使用HPSC和IPSCS进行的实验符合纪念Sloan Kettering Cancer Center，Rockefeller University和Weill Cornell Medicine的纪念三机构的埃斯科罗。HPSC线WA09（H9; 46xx）和WA01（H1; 46XY）来自Wicell Stemcell Bank 。GPI :: CAS9线衍生自WA09 HPSC
。MSK-SRF001 IPSC来自纪念Sloan Kettering癌症中心。HPSC和IPSC通过STR验证 。HPSC和IPSC在无馈物条件下使用必需的8培养基（Life Technologies A1517001）维持在玻璃蛋白包被涂层的菜肴（VTN-N ，Thermo Fisher A14700）上。HPSC和IPSC用EDTA（0.5 m EDTA/PBS）作为团块作为团块传递
，并常规测试了支原体污染
。GPI :: Cas9敲入HPSC系是使用CRISPR – CAS9介导的同源重组生成的，该重组通过将H9 HPSC与cas9-t2a-puro靶向GPI基因下游的Cassette靶向盒子（补充图6B）。通过基因组PCR和CAS9 mRNA和蛋白表达验证了选定的克隆 ，分别通过RT -QPCR和Western blot验证，并筛选为核型带 。CHD5-KO和JADE2-KO WA09 HPSC线是由Ski干细胞研究核心在纪念Sloan Kettering Cancer Center（MSKCC）通过CRISPR-CAS9使用以下GRNA靶标生成的：JADE2
，CAGTTTGGAGCATCTTGATG
。小鼠epiblast干细胞（EPISCS）B6.129_4是纪念斯隆·凯特林癌症中心Vierbuchen实验室的礼物，如前所述64如前所述。大鼠原发性星形胶质细胞购自Lonza（R-CXAS-520） ，并根据制造商的说明进行培养 。 　　HPSC（通道40–50）使用基于双重SMAD抑制和WNT抑制的优化方案将HPSC分化为皮质兴奋性神经元
，如下所示
。使用ACCUTASE在单个细胞上分离HPSC，并以每个CM2的300,000细胞将其铺在含有10μMY-27632的必需8培养基中 ，以每CM2的300,000细胞（354234
，Corning）铺在覆盖的孔（354234，Corning）上。On day 0–2, cells were fed daily by complete medium exchange with Essential 6 medium (E6, A1516401, Thermo Fisher Scientific) in the presence of 100 nM LDN193189 (72142, Stem Cell Technologies), 10 μM SB431542 (1614, Tocris) and 2 μM XAV939 (3748, Tocris) to induce anterior神经外科模式 。在第3-9天 ，在存在100 nm LDN193189（72142
，Stem Cell Technologies）的存在下，每天用必需的6培养基（E6 ，A1516401
，Thermo Fisher Scientific）喂食细胞
。在第10-20天，每天用N2/B27培养基（1：1 NB：DMEM/F12基础培养基补充了1×N2和B27减去维生素A） ，以产生皮质NPC的神经源群体。N2和B27补充剂来自Thermo 。在第20天，NPC在干班疗法溶液（AMSBIO）中冷冻保存
，或者诱导的神经发生诱导，如以下：NPC在与Accutase 45分钟孵育后在单个细胞上分离在单个细胞上 ，并以每CM2的150,000细胞为150,000个CM2培养基磷酸 - 氨基氨酸氨基氨酸和lamamin/ fironectin-b27培养基（在NB）中
，在维生素A，1％ - 谷氨酰胺和1％的神经乳糖霉素中的1％ - 在神经质培养基中）在10μmNotch途径抑制剂抑制剂的存在下持续10天（直到第30天）
。对于长期培养 ，将神经元维持在补充了BDNF（450-10
，preprotech），GDNF（248-BD-025 ，R＆D Biosystems）
，CAMP（D0627，Sigma）和Ascorbic Acid（4034-100 ，Sigma）的NB/B27中。从第20天开始
，每4-5天喂一次细胞，以替换中等体积的50％ 。对于神经元 - 膜细胞共培养 ， 将大鼠的原代星形胶质细胞铺在NB/B27培养基中的聚 - 异氨酸和层粘连蛋白/纤连蛋白涂层板上，这些板上补充了BDNF
，GDNF，CAMP和抗坏血酸 ，并允许粘附几天。第25天
，使用ACCUTASE分离了HPSC衍生的神经元，并在大鼠星形胶质细胞的顶部播种
。神经元 - 核细胞共培养被维持在补充BDNF ，GDNF
，CAMP和抗坏血酸的NB/B27培养基上。 　　小鼠表皮干细胞（MEPISCS）B6.129_4被区分如下：在第0天，使用0.5 u µl-1胶原酶IV从馈线中取出HBSS++中的馈球 ，使用ACCUTase在ACCUTase中与单细胞溶液分离
，以每CM2的220,000个细胞为单位培养基，将其与单细胞溶液相关 ，并在基准中添加220,000个细胞
