Nipponbare（指定为N14）是型号O. sativa Japonica大米，其中包含BPH14的N14敏感等位基因 。N14用于早期实验中 ，以建立BISP – BPH14相互作用的原理
。RI35线（指定为BPH14）是一种重组近交系
，其中包含BPH抗性基因BPH14（参考文献8）。Minghui 63（MH63）是RI35的BPH敏感父母（参考文献44），是O. sativa Indica水稻育种和基因组学的模型品种 。MH63和BPH14用于大多数研究 ，以阐明由于MH63的农艺重要性
，BISP – BPH14 -NBR1相互作用
。The following transgenic lines were developed in this study: N14–Bisp (pUBI::Bisp-Myc, N14 recipient), Bph14–Bisp (pUBI::Bisp–Myc, Bph14 recipient), Osrlck185 (OsRLCK185–Cas9, ZH11 recipient), Bph14–Osnbr1 (OsNBR1–Cas9, Bph14接受者）。OSRLCK185突变体是在ZH11背景中产生的 。ZH11是一种易于转化的O. sativa japonica大米，可抗BPH敏感的基因型
。 　　将BPH昆虫保持在易感品种Taichung天然1处的28±2°C ，相对湿度为60–80％
，光周期为16小时的光– 8小时。通过DSRNA注射的BPH RNAi是本研究的一部分：GFP-RNAi（用DSGFP微型注射）和BISP-RNAI（用DSBISP进行了微注射） 。 　　为了评估转基因和WT水稻植物的BPH耐药性，在塑料杯中播种（直径10厘米 ，高20厘米）播种，从同一植物中播种约15或20种种子。在三叶阶段
，将所有植物都放在大纱布盖下，每个幼苗都被十秒或第三星BPH若虫感染
。当所有易感植物都死亡（评分为9）时 ，根据损害的程度
，其他品种或线条的每个幼苗的得分为0 、1
、3、5 、7或9分，如前所述8,46,47 ，并计算了BPH抗性评分。每个品种或系列使用至少三个重复 。 　　为了测量BPH的体重增加和蜜糖排泄
，使用1/100,000 Shimadzu Auw120d Electronic Balance11,12称重了新出现的短翅女性成年和parafilm囊
。将昆虫放在预先兑换的小袋中，然后将其连接到稻植物下部附近的叶鞘上。48小时后 ，再次称重昆虫和parafilm囊 。记录了昆虫重量重量的第一和第二测量之间的差异
。记录了糖的重量的第一个和第二个测量值之间的差异
，记录为蜜糖的量。每个品种或系列使用至少十个重复 。 　　对于两个主机选择测试，如其他地方所述 ，在塑料杯中生长了一个转基因植物和WT植物
。11,11,12。在四叶阶段
，杯子被纱布覆盖，并将20或30秒或第三秒若虫释放到杯中（确切的数字取决于WT植物的BPH耐药性） 。释放后的6
、12、24 、48
、72、96和120小时记录了定居在每个植物上的若虫数量（认为释放的力矩被认为是时间0）
。分析了每种品种或研究品种的十杯。 　　为了研究BPH若虫在大米上的存活 ，释放了第二或第三阶段的BPH若虫（每植物十种昆虫），并用光线传输的网格覆盖杯子 。释放后8或9天计数每种植物上的若虫。将存活率计算为在实验开始时释放的若虫总数除以生存的若虫数量
。分析了每个品种或系列的十杯。 　　常规分子克隆技术用于制备构建体 。补充表3列出了这项工作中使用的质粒和引物
。对所有结果的重组矢量进行了测序。 　　为了构造Y2H筛选的质粒
，将全长BPH14序列从BPH14叶鞘粘cDNA放大，并将其克隆到PGBKT7载体的XMA I位点 ，该载体产生了BPH14-BD载体 。 　　为了构建Y2H分析的质粒
，BISP（没有其1-25氨基酸残基信号肽的ORF序列的编码序列；氨基酸26–241），BISP26–124（氨基酸26-124）和BISP125-241（氨基酸及氨基酸及氨基酸and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and）PGADT7载体分别生产BISP – AD ，BISP（26–124）–AD和BISP（125-241）–AD
