A，在热压力的枯草芽孢杆菌野生型细胞中表达的野生型和陷阱突变体CLPP（6HIS）的co-NTA纯化。SDS-PAGE（左）揭示了两种CLPP蛋白质的共纯化 。MALDI – MS分析（底部）估计 ，野生型和陷阱CLPP的两个CLPP物种之间的质量差异分别为1,036和1,042 DA 。这些值适合6HIS标签（1,065 DA）的预期质量 ，表明纯化的蛋白质对应于重组（标记）和内源性CLPP。天然页面（右）表明，这两种蛋白质主要作为复合材料 ，七聚体复合物 。因此 ，在热压力条件下，枯草芽孢杆菌中的CLPP（6HIS）陷阱表达通过与内源性（活跃）CLPP（卡通）形成混合复合物的复杂性 。由于在与CLPP（6HIS）的水平相似的水平上观察到了未标记的内源性CLPP ，因此在体内形成的有效的底物捕获复合物（仅由非活动的clpptrap）形成。B ，CLPP交叉突变体的工程 。CLPP七聚体的晶体结构（PDB代码3KTI;参考58）在顶部（左）和侧面（右）视图中显示 。放大图显示了两个相邻亚基的Arg142和Glu119之间的相互作用。为了避免重组CLPP（6his）与内源性CLPP的捕获突变体的相互作用，这两个残基是交换的（GLU119ARG/ARG142GLU） ，从而导致交叉突变剂CLPP（6his）X-Trap和Wild-Type clpp的静电排斥 ，同时允许进行辅助的指标 。C，在热压力的枯草芽孢杆菌野生型细胞中表达的CLPP（6HIS）X和CLPP（6HIS）X-TRAP的Co-NTA纯化 。SDS – PAGE（左）表明X变体不会与内源性CLPP共纯化，这表明GLU119ARG/ARG142GLU突变阻止了异质 - 弱体的形成（请参阅卡通）。天然页面分析（中间）表明 ，CLPP（6HIS）X蛋白的征质倾向降低。然而 ， clpp（6his）x突变体的无活性版本（Ser98ala，“陷阱 ”）主要是作为七聚体配合物 ，可能是由于被困的底物的稳定化 。因此 ，clpp（6his）X陷阱代表了枯草芽孢杆菌野生型背景中捕获底物的工具 。我们的实验方法的优点是避免使用ΔCLPP枯草菌菌株，后者具有极高的多效性表型（包括MCSB和MCSA14的水平增加） ，这在很大程度上会偏向CLPP底物的表征。CLPPX蛋白代表理想的阴性对照：它具有降低七聚体并因此降解蛋白质的能力 ，其过表达预计对蛋白质降解的总体水平几乎没有影响，因此对底物蛋白的丰度 。
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希望本篇文章《精氨酸磷酸化标志着CLP蛋白酶降解的蛋白质》能对你有所帮助！
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