，将其pligel-cm2 pligeL-cm2/b2-b2/b2-b2/b210 µM Y-27632、100 nm LDN193189 、10 µM SB431542和2 µM XAV939 。每天用补充2 µM XAV939（第1天），100 nm LDN193189（第1-5天） ，10 µM SB431542（第1-5天）的MN2/B27喂食
。在第6天，NB/B27培养基中的每CM2和每CM2以200,000个细胞为每CM2的200,000个细胞以200,000个细胞为单细胞悬浮液
，并在Nb/b27培养基中进行回复（10％神经性培养基（10％神经性，90％Neurobasal a ，90％Neurobasal a
，1×B27 minus b27 minus pennus pennimus pennimus pen1 pen1％glutamin a，1％glutamax ，1％0.5％0.5％0.5％0.5％
，0.5％glutept s。BDNF，0.1％cAMP ，0.1％抗坏血酸
，0.1％GDNF）补充了10 µM Y-27632（第6天）和10 µM DAPT（第6和8天） 。每隔一天，每隔一天就会取代中等体积的50％
。 　　在第-1天 ，WA09（H9）HPSC与EDTA在37°C下与EDTA分离10分钟
，并允许在带有岩石抑制剂（y-27632，10μm）和Xav939的E8培养基中 ，在E8培养基中，在E8培养基中汇总10,000个细胞的球体
，每个细胞的球体，每个培养基的E8培养基（s-bio）（S-bio） ，对3744.3939393939393939.MIS。第二天（第0天）
，将培养基更改为E6补充100 nm LDN193189
、10μMSB431542和5μMXAV939 。在第5天，将培养基切换到补充100 nm LDN193189、10μMSB431542的E6
。如前所述 ，在第8天
，将培养基更改为基于N2/B27的类器官培养基65。从第0天到第14天，每隔一天更换一次培养基 。在第14天 ，在10厘米的盘子上将类器官转移到轨道振动器上
，并在星期一至周日至周五的时间表中更换了培养基的一半
。根据图中所示的实验，从第17-25天或第17-37天暂时对4μMGSK343或DMSO进行处理。 　　For birth-dating experiments of WA09 (H9) hPSC-derived cortical neurons, 3μM EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine, A10044 Invitrogen) was added to the culture for 48 h in the following time windows: d18–19, d20–21, d22–23, d24–25, d26–27, d28–29.处理后 ，将EDU洗净
，并在分化的第40天固定神经元并进行免疫染色 。从分化的第12天到第20天，对HPSC衍生的皮质NPC进行了染色质调节剂的小分子抑制剂的处理（图4B）。从第20天开始清洗小分子 ，然后从第20天开始撤回同步神经发生，并且从所有处理中得出的神经元保持在相同的条件下
。将小分子溶解在DMSO中
，并根据实验在2或4μm处添加到N2/B27培养基中。对于表观遗传抑制剂，在对照条件下以对照条件的形式添加了DMSO 。 　　对MEPISC衍生的NPC进行处理如下：对于EZH2I实验 ，在第4和第5天添加了0.04％DMSO或4μMGSK343
。在EZH2I+实验中
，在EZH2I+实验中，该处理延长了0.02％DMS​​O或2μmGSK343的使用 ，在10中添加了0.0m gsk343和8米。在第4天和第5天添加到媒介中 。 　　在研究中使用了以下针对表观遗传因子的小分子
，并购自Medchemexpress：GSK343（HY-13500），UNC0638（HY-15273） ，EPZ004777（HY-15227）（HY-15227）
，GSK2879552（HY-18632），CPI-100421 ，（HY-100201）
，GSK-J4（HY-15648F）
。在扩展数据中报道了小分子和相对分子靶标的列表。图3b 。 　　对于WA09（H9）HPSC衍生的神经元的形态重建，NPC在第20天通过表达DTOMATO报告的低敏感病毒感染
。诱导神经发生后 ，在第25 、50、75和100天将所得的神经元固定。通过免疫荧光染色扩增DTOMATO报告基因信号，并在Zeiss Axio观察者7 Epi-Fluoresence上成像单个神经元以10倍放大倍数成像 。神经元形态在Imaris v9.9.1中使用自动训练模式下的丝晶函数重建
，并使用核（使用DAPI通道）作为起点
。最终，手动校正迹线 ，以确定细胞过程检测。在Imaris平台中进行了神经突长度和Sholl分析（每10μm半径）测量
，并提取以进行定量和统计 。为了用突触标记染色，将细胞在μ -plate 96井（同上）上培养 ，并对Syn1和PSD95抗体染色
，分别可视化 - 突触前后和MAP2，并可视化神经元树突。使用Leica SP8WLL共聚焦激光扫描显微镜的63倍浸入物镜获得共聚焦图像
。每个样本的三个视野来自两个独立的区别（每个条件总共6个视野）如下。单平面共聚焦图像在斐济v2.9.0中打开 ，并使用Synquant插件（https://github.com/yu-lab-vt/synquant）检测到点 。调整了用于颗粒检测的Z分数
，以确保点的准确性