。The coding sequences of the CC, NB and LRR domains and full-length Bph14 were amplified from the BPH14-BD vector and cloned into the Xma I sites of the pGADT7 and pGBKT7 vector to produce CC–AD, NB–AD, LRR–AD, BPH14–AD, CC–BD, NB–BD, and LRR–BD, respectively.N14的编码序列（大米品种Nipponbare中的BPH14等位基因）从N14叶鞘cDNA放大
，并将其克隆到PGBKT7载体的XMA I位点中，以产生N14 -BD。 　　在本研究中选择了八个在BPH侵袭和未侵入的植物中差异磷酸化的激酶 。OSRLCK185 ，OSRLCK1851–85（氨基酸1-85）
，OSRLCK185KD（激酶结构域，氨基酸86–353） ，OSRLCK185354-491（氨基酸354-491）
，OSMAMPK KK 6OSMPK16，OSCDPK14 ，OSCDPK20和OSRLCK259片段从N14叶鞘壳中放大，并将其克隆到PGBKT7载体中
，以生产OSRLCK185 – BD，OSRLCK185（1-85）–BD ，OSRLCK1855K185K185KD- BD- BD-OSRLCK185（354–491）–BD
，OSMAPKKKKIM – BD，OSMKK6 – BD ，OSMPK20 – BD
，OSMPK16 – BD，OSCDPK14 -BD ，OSCDPK14 – BD
，OSCDPK20 – BD和OSRLCK259 – BD，以及OSRLCK259 – BD
。OSNBR1 ，OSATG8A
，OSATG8B，OSATG8C和OSATG8E的编码序列从BPH14叶鞘层放大 ，并将其克隆到PGBKKT7和PGADT7中，以产生OSNBR1 – BD
，OSATG8A – BD，OSATG8A – BD ，OSATG8B – BBD
，OSATG8E，以及OSATG8E ，OSATG8C -8C -BD
，以及 　　PCXUNS-4×HA LRR域（N14 – LR）。 ，osatg8b 。BISP ，BISP（125–241） - Myc
，OSRLCK259 – MYC，OSRLCK2 OSNBR1 – MYC ，MYC - MYC - OSATG8B
，MYC - MYC - OSATG8C，尊重
。LRR Domas ，N14 LRR。 14 – Na，26 – Ha
，N14–14），BISP（125–241）OSNB1-尊重 。（Amin 756–832）Mustan N5（K13A）和N7（K13A） ，并粘在一起。分别
。 　　为了分析BISP的亚细胞定位
，将BISP的编码序列（无其信号肽的ORF序列）的编码序列在玉米（Zea Mays）泛素1启动子的下游克隆，并在二元矢量PCAMBIA1300中与GFP在FFP中固定 ，从而产生了BISP – GFP构建。 　　为了进行BIFC分析
，将BPH14，N14 ，BISP（无信号肽的ORF序列）和BISP125–241的编码序列在pusyne和Pusyce vectors19的XMA I位点中加以克隆
，从而产生了构造的构造，从N14 – YC 。 　　用于在磷酸化活性测定中表达和纯化的大肠杆菌重组蛋白载体（指定的PET-MBP-HIS和PET-GST-HIS）是通过向PET-28A表达载体（EMD Biosciences）添加C端MBP或GST TAG来创建的
。The coding sequences of Bisp (ORF sequence without its signal peptide), Bisp26–124 and OsRLCK185 were amplified and cloned into the pET-MBP-His and pET-GST-His vector, which produced OsRLCK185–MBP–His, BISP(26–124)–GST–His and BISP–GST–His constructs, respectively. 　　对于N. Benthamiana叶片膨胀实验 ，将BPH14
，N14，OSNBR1和N1（OSNBR1突变体）的编码序列克隆到Pearleygate 203 Vector48中 ，以产生BPH14-203，N14-203
