应所需的额外数量的循环被确定如下：（1）绘图线性RN与循环；（2）设置5,000 RF阈值；（3）计算No。对应于最大荧光强度的1/4的循环
。使用Qiagen PCR清理套件纯化扩增的文库
，并在20μl洗脱缓冲液（10 mM Tris缓冲液，pH 8）中洗脱。然后将纯化的库以高灵敏度挂接进行运行 ，以确定是否实现了适当的标记（带模式
，在凝胶的顶部或底部不是太大的无电dna或小超过的DNA） 。成对的50 bp序列是从Illumina Hiseq2500上的样品中产生的
。将序列用Bowtie2（2.2.3）映射到小鼠基因组（MM10），并根据映射分数（MAPQ> 30 ，SAMTOOLS（0.1.19））进行过滤，并删除了重复项（PICARD）。 　　从3周大的δ+7 kb突变体（n = 7）的MLN和它们的同立立与对照组（n = 7）
，以及从17-至22天大的Rorc（t）ΔCD11c突变（n = 4）和littermate（n = 4）对照（n = 4）对照（n = 7）和littermate对照组（n = 7），从3周大的δ+7 kb突变体（n = 7）中分选了活的CD45+LIN-MHCII+细胞（图2A – D） 。谱系标记包括TCRβ ，TCRγδ
，B220和LY6G
。所有库均使用Chromium Next Gem单细胞3-Prime Kit v3.1（10x基因组学）制备，并按照供应商的协议进行了测序 ，并在Illumina Novaseq X+ Sequencer上进行了测序。 　　LIVE
，CD45+LIN-MHCII+TDTOMATO+细胞，以及CD45+Lin-MHCII+TDTOMATO-CD11C+细胞的八分之一（图2E）（图2E） ，从3周大的Rorc（T）Crerosa26wt/Lsl-lsl-tdttdttdttdtdttmato和N = 4 = 4 = 4 = 4 = 4 = 4 = 4 = 。使用用于单细胞多组ATAC和基因表达测序的证明方案（CG000365; 10x基因组学）进行核分离
。所有文库均使用铬铬单细胞多组ATAC +基因表达试剂盒（10x基因组学）（按照供应商的协议）制备
，并在Illumina Novaseq X + Sequencer上进行测序。 　　一旦确定了死者（脑死）供体以挽救生命的临床器官，我们与移植手术手术室协调了立即通知 。我们从一名维持生命支持的22岁患者中采购了四个MLN ，从手术切除到板凳上的组织消化的时间很少
，导致> 92％的可行细胞
。该供体没有慢性疾病和癌症，对乙型肝炎 ，丙型肝炎和HIV负阴性。正如NYU Langone机构审查委员会所证实的那样，这项研究不符合人类受试者的研究
，因为从一个被取消识别的死者个人获得了组织 。 　　节点在Belzer UW冷藏溶液中运输，并切除过多的脂肪。消化缓冲液包含带有0.2 mg ML -1释放酶热蛋白培养基和2.5 mg ml -1胶原酶D的RPMI培养基D
。每个节点均用31克注射器刺穿 ，并注入消化缓冲液
，直到饱满，并在37°C下在37°C下在30分钟内浸入同一30分钟。放置在100μm滤波器上 ，用注射器柱塞打开节点
，用过量的RPMI洗涤以最大程度地恢复细胞 。悬浮液用活/死的Efluor780（Thermo Fisher），CD19和CD3（Biolegend Hib19和UCHT1）和HLA-DR（BD Biosciences L243）染色
。最初 ，细胞门控以富集可行的非淋巴细胞单线（图5A）。我们不知道人类节点内的MHCII表达水平先验
，因此我们选择分类多种HLA-DR+染色细胞，仅省略了最底部的四分位数 。对61,232个单元进行排序 ，最终允许在10倍微流体芯片的2道泳道上加载26,000个
，然后进行与小鼠实验相同的库制备和测序
。 　　将RNA序列数据对准以参考基因组MM10-2020-A（小鼠）或GRCH38-2020-A（人），并由Cell Ranger（v7.1.0）计数 ，并用默认的质量控制参数计数。对每个数据集进行过滤，清除少于500个检测到的基因
，具有异常数量的基因（超过10,000多个），线粒体基因比例高的细胞（超过5％） 。我们计算了已知的S期和G2/M相基因基因的细胞周期评分 ，并将这些变量以及线粒体和核糖体蛋白基因回归
。 　　我们利用了一个完全无监督的计算工作流