。其他参数设置为默认值。从参考MAP2通道中提取树突长度 。 　　在PBS中用4％PFA固定培养的细胞在RT中固定20分钟，用PBS洗涤3次 ，在0.5％Triton X-100的PBS中透化30分钟
，然后在含有5％正常山羊血清或正常驴血清的溶液中封闭，在室温下为1 h ，在含有5％的正常山羊血清或正常驴血清，2％BSA和0.25％的Triton x-100中
，供室温1 h
。将一抗在相同的封闭溶液中在4°C下孵育过夜。根据制造商的说明，使用Click-IT EDU成像试剂盒（分子探针）检测到EDU+细胞 。将二抗与Alexa 488 ，Alexa 555或Alexa 647（Thermo）结合的二抗在阻断溶液中以1：400稀释的孵育45分钟
。用PBS中的5μM4'-6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色细胞核。 　　在4°C的4％PFA中将器官固定在4％的PFA中
，用PBS洗涤3次，并在30％的蔗糖/PBS中冷冻保护 。在30μm的低温恒温器（Leica 3050 s）上以30μm的形式切开器官组织 ，安装在显微镜载玻片上
，在室温下干燥，并在-80°C下储存
。在染色的那天 ，我们在室温下放电20分钟。首先将切片在PBS中的0.5％Triton X-100中透化
，在5％的正常山羊血清中阻塞1小时，1％BSA ，PBS中的0.25％Triton
，并在同一溶液中与一抗溶液中孵育过夜 。第二天，将切片用PBS洗涤 ，并在1：400稀释时在室温下二级抗体孵育2.5小时。DAPI5μM染色用于鉴定细胞核
。使用Leica SP8WLL共聚焦激光扫描显微镜捕获图像。 　　使用了以下初级抗体和稀释液：兔抗PAX6 1：300（901301，Biolegend）；兔抗Foxg1 1：500（M227
，clonetech）;小鼠抗NESTIN 1：400（M015012，神经学）；小鼠抗map2 1：200（M1406 ，Sigma）;鸡抗Map2 1：2000（AB5392
，ABCAM）;兔抗阶层IIIβ-微管蛋白（Tuji）1：1,000（MRB-435p，Covance）；小鼠抗KI67 1：200（M7240 ，Dako）;兔子反KI67 1：500（RM-9106
，Thermo Scientific）;兔子抗TBR1 1：300（AB183032，ABCAM）;兔子抗TBR1 1：500（AB31940 ，ABCAM）;大鼠抗CTIP2 1：500（AB18465
，ABCAM）;小鼠抗SATB2 1：1,000（AB51502，ABCAM）;兔子抗伴侣I 1：1,000（S193 ，Sigma）;小鼠抗PSD95 1：500（MA1-046
，Thermo）;小鼠抗神经丝H 1：500（非磷酸化）（SMI32，Enzo Life Science）；小鼠抗C-FOS 1：500（AB208942 ，ABCAM）;小鼠抗HLA I类ABC 1：150（AB70328，ABCAM）;山羊抗RFP 1：1,000（200-101-379
，Rockland）；兔子抗Dsred 1：750（632496，Clontech）;兔抗H3K27me3 1：200（9733 ，细胞信号技术）;兔子反GFAP 1：500（Z033429-2
，Dako）;鸡反GFP 1：1,000（AB13970，ABCAM）;大鼠抗SOX2 1：200（14-9811-82 ，Thermo）;兔抗AQP4 1：500（HPA014784
，Sigma）;绵羊抗欧洲群体1：200（AF6166，研发） 。验证了包括抗GFAP抗体在内的主要抗体 ，以识别人类抗原
，以确认我们同步的皮质培养物中缺乏人类星形胶质细胞
。 　　SMRNA-FISH在WA09（H9）HPSC衍生和MEPISC衍生的神经元上使用ViewRNA细胞加分析试剂盒（Invitrogen）在无RNase的条件下根据制造商的指示，根据制造商的指示 ，通过原位杂交和Neuronal Marker Mager Mag2（Alexa fluorab and alexa fluorab 6）（Alexa fluorab 6）的指示
，通过生产商的指示进行了RNA酶的指示。将神经元铺在μ-plate 24孔黑色（同上）板上，固定并在室温下用固定/透明溶液进行透化15分钟 ，并阻止20分钟，然后在室温下与一级和二抗体孵育1小时 。与小鼠或人类特异性视图细胞和探针组的靶标探针杂交在40°C下进行2小时
。1型（Alexa Fluor 546）和4型（Alexa Fluor 488）探针组分别使用源自MePiscs和HPSC的神经元相同的荧光团方案来检测EZH2和TBP RNA。在温和的搅拌下
，在40°C下携带预扩增，扩增和荧光标记步骤 。如套件的程序中所示进行洗涤
。将样品与5μMDAPI孵育以可视化细胞核 ，并使用延长的玻璃防落式固定体轻轻放置每个孔内部的盖玻片。使用Leica SP8WLL共聚焦激光扫描显微镜以3×数字变焦为63×浸入物镜
，使用Leica SP8WLL共聚焦激光扫描显微镜获取Z-stack图像，并覆盖整个细胞体积 。在每个单个MAP2阳性神经元内 ，加载了Z-stacks并预测在Imaris v9.9.1 v9.9.1 rna Puncta可视化和定量的软件中
。从两个独立的区分（每个条件的16个视野）中
，每种条件（小鼠与人）的八个不同视野（每个场的2-5个神经元）获得了下游分析。使用Imaris软件中的表面函数重建每个神经元的核体积 。 　　对于电生理记录，将神经元放入35毫米菜肴中。如前所述 ，在成熟时间过程中进行的全细胞贴片夹记录是在第25