，N14-203，N14-203 ，OSNBR1-203
，和N13，和N1-203 ，以及N1-203
，和N1-203。将BISP的编码序列（无其信号肽的ORF序列）克隆到Pearleygate 201和Pearleygate 101 Vector48中，分别产生BISP-2010和BISP-101和BISP-101（BISP – YFP） 。 　　为了生成CRISPR – CAS9构建体 ，使用基于Web的工具CRISPR-P（V.2.0; http://crispr.hzau.edu.edu.cn/crispr2/）设计了CRISPR – CAS9的目标站点
。如前所述49制备了CRISPR – CAS9二进制构建体
，该构建体生产了OSNBR1 – CAS9。 　　媒人金酵母双杂交系统（Clontech，630489）用于筛选BPH14相互作用蛋白 。将带有BPH14-BD的Y2H金细胞与1 ml的BPH唾液腺cDNA库混合 ，并在TDO（SD/-Leu-Leu-trp-His）选择性培养基上孵育过夜
。根据制造商的协议
，确认了在TDO培养基上生长的候选克隆（Clontech，630489）。使用Make您自己的“ Mate＆Plate ”库系统（Clontech ，630490）构建BPH cDNA库，并具有简单且高效的协议 。使用Trizol试剂（Takara
，9109）从BPH唾液腺中分离总RNA，并使用智能cDNA合成技术从分离的mRNA合成cDNA（Clontech ，634926）
。 　　对于蛋白质相互作用的Y2H分析
，根据制造商的说明，用指示的诱饵和猎物质粒转化了酵母菌菌株AH109。同时将共转化剂同时铺装在含有DDO（SD/-LEU-TRP） ，TDO（SD/-LEU-TRP-HIS）的选择培养基上
，其适当浓度为3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）或QDO（3-AT）或QDO（SD/-LEU-LEU-LEU-LEU-TRP-HIS-DADE）和30°C. 　　BISP的cDNA序列是从BPH唾液腺转录组获得的 。为了获得转录组中截断序列的全长对应物，使用制造商的说明 ，使用更智能的种族cDNA扩增试剂盒（Clontech
，634923）进行了5'-和3'-RACE扩增。基于测序数据获得BISP特异性引物
。将种族产物放大，并将纯化的产物连接到PMD18-T载体（Takara ，6011）中并进行了测序。 　　在四叶阶段从稻幼苗的叶鞘中提取蛋白质 。将叶鞘用浸泡在酒精中的棉球擦去
，以除去蜜糖并在液氮中磨碎
。从水稻蛋白提取缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5 、150 mM NaCl，10％甘油 ，0.1％NP-40，植物蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche））中提取总蛋白。通过SDS-PAGE分析了相等量的总蛋白质
，并通过使用抗肌动蛋白（Abbkine，ABL1050; 1：3,000） ，抗BISP（1：500）
，抗OSWRKY72，抗oSWRKY72（北京蛋白Innovation（ABP80456-A-SE; 1：1：500）和Anti-i-ASRIS ，AS1942（AS194）（ASRIJING蛋白Innovation）
，通过免疫印迹检测并通过免疫印迹检测 。1：1,000）抗体
。对于OSATG8分析，将等量的蛋白质与6 M尿素50进行SDS-PAGE进行 ，并使用抗ATATG8A抗体（ABCAM
，AB77003; 1：1,000）通过免疫印迹检测。通过分别表达BISP和NISP1（克隆到PET28A）中，抗BISP和抗NISP1抗体在大肠杆菌菌株BL21（DE3）中制备 。收集表达的重组蛋白并注入两只兔子（DIA·AA生物技术）
。Ponceau S溶液（Sigma-Aldrich ，P7170）用于染色PVDF膜
，并用作负载对照。使用ImageJ定量蛋白质信号的强度 。 　　在水稻蛋白萃取缓冲液中制备来自水稻原生质体的蛋白质样品（100 mM Tris-HCl pH 7.5，1 mm EDTA ，5 mm MGCL2，5.5％（w/v）Triton X-100