，该工作流程在总体中分析了所有细胞，利用Seurat版本5.1（包括Scransform函数）中的最新方法61用于基因表达的归一化 ，基于锚固的集成（基于3,000个特征）
，以及共享的最近的网状集群群集识别。我们使用保留50个维度的主成分分析进行了尺寸降低，并将莱顿算法设置为分辨率= 1.0进行聚类 。这将细胞与跨突变体和对照动物的共享生物态匹配 ，以确保最终簇不受任何条件下的影响驱动
。将RORC（T）ΔCD11C小鼠SCRNA-SEQ数据集附加到δ+7 kb数据集上
，也以无监督的方式聚集，然后与以前的群体进行分析。仅使用标准质量控制（未删除了先验的单元格类型） ，将所有可用的RAW公共数据集从基因表达综合和Chan Zuckerberg Cellxgene存储库中进行过滤
，并与先前的数据同样集成 。人类SCRNA-SEQ数据集还主要接受了无监督的管道，但随后将NellC人群从并列的CDC2人群中手动群群体群群体进行了群体。 　　对于小鼠细胞类型注释 ，基于NCR1和TBX21（类型1），IL1RL1和IL4（类型2）或CXCR6
，CCR6，CCR6和NRP1（类型3）（类型3）（相对于Eomes和GZMA的持续人群）的典型人群
。CDC1占XCR1和CLEC9A的独特簇呈阳性。尽管Cdc2的子集（sirPa为阳性）均连续 ，但可以根据Clec4A4
，CD4和DTX1（CDC2A）的表达与CD209A，CX3CR1和MGL2（CDC2B）（CDC2B）进行分离 ，如前所述62 。我们观察到了两个相当大的CCR7+迁移树突状细胞
，它们表示为mig_dc_1和mig_dc_2，均与已知包括SOCS2 ，FAS和CXCL165,63的签名一致
。 　　对于人类细胞类型的注释
，IL7R，试剂盒和NRP1的表达划分了ILC3的群体。这是由表达NCR1和TBX21的ILC1簇以及表达Eomes的NK细胞并列的 ，所有这些都与先前的文献一致 。64
。XCR1和CLEC9A的簇呈阳性
，很容易区分为CDC1。与鼠标CDC2相比，对人类CDC2的了解鲜为人知 ，该CDC2可以自信的子集分配 。然而，我们可以确定SIRPA+人群与CD1C表达重叠
，就像人类CDC2S65所期望的那样
。我们注释了与此相邻的浆细胞样树突状细胞簇，因为这些细胞对CD1C呈阴性 ，而IL3RA呈阳性（CD123）
，并且包括TLR7和TLR9表达阳性的稀有细胞66。 　　所有SCATAC – SEQ分析均在标准工作流程下使用Signac版本1.14进行 。67
。简而言之，用ensdb.mmusculus.v79注释小鼠数据 ，并在适当的情况下转换为UCSC MM10注释
，并用ensdb.hsapiens.v98注释人类数据并转换为UCSC HG38注释。密度散点图建立了用于质量控制的有理阈值，基于转录起始位点得分 ，核小体带模式
，每个细胞的特征和线粒体基因过滤数据 。使用术语式文档频率（TF-IDF）进行归一化。在TF-IDF矩阵上用奇异值分解进行尺寸还原
。 　　与所有其他细胞类型相比，使用Wilcoxon rank-sum测试使用Wilcoxon rank-sum测试使用seurat Findmarkers算法鉴定DEG ，计算每种指示的细胞类型（NeldC
，CDC1和ILC3）中的倍数变化基因表达，并且与所有其他细胞类型相比 ，这是在小鼠和人数据集中分别执行的。测试仅限于证明log2（折叠变化）= 3.2上调基因的基因 。将根据该阈值定义每种细胞类型的DEG与其他物种进行了比较，并在指示的细胞类型中进行了比较
，以在扩展数据中生成Venn图
。图10B。在扩展数据中，在火山图中说明了所有141摄氏度 ，图10c的8度被鼠标neltcs分享了8摄氏度 。 　　执行了未配对的双面t检验
，配对的双面t检验以及Benjamini，Krieger和Yekutieli的两阶段升级方法使用GraphPad Prism ，版本10（GraphPad软件）进行了比较结果
。分析中没有任何样品被排除在分析之外。我们将低于0.05的P值视为显着差异 。*p <0.05
，** p <0.01和*** p <0.001
。有关重复数量和代表性数据的详细信息，请参见图传奇。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。