、50、75和100天进行的
，如前所述22
。简而言之，使用具有4倍物镜和40倍水下目标的Zeiss显微镜（Axioscope）可视化神经元。Recordings were performed at 23–24 °C and neurons were perfused with freshly prepared artificial cerebral-spinal fluid (aCSF) extracellular solution saturated with 95% O2, 5% CO2 that contained (in mM): 126 NaCl, 26 NaHCO3, 3.6 KCl, 1.2 NaH2PO4, 1.5 MgCl2, 2.5 CaCl2, and 10 glucose.用于当前夹具构型记录的移液器解决方案包含（以毫米为单位）：136 kCl ，5 NaCl
，5 hepes，0.5 EGTA ，3 mg-atp，0.2 na-GTP和10 Na2-磷酸蛋白酶
，pH值为7.3，用KOH调整为7.3 ，渗透性为〜290 MOSM 。对于MEPSC
，移液溶液包含（以mm为单位）：140 CSCL，10 NaCl ，10 HEPES
，0.5 EGTA，3 mg-atp ，0.2 Na-GTP和10 Na2-phospocretine
，用CSOH调整为7.3
。20μM（ - ） - 甲基氯化物（Tocris），1μMStrychnineHCl（Sigma）和0.5μMTotototoxin（TTX）（Alomone Labs）（ACSF）被添加到ACSF中 ，以记录MEPSC记录以阻止GabaA受体
，GabaA受体，GabaE受体 ，Glycine受体和Na+ Channels，并分析。通过细胞内注射电流脉冲引起的电压响应（-100 PA
，200 ms）来测量输入电阻 。将膜电压低通滤波在5 kHz下过滤，并使用连接到Digidata 1322 A界面（Axon Instruments）的多灯700B放大器在10 kHz数字化 ，并使用Clampex 10.2软件（Molecular Devices）进行数字化
。计算液体连接电位并离线校正。从0到250 pa的10 pa间隔注入的电流中
，在电流夹具中产生了动作电位 。分析了记录的记录：静止膜电位，输入电阻 ，风湿病
，阈值以及动作电位振幅，过冲 ，持续时间
，半宽， 上升和衰减
。神经元保持在-80 mV ，并使用轴镜软件（分子设备）进行MEPSC的连续记录。使用Minianalysis（SynaptoSoft）版本6和Clampfit 10.2（分子设备）进行数据处理和分析 。通过设置阈值值来检测事件
，然后视觉确认MEPSC检测
。在含有DMSO和EZH2I条件（移液管3-6MΩ）的神经元中的全细胞贴片夹记录（在含有MM）中（以MM）为单位：125 NaCl，2.5 KCl ，1.2 NaH2PO4，1 MGSO4
，1 MGSO4，1 MGSO4 ，2 MGSO4
，2 CACL2，25 CACL2 ，25 NAHCO3和10-葡萄糖。pH和渗透压分别调整为7.4和300-310 MOSM 。为了发射记录
，移液器中充满了含有（以mm）的溶液：130钾，4 kCl ，0.3 EGTA
，10 Na2-磷酸氨基氨酸，10 hepes ，4 mg2-atp
，0.3 na2-atp，0.3 na2-gtp和13 bioocytin。pH和渗透压分别调整为7.3（使用KOH）和285-290 MOSM
。对于MEPSC记录 ，ACSF补充了1 µm TTX和100 µM 4-AP和移液填充的基于CAESIUM的溶液，其中包含（以mm）为单位：120 csmeso4
，8 NaCl，10 Hepes ，10 hepes
，10 hepes，10 egta ，0.3 egta
，10 egta，10 tea-cl ，2 mg2-bi
，2 mg2-atp，0.3 na2 na2 na2 na2 na2-gt ，13.4.44.44.44。QX-314-CL 。PH：7.3（用CSOH调整）和290–295 MOSM
。使用计算机控制的多灯700B放大器和Digidata 1550b（加利福尼亚分子设备）以10 kHz的采样速率获取记录
，并以1 kHz的速度过滤。PCLAMP 10软件套件（分子设备）用于数据采集（夹具10.6）和数据分析（ClampFit 10.6） 。在图4J中所示的MEPSC的振幅和事件间隔的定量进行了将所有事件进行处理
。为了将NMDA成分与记录在+40 mV下的MEPSC分离，我们测量了MEPSC发作后20毫秒的电流振幅 ，其中AMPA受体被脱敏（在扩展数据中被虚线描绘了图5F）66,67，66,67
，，68。对于NMDA/AMPA比的计算 ，然后将NMDA分量的幅度除以记录在 - 70 mV时的AMPA电流峰的振幅 。统计分析和图是在Prism 9（加利福尼亚州GraphPad）中进行的
。在图4G中
，DMSO与EZH2I组中显示的诱发动作电位和痕迹是用20 Pa注射电流引起的。 　　HPSC衍生的皮质神经元被编码GCAMP6M的慢病毒感染并在μ-Plate 96井（Ibidi）上培养 。在大鼠星形胶质细胞共培养实验中，HPSC衍生的神经元在解离前四天 ，然后在大鼠原发性星形胶质细胞上感染了GCAMP6M慢病毒
。对于每批实验