，带有植物蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche））
。从水稻原生质体样品中提取总可溶性蛋白质，每个样品中的100 µL稻米原生质体蛋白萃取缓冲液。接下来 ，通过抗HA（MBL
，M180-3; 1：1,000），抗MYC（MBL ，M192-3; 1：1,000）或抗肌动蛋白（Abbkine
，ABL1050; ABL1050; 1：3,000; 1：3,000）抗体，将10 µL提取物分离为SDS-PAGE ，并进行免疫印迹 。 　　对于Co-IP分析
，转染后，将水稻原生质体在28°C下孵育14–20小时。如上所述 ，从水稻蛋白提取缓冲液中的原生质体中收集了总蛋白提取物
。将上清液与10μL蛋白G琼脂糖珠（Millipore
，16-266）和1μl抗HA（MBL，M180-3）或1μL抗Myc（MBL ，M192-3）抗体在4°C中使用5 h，并检测到5 h
，并检测M180-7，克隆：TANA2; 1：1,000） ，抗肌动蛋白和抗Myc或抗MYC MAB-HRP-Direct（MBL
，M192-7，克隆：My3 ，1：1,000）抗体。使用ImageJ定量蛋白质信号的强度 。 　　对于酵母蛋白免疫印迹
，如前所述提取总酵母蛋白
。51。简而言之，将单个酵母菌菌落重悬于4 mL YPDA液体培养基中 ，并在30°C下生长至OD600 = 0.6 。将沉淀的酵母细胞重悬于1 ml蒸馏水中
，与100μl0.2 m NaOH结合，在室温下孵育5分钟 ，并沉淀并重悬于50μl的加载缓冲液中
。将蛋白质在95°C下煮沸10分钟
，并通过抗HA或抗MYC抗体进行免疫印迹检测。Ponceau S溶液用于染色PVDF膜进行加载 。 　　水稻原生质体是从拟层幼苗中制备的，并如前所述11,19
。使用PEG介导的方法 ，使用约3–10μg的质粒DNA转染2×105原生质体。转染后14-20小时检测到荧光或表位标记的蛋白质 。 　　对于亚细胞定位，将BISP – GFP质粒和核标志物BZIP63 – RFP11,19转化为水稻原生质体
。在28°C孵育14–20小时后
，使用共聚焦显微镜（Leica，DMI8）对原生质体进行成像。 　　为了进行BIFC分析 ，用指定的表达载体转染原生质体 。在28°C孵育14–20小时后
，通过共聚焦显微镜对原生质体进行成像。使用先前描述的方法52对BIFC荧光信号进行定量
。使用ImageJ软件确定单个原生质体中YFP和CFP信号的强度。测量了整个细胞的平均YFP/CFP强度比（百分比），并计算出五到十个独立细胞的平均值 。用抗GFP（Roche ，11814460001; 1：1,000）
，抗HA或抗MYC抗体检测到荧光或表位标记的蛋白
。 　　使用Trizol试剂（Takara，9109）从稻片 ，BPH或Benthamiana叶片中分离总RNA。根据制造商的说明
，使用带有GDNA Eraser（Takara，RR047A）的PrimeScript RT试剂套件合成第一链cDNA 。 　　根据制造商的说明 ，使用使用SYBR Green Supermix（Bio-Rad
，172-5274）的CFX96实时系统（Bio-Rad）进行实时RT-QPCR
。对于水稻中的RT – QPCR，将三个管家基因 ，阿拜素，OSTBP和OSHSP53用作校准实时RT – PCR数据的参考基因。对于BPH中的RT – QPCR
，使用NLRPS18，Nlubipirin和Nlactb（编码β-肌动蛋白）作为参考基因 。补充表3列出了所使用的引物的序列
。 　　对于半定量RT-PCR分析 ，将第一链cDNA（5μL）用TE缓冲液稀释至50μl的最终体积
，使用基因特异性引物作为PCR扩增的模板。使用了内标NBACTB 。调整用于扩增的周期数量，以确保放大在线性范围内
。对PCR产物进行测序 ，以确保它们源自靶基因。补充表3列出了所使用的引物的序列 。 　　为了使BISP在米叶鞘片中进行免疫定位
，在两叶阶段的N14植物被10天注入了十天或第五次 - 五个星际若虫，或用作非侵入的对照。如前所述11,17 ，收集
，固定，脱水并嵌入石蜡（Paraplast Plus ，Sigma-Aldrich
，P3683）中的外叶鞘
。将切片在二甲苯和酒精梯度中孵育，以去除石蜡并逐渐补充水分。将切片与抗BISP抗体或免疫前兔血清（如上所述制备 ，1：100）在黑暗过夜中在4°C下孵育 。The next day, the sections were washed 3 times (15 min each time) with PBST (PBS with 0.1% (v/v) Triton X-100), blocked with 5% bovine serum albumin in PBST at room temperature for 1 h, washed 3 times at 15-min intervals with PBST, and incubated with the secondary Cy3-conjugated goat anti-rabbit antibodies (Jackson ImmunoResearch,111-165-003，1：500）在4°C过夜
。以15分钟的间隔将切片用PBST广泛洗涤
，并在共聚焦显微镜下成像（Leica，DMI8）。 　　为了在BPH唾液腺和胆量中进行免疫定位 ，用二氧化碳（CO2）麻醉了雌性或雄性昆虫 。在0.65％的NaCl中剖析唾液腺和肠道
，在PBST中洗涤3次，并在4°C的PBST中固定在4％（v/v）甲醛中过夜
。第二天 ，用抗Bisp抗体
，免疫前血清或抗NLSP1抗体54（1：100）在4°C的黑暗过夜中将器官广泛洗涤，并用抗BISP抗体 ，免疫血清或抗NLSP1抗体54（1：100）孵育
，并如上所述进行处理。用100 nm 4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）在室温下在黑暗中染色5分钟 。唾液腺和肠道用PBST广泛洗涤，并放在载玻片上
。照片是在共聚焦显微镜下拍摄的（Leica ，DMI8）。为了定量CY3
，使用ImageJ对单个细胞中的CY3和DAPI荧光信号进行了定量 。测量每个细胞的平均CY3/DAPI强度比，平均比率从五到十个独立细胞计算
。 　　用补充表3中列出的引物（包括正向底漆中的T7启动子序列）放大了BISP的506 bp片段。将BISP片段克隆到PMD18-T载体（Takara ，6011）之后，使用Megascript T7转录试剂盒（Ambion
，AM1354）从PCR生成的DNA模板中合成DSRNA 。如前所述5，使用Nanoliter 2010注射器（World Precision Instruments）向其第三 ，第四或第五阶段的BPH若虫注入BISP-RNAI或GFP-RNAI。基因沉默的效率是在DSRNA处理后1-10天通过RT -QPCR确定的
。 　　将注射的BPH放置并在水稻植物上饲养12小时后
，GFP-RNAI BPH的存活率，体重增加和蜜糖排泄 ，BISP-RNAI BPH和未注射的对照昆虫如上所述测量。为每种处理设置了五个重复
，以测量BPH的存活率，并为每个治疗组进行了20次重复 ，以测量体重增加和蜜糖排泄 。 　　为了在水稻植物中构成表达BISP
，BISP-MYC质粒通过农杆菌介导的转化转化为N14或BPH14植物8
。为了通过基因组编辑敲除OSNBR1，将CRISPR – CAS9质粒OSNBR1 -CAS9引入了tumefaciens菌株EHA105中 ，并如其他地方所述转化为BPH14。从这些转化体中提取基因组DNA
，并使用设计目标位点的底漆对进行PCR扩增 。对PCR产物进行测序以确定基因编辑是否成功
。 　　内源性SA水平是在稻片中确定的。从每种植物或生产线上的15个叶鞘被磨成液氮中的细粉 。准备每个冷冻样品的三个生物学重复
。将每个样品（100 mg）添加到750μl预萃取缓冲液（甲醇：水：乙酸，80：19：1 ，v/v/v）中，并补充了3 µg脑苯甲甲酸（Sigma-Aldrich
，35745）作为内标，并在4°C时在4°C时摇动。离心后 ，将上清液通过0.22-μm尼龙膜过滤
，并在室温下在氮流下干燥至少4小时 。最后，加入200μl甲醇以溶解提取物
。如其他地方所述进行内源性SA测量值55。 　　OSRLCK185 – MBP -HIS ，BISP – GST – HIS和BISP（26–124） - GST – GST -HIS构建体在大肠杆菌BL21（DE3）细胞中表达 。根据制造商的指示
，使用谷胱甘肽丝糖珠（GE Healthcare，17075601）和链淀粉树脂（新英格兰Biolabs ，E8022S）纯化了GST标记或MBP标记的重组蛋白。通过BCA蛋白质测定法（Beyotime