，在同一天并行进行了对控制或遗传/药理扰动的神经元中Ca2+尖峰的感染和测量，以说明由于慢病毒递送而导致的GCAMP6M绝对表达的可变性。如先前所述69进行CA2+成像 。简而言之 ，在成像当天
，将细胞轻轻洗涤两次，用改良的泰罗德溶液（25 mm HEPE（Invitrogen） ，140 mm NaCl
，5 mm KCl，1 mm KCl ，1 mm MgCl2，10 mm葡萄糖
，2 mm Cacl2，2 mm Cacl2 ，2毫米Cacl2
，10μm甘氨酸，0.1％BSA PH 7.4 ，Prefirfors for for pre forsift and pre for 37
，377，377。1-2分钟（25毫米HEPES ，140 mM NaCl
，8 mM KCl，1 mM MGCL2 ，10 mM葡萄糖
，4 mM CaCl2，10μm甘氨酸 ，0.1％BSA pH 7.4，预热至37°C）
。GCAMP6M荧光在环境控制下（37°C； 95％O2； 95％O2； 95％O2； 95％O2； 95％O2； 95％O2）在Rockefeller University的Bir-Imaving Resourcation Center（BIRC）上使用Zen Blue 3.1的软件
，在环境控制下（37°C； 95％O2； 95％O2； 95％O2； 95％O2； 95％O2； 95％O2； 95％O2； 95％O2； 95％O2； 95％O2； 95％O2； 95％O2； 95％O2； 95％O2； 95％O2； 95％O2； 95％O2； 95％O2； 95％O2； 95％O2； 95％O2； 95％O2； 95％O2，5％CO2）记录GCAMP6M荧光。使用10×或20倍物镜以每秒4-6帧的帧速率（每秒600-800帧）以4–6帧的框架速率成像约3分钟 。 　　HPSC衍生的皮质脑器官被慢病毒感染 ，在分化的第45天编码GCAMP6M
，并在脑细胞成像优化培养基（干细胞技术）中培养一周
。在成像当天，用GSK343瞬时处理的DMSO控制和类器官在成像缓冲液中平衡了30分钟 ，并转移到成像比色杯中。通过在环境控制下（37°C； 95％O2 - 5％CO2）
，通过光片显微镜在Trulive3D Imager上（BRUKER）对完整类器官的GCAMP6M荧光记录 。每条条件3-4个器官的多个视野从2个独立批次开始成像约2–4分钟，帧速率为每秒5-10帧 ，在31.3×有效放大倍率下
。 　　如前所述进行了分析。简而言之
，将实用图像堆栈转换为TIFF格式，并加载到MATLAB（MATHWORKS）R2020B和R2021B中的优化脚本中 。将感兴趣的区域（ROI）放置在神经元SOMAS上 ，以计算每个神经元的原始GCAMP6M强度
。将每个原始迹线的信号强度归一化为尖峰检测的基线荧光水平（ΔF/F0）。从归一化的GCAMP6M强度计算出每个迹线中所有检测到的尖峰（每个神经元检测到的尖峰的平均ΔF/F0）的单神经元振幅 。单神经元的频率被计算为每分钟记录的每个痕迹中检测到的尖峰数量
。通过计算同步触发速率来评估网络活性
，该射击速率定义为以每分钟记录的一个FOV中所有ROI的同步Ca2+尖峰的数量。在图2中 。1K和4K的彩色线描绘了成像1分钟内在1视野中单个神经元的归一化（ΔF/f0）gcamp6m信号痕迹；黑线是在1个视野中神经元之间的平均GCAMP6M信号。图片中的图像
。1J图4M在斐济显示为皇家查找表。补充视频1–6每秒显示20帧，补充视频7和8显示每秒100帧 。 　　使用Adobe Photoshop 2022 ，Fiji 2.9.0或Imaris软件版本9.9.1可视化显微镜图像
。使用Imaris软件版本9.9.1进行神经元的形态重建。使用MATLAB软件进行CA2+成像分析 。免疫荧光图像的量化是在Fiji（ImageJ）版本2.9.0中进行的，或使用Operetta高内容成像系统与Harmony Software版本4.1（PerkinElmer）相结合
。 　　将细胞收集并用1：100停止蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒（Thermo Fisher Scientific）在RIPA缓冲液（Sigma）中裂解
，然后在4°C的3×30sec中进行超声处理。将蛋白质裂解物在4°C下在超过15,000 rpm下离心15分钟，并通过精密红色晚期蛋白质测定法（细胞骨架）收集上清液并定量 。将5–10μg的蛋白质在95°C下在Nupage LDS样品缓冲液（Invitrogen）中煮沸5分钟 ，并使用Nupage 4–12％BIS-TRIS蛋白凝胶（Invitrogen）在Nupage MES SDS运行缓冲液（Invitrogen）中分离
。用电泳转移到具有Nupage转移缓冲液（Invitrogen）的硝酸纤维素膜（Thermo Fisher Scientific）中。在室温下以TBS-T+5％非脂肪牛奶（细胞信号）（细胞信号）在室温下阻塞30分钟
，并在相同溶液中与相应的原代抗体在4°C下孵育过夜 。使用了以下主要抗体：小鼠抗神经丝H 1：500（非磷酸化）（SMI32； Enzo Life Science）；小鼠抗同纹替肽1 A 1：500（110 111; sysy）;小鼠抗肌动蛋白1：500（MAB1501; Millipore）;小鼠抗Cas9 1：500（14697;细胞信号技术）;兔子抗CHD3 1：1,000（AB109195，ABCAM）;兔子反KDM5B 1：1,000（AB181089 ，ABCAM）
。在室温下以1：1,000的稀释度在室温下孵育以下二级抗体：抗小鼠IgG HRP连接（7076;细胞信号技术）和抗兔IgG IgG HRP连接（7074; Cell Signal传导技术）。使用Chemidoc XRS+ System（Bio-Rad）上的SuperSignAltm West femto化学发光底物（Thermo Fischer Scientific）揭示了印迹 。使用图像实验室软件6.1.0（Bio-Rad）对化学发光进行成像和分析。对照样品在每个凝胶中运行
，并将感兴趣的蛋白质带的信号强度标准化为肌动蛋白带的强度（加载对照） 对于同一印迹上的每个样本
。补充图1中显示了未编写和未加工的图像。图3D上的一个样本t检验是通过比较每个遗传扰动的logfc的平均值与假设的平均logFC = 0（无变化的假设） 。图4C中的两尾比在图4C中的t检验是在操作与DMSO中的归一化标记/肌动蛋白表达上计算的
。 　　在Trizol中收集样品。使用乙醇沉淀的相位锁定凝胶沉淀的试管通过氯仿相分离分离HPSC衍生的样品的总RNA，并使用带有柱上DNA消化步骤的Rneasy Mini Kit（Qiagen）纯化 。使用Direct-Zol MicroPREP试剂盒（Zymo Research ，R2060）分离出来自小鼠细胞的RNA
。使用iScript逆转录超X（Bio-RAD）用于RT – QPCR
，并根据96或384-Well QPCR在使用CFX966和CFX96和CFX334实时的QPCR模式（使用CFX96和CFX384实时的QPCR）进行（使用SSOFAST EVAGREEN SUPERMIX（BIO-RAD）进行定量PCR（QPCR）反应生成cDNA，并使用ssofast Evagreen Supermix（Bio-Rad）进行定量PCR（QPCR）反应生成cDNA。cDNA /反应 。引物来自定量引物分析（Quiagen） ，除了补充表4中的引物
。结果归一化为管家基因GAPDH或TBP。 　　根据制造商的指示
，由PCR放大片段的Nebuilder HIFI DNA组装克隆套件生成了GPI基因座的Cas9-T2A-Puror盒，该盒侧为5'和GPI基因座的3'同源臂 。EF1Alpha-GCAMP6M慢病毒载体是通过PGP-CMV-GCAMP6M（Addgene 40754）的PCR扩增的PCR扩增 ，使用Q5高富达主混合物（NEB），并使用bamH1和ECORI限制性的方法将Q5高富达主（NEB）和亚克隆到PWPXLD（ADDGENE 12258）中
。对于由EF1Alpha启动子驱动的U6启动子和DTOMATO荧光报告基因在转录控制下的基因特异性GRNA的同时表达
，SGL40.EFSS.DTOMATO载体（Addgene 89398）通过插入P2A-Basticidin Cassetter sequeste sequentem sequtence of P2A-巴斯特蛋白cassetter sequence sequence sequence sequence sequence sequence sequence sequence ofsgl40.efs.dtomato-blast骨干。使用Syntego CRISPR设计工具（https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-design-tool）设计了针对每个基因的GRNA序列，并使用CRIRPOR TOOL70（http://crispor.tefor.net）进行了验证 。通过标准克隆方法将DNA寡聚物（IDT）退火并亚克隆到sgl40.efs.dtomato-blast慢病毒骨链的BSMBI限制位点中。使用Xtreme基因9 DNA转染试剂（Sigma）与相应的慢病毒载体以及包装载体PSPAX2（Addgene ，12260）和PMD2.G（Addgene
，122559），使用Xtreme基因9 DNA转染试剂（Sigma）通过转染HEK293T细胞（ATCC）产生慢病毒
。同时生产了Arryed Crispr grna慢病毒库。转染后48小时收集病毒 ，用0.22-μm过滤器过滤
，并在-80°C下储存在等分试样中 。补充表5中报道了每个使用的GRNA的序列
。 　　如上所述提取总RNA。在HPSC，NPC ，D25
，D50，D75和D100时点时 ，RNA-SEQ的样本用于在Well Cornell Medical College（WCMC）的表观基因组核心（WCMC）上
，提交了Truseq绞合的Ribo Demed-End配对总RNA-SEQ的Truseq绞合的核糖成对 - 末端总RNA-Seq的样本 。在与表观遗传抑制剂扰动后，用于对神经元的RNA-seq研究的样本 ，以对MSKCC综合基因组核心进行了20-300万次读取的配对末端poly-A富集RNA-SEQ
。FASTQC对测序读取的质量控制。使用版本2.5.0或2.7.10b的STAR71，将适配器修剪的读数映射到HG19人基因组 。HTSEQ Python软件包版本0.7.172的HTSEQ计数函数用于对基因的所有外显子进行唯一对齐的读数
。对于时间顺序成熟研究
，将计数值转化为RPKM，以使它们在重复方面可比。使用1 rpkm的阈值来考虑一个基因存在于样品中 ，并且使用了至少一个样品中存在的基因进行后续分析 。分别使用DESEQ2的版本1.16或1.22.2分别计算出跨时间点或用表观遗传抑制剂处理的差异基因表达