，P0010S）确定蛋白质浓度
。 　　对于BISP抗体特异性分析，在SDS -PAGE凝胶上分离了纯化的BISP -GST -GST蛋白和全昆虫的总蛋白质和双重稀释系列。使用抗BISP和抗HIS（Genscript ，A00186; 1：2,000）抗体在免疫印迹中检测到BISP – GST – HIS 。Ponceau S溶液用于染色PVDF膜
，并用作总BPH蛋白载荷对照
。 　　测试OSRLCK185的自磷酸化，1 µg纯化的重组OSRLCK185 – MBP – HIS ，BISP（26–124） - GST – GGST – HIS或BISP -GSP -GST – HIS，在含有25 µl激酶反动的25 µMMMMMMMMMMM（pH 7.5）中
，将25 µl酶的25 µMMM摄入1MMG），1MMG）ATP和2.5 µCI [γ-32p] ATP在30°C下10–30分钟。随后使用10％SDS -PAGE凝胶进行放射自显影对激酶反应进行分析 。类似的凝胶受到Coomassie亮蓝色染色作为对照
。 　　为了测试OSRLCK185在丝氨酸和苏氨酸残基上的磷酸化 ，通过用抗磷酸ser磷ser/磷雷蛋白抗体（Millipore
，Millipore，05-368 ，1：1000）和抗抗病抗体（gensibs）（genscrips）（genscript）（genscript）（genscript）（genscript）（genscript）（genscript）（genscript）（genscript）
，检测到磷酸化的OSRLCK185。 　　LRR，N14 – LRR ，BISP
，BISP（26-124）和BISP（125-241）用N端6×His-SUMO标签克隆到PfastBac 1中，并在27°C的SF9昆虫细胞（Thermo Fisher Scientific ，11496015）中表达 。在SF-900 II SFM培养基（Invitrogen
，10902088）中培养的SF9细胞（500 mL）被25 mL重组杆菌病毒感染，并在27°C下培养4天
。收集细胞并在PBS溶液中重新悬浮（2 mM KH2PO4、8 mM Na2HPO4
、136 mM NaCl和2.6 mM KCl ，pH 7.4）。超声处理和离心后，重组LRR
，N14 – LRR，BISP ，BISP（26-124）和上网中BISP（125-241）蛋白在ni-nta珠中纯化（Novagen
，70666-4），然后用Ni-NTA珠纯化 。 　　如前所述56,57 ，使用八位钟Red96系统（Fortébio）确定了LRR和N14 -LRR与BISP
，BISP（26-124）或BISP（125-241）的结合动力学和亲和力
。根据制造商的说明，纯化的LRR和N14-LRR用NHS-Biotin（Sangon Biotech ，C100212）生物素化。在PBS缓冲液（2 mM KH2PO4
，8 mm Na2HPO4，136 mm NaCl ，2.6 mm KCl
，0.05％Tween 20，和0.5％牛血清白蛋白 ，pH 7.4）中，将所有链霉亲和素涂层的生物传感器（Fortébio）水合在PBS缓冲液中（2 mM Kh2po4
，8 mm Na2hpo4，136 mm NaCl ，2.6 mm KCl
，0.05％） 。将生物素化的LRR和N14-LRR稀释在PBS缓冲液中，终浓度为20μgml-1 ，并固定在链霉亲和素涂层的生物传感器上。将具有不同浓度的BISP
，BISP（26-124）或BISP（125-241）的结合缓冲液中稀释为具有固定LRR和N14 -LRR的生物传感器，以进行结合动力学分析（关联步骤）
。随后 ，将链霉亲和蛋白涂层的生物传感器返回到PBS缓冲液180 s（离解步骤）。在所有BLI实验中
，使用PBS缓冲液来减少非特异性与生物传感器的结合，除非在BISP ，BISP（26-124）或BISP（125-241）的情况下实验 。实验包括在25°C下的以下步骤：（1）加载（60 s）；（2）基线（120 s）;（3）将蛋白质固定在传感器上（60 s）；（4）协会（180 s）;（5）分离（180 s）
。分析了数据
，并进行了逐步校正和参考校正。进行了动力学速率的全球拟合，然后使用Fortébio数据分析软件（V.1.1.0.16 ，Fortébio）分析了平衡分离常数（KD），关联（KON）和离心率（KOFF）速率常数及其标准误差 。对于每个亲和力测量
，对测定重复两次
。 　　对于竞争测定，如前所述58 ，使用了八位八核Red96系统（fortébio）。将生物素化的LRR在PBS缓冲液中稀释至20μgml-1的最终浓度
，并固定在链霉亲和素涂层的生物传感器上 。在25°C下测量了BISP（26-124）或PBS的关联
。接下来，将竞争对手（BISP ，PBS或BISP（26-124））添加到BISP（26-124）相关或与PBS相关的样品中。实验包括在25°C下的以下步骤：（1）加载（60 s）；（2）基线（120 s）;（3）将蛋白质固定在传感器上（60 s）；（4）基线（240 s）;（5）与BISP（26-124）或PBS（360 s）的关联；（6）分离（240 s）;（7）与竞争对手BISP
，PBS或BISP的关联（26-124）（120 s）；（8）解离（180 s） 。使用Fortébio数据分析软件（V.1.1.0.16，Fortébio）分析数据
。每次测量重复两次测定。 　　如先前所述59,60进行了MST测定 。使用Monolith NT.115（Nanotemper Technologies）测量了纯化的LRR或N14 -LRR与BISP ，BISP（26-124）或BISP（125-241）的亲和力。根据制造商的方案
，使用整体蛋白标记试剂盒（红色NHS第二代；纳米emper Technologies，MO-L011）对蛋白质进行荧光标记 ，并且每种测定的标记蛋白质约为20 nm
。将未标记的BISP
，BISP（26-124）或BISP（125-241）蛋白的溶液稀释，以适当的串行浓度梯度。在室温下孵育5分钟后 ，将样品加载到毛细血管中（纳米机技术，MO-K022） 。在含有0.05％Tween 20的20μlPBS缓冲液中进行测量
。对于每个亲和力测量
，重复三次测定。使用制造商提供的NanoteMper分析软件进行数据分析 。 　　对于LRR与BISP和BISP（26-124）之间的竞争测定法，在PBS缓冲液中合并了50 nm LRR蛋白和200 nm BISP（26-124）（26-124） ，并与0.05％Tween 20 20
，并孵育10分钟以启用蛋白质相互作用
。然后，在测量之前 ，将一系列不同浓度的BISP添加到LRR – BISP（26-124）混合物中。每次测量重复三次测定 。使用Nanotemper网站（https://nanotemper.my.site.com/explore/s/article/can-competition-competition-competition-bebe-be-be-be-perform--------------------------- mst）
，使用KI Finder软件（https://nanotemper.my.site.com/site-mst）中计算了来自MST测定的分离常数（KI）
。 　　PEG介导的转化后，将水稻原生质体放入含有10μM3-MA（3-甲基趋化 ，塞勒克
，S2767），100μM氯喹（MCE ，HY-17589A）的1 mL W5缓冲液中Sigma-Aldrich
，E8640）以抑制自噬或50μmMg132（Selleck，S2619）以抑制26S蛋白酶体。在蛋白质提取前 ，将处理的原生质体在28°C下孵育14-20小时 。抗肌动蛋白（Abbkine，ABL1050）用作量化总蛋白水平的参考
。米WRKY72被26S蛋白酶体途径降解19
，并用作阳性对照，以确保蛋白酶体抑制剂MG132具有活性。自噬途径61将水稻HD1蛋白在黑暗中降解 ，并且将OSNBR1用作阳性对照
，以确保自噬抑制剂活跃 。通过ImageJ量化了免疫印迹中蛋白质信号的强度。 　　To observe autophagic structures in N. benthamiana leaves by confocal microscopy, A. tumefaciens strain GV3101 cells harbouring CFP–NbATG8F (designed as CFP–ATG8F)27 and the constructed expression vectors, BISP-201, BPH