。RNA-seq计数的方差稳定转化用于PCA图和基因表达的热图。For downstream analysis of trends of gene expression, transcripts were first grouped into ‘monotonically upregulated’ and ‘monotonically downregulated’ based on the characteristics of their expression from d25 to d100 and further categorized in strict: all the transitions satisfy the statistical significance criteria and relaxed: d25 versus d100 transition satisfy the significance criteria and intermediate transitions may not.对于所有比较
，都使用了错误发现率（FDR）≤5％的显着性阈值 。单调上调（严格）：（ D50对D25：FDR≤5％）和（D100对D25：FDR≤5％）和 （D100对D50：FDR≤5％）和（D50对D25：LogFC> 0）和（D75对D50：LogFC> 0）和（D100对D25 logfc> d50 vs d50对D25 logfc）。单调下调（严格）：（ D50对D25：FDR≤5％）和（D100对D25：FDR≤5％）和（D100对D50：FDR≤5％）和（D50对D25：logFC：logfc：logfc <0) and (d75 versus d50: logFC <0) and (d100 versus d25 logFC 0) and ((d100 versus d25:logFC >= D50对D25：logFC）或（D75对D50：logFC> 0））
。单调下调（放松）：（ D100对D25：FDR≤5％）和（D50对D25：LogFC <0）和（（D100对D25：LogFC <= D50 vers d25：logfc：logfc）或（D75对D75 vers D50：LogFC <0：logfc <0））。GSEA74在D50与D25和D100与D50对D50的比较进行比较，以使用以下参数从MSIGDB中进行测试富集或基因集：FDR≤5％ ，最小基因 - 基因 - 基因尺寸= 15
，最大基因 - 基因 - 基因 - 基因 - 基因 - 基因 - 基因尺寸= 500，使用量表= 1000 。（http://david.abcc.ncifcrf.gov/knowledgebase/）
。使用Biovenn76生成Venn图。 　　在表观遗传抑制和对照条件下 ，神经元成熟的得分（扩展数据图7b
，c） 。根据PCA1 、2和3定义的三维坐标系中样品的几何分布进行计算
。对于每种条件（治疗和分化的日期），定义样品在3D PCA空间中的位置的坐标是根据平均复制平均值确定的。将DMSO D25坐标设置为原点 。然后测量定义每个处理和时间点成熟轨迹的向量作为样品坐标之间的连接段
。将DMSO D25和DMSO D50条件的矢量连接起来定义时间顺序成熟轨迹 ，并将其设置为参考（控制载体）
，以计算在任何给定时间点，每种处理的相似性评分。为了说明矢量的大小和方向性 ，使用点产物度量处理载体·对照载体计算得分 。扩展数据中的基因表达相关热图仅通过计算Pearson相关性，然后使用完整的链接来运行聚集的分层聚类
，从而从所有基因或成熟基因创建了图7D
。扩展数据中的K-均值聚类在图7E中进行了z评分转换的归一化计数，并使用r中的kmeans函数在r中进行kmeans函数 ，nStart = 25
，k = 2:10，当簇变为冗余时停止（k = 4）。 　　ATAC-SEQ库是在MSKCC的表观遗传创新实验室中制备的 ，从约50,000个镀以96孔的活细胞开始 。尺寸选择的库已提交给MSKCC基因组核心
，以进行40-6亿读的配对末端测序。测序读取的质量控制由FASTQC（0.11.3版）进行，并通过Trimmomatic版本0.36执行适配器过滤
。过滤后的读数与HG19参考基因组对齐。Macs2（2.1.0）77用于删除重复读取和调用峰 。ATLA中的差异峰通过DESEQ2版本1.1673调用
。为了确定神经元成熟过程中染色质可及性的动态趋势 ，如图3G所示
，在D25，D50 ，D75和D100样品之间
，使用Ward的链接方法进行了使用Ward的链接方法的聚集层次聚类。Homer FindMotifSgenome.pl（版本4.6）78用于研究成对比较和公正的峰群中的基序富集 。如前所述79，还通过Kolmogorov – Smirnov和高几何测试评估了基序富集
。地图集中的ATAC-SEQ峰与使用Meme Suite版本4.1183的FIMO82更新的CIS-BP数据库80,81中的转录因子图案有关。使用超几何测试比较每个组中包含转录因子基序的峰的比例（前景比）与整个地图集（背景比）中的峰值 。优势比代表了与背景相比（前景/背景比）相比 ，该组中与转录因子基序相关的峰的归一化富集
。在任何时间点（D25，d50
，d75，d100）中 ，来自平行RNA-seq研究（达到≥1rpkm）的比率≥1.2和转录因子表达（达到≥1rpkm）用于过滤富集的转录因子基序。 　　如前所述
，使用以下以下抗体在1：100稀释的情况下从50,000个细胞中进行切割和运行：兔抗H3K4me3（AAB8580，ABCAM）；兔抗H3K9me3（AB8898 ，ABCAM）;兔抗H3K27me3（9733
，细胞信号技术）；兔抗H3K27AC（309034，活动基序） ，正常兔IgG（2729
，细胞信号技术） 。简而言之，收集细胞并绑定到旋转器上8分钟孵育8分钟后 ，在旋转器上孵育8分钟后
。将细胞膜用digitonin透化
，并在旋转器上在4°C的4°C中孵育不同的抗体。洗涤珠并与PA-MN孵育 。Ca2+诱导的消化发生在冰上30分钟，并通过螯合停止。如前所述 ，使用苯酚和氯仿的提取方法最终分离DNA
。在MSKCC集成的基因组核心上进行了库制备和测序。 　　使用Trimgalore的0.4.5版（https://www.bioinformatics.babraham.ac.ac.ac.uk/projects/trim_galore）和运行版本1.15的castadapt和castadapt和0.11.5版本的0.11.5 。将读取与Bowtie2版本2.3.4.1（http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml）和Picard Tools 2.16.0的Markduplicates的读数对齐HG19
。使用Macs2发现了富含的区域，其p值设置为0.001
，匹配的IgG或“无抗体 ”作为控件。床架套件版本2.29.2（http://bedtools.readtools.readthedocs.io）用于创建正常的读取密度读物 。（https://www.encodeproject.org/annotations/encsr636hff）然后在500 bp中合并所有峰值，并与特征的1.6.1读取读数（http://subread.net）（http://subread.net）
。用于计算所有成对对比度的差分富集。所有峰值相关基因的平均表达式在任何阶段都差异表达 。 　　分化的第27天的神经元培养在PBS中洗涤3次 ，并在37°C下1:50在1:50的ACCUTASE中孵育
，并在45-60分钟的1:50孵育pierce（Thermo 88285）溶液，并通过移液器轻轻分离至单电池悬浮液
。在PBS中洗涤后 ，将单细胞悬浮液稀释至1,000个细胞
，在1×PBS中，用0.04％BSA和0.2UμL-1核糖RNase RNase抑制剂（Thermo EO0382）进行测序。根据制造商的协议 ，使用10倍基因组铬单细胞3'试剂盒（根据制造商的协议）3版3版
，在MSKCC集成基因组核心进行SCRNA-SEQ，以每样品的目标回收为10,000个细胞 。图书馆在Illumina Novaseq上进行了测序
。Cellranger管道（6.1.2版）用于删除并对齐读取GRCH38参考基因组 ，以生成单元格计数矩阵。使用Seurat v4.2.085使用R V4.1进行数据分析 。保持线粒体基因中表达200至5,000个基因和少于10％计数的细胞进行分析。通过每个细胞的总数将基因计数标准化
，并使用鳞片中的鳞片来回归细胞周期基因表达方差，如细胞循环函数所确定
。对顶部2,000个高度可变基因的缩放数据进行了PCA ，并使用JackStraw显着性测试，并使用肘部图表来确定用于下游分析的主要成分的数量。前12个主组件上的均匀歧管近似和投影（UMAP）用于尺寸还原和数据可视化 。使用分辨率为0.3的前12个主要组件和Findclusters的Findneighbors用于识别簇
。用于HPSC皮质分化的已发表的SCRNA-SEQ数据集来自Yao等人86（PMID：28094016）和Volpato等人（PMID：30245212）。将我们的数据集与Yao等人生成的数据集进行比较 。86和Volpato等人
，87， 使用具有5,000个功能的FindIntegrationancner ，使用了Seurat的基于锚的集成方法85
。使用Louvain算法使用HGC88进行了扩展数据的单细胞分层聚类和绘制图。对于图3F中的小鼠皮质发育的单细胞RNA-seq分析
，G来自Di Bella等人的已发布数据集 。41使用与原始出版物相同的管道处理的41个数据，并使用V1.1.1.1.1.1.URD algorithm89推断出与原始出版物中的相同的渠道
。 　　根据该领域的先前出版物估算样本量。研究人员没有对实验条件视而不见 。然而 ，对于敲除和小分子治疗研究
，对分子靶标的样品被取消鉴定
。条件和基因组研究在条件之间使用相同的生物信息学管道进行。统计和数据表示在Prism（GraphPad）版本8,9或10，Excel和R软件版本3.5.2或4.1中执行 。该图的传说中指出了用于每个分析的统计测试。数据表示为算术平均值±S.E.M.除非另有说明
。 　　来自代表性显微照片的独立复制如下。图1B ，6个实验；图1J
，3个实验；图1n，2个实验 ，图2D
，2个实验；图3C，每个遗传扰动的2个实验；图4M ，4个实验；补充图2A，4个实验；补充图2F
，3个实验；补充图6E，1个实验；扩展数据图 。6a ，2个实验；扩展数据图
。6C
，2个实验；补充图8E，D12和D16的2个实验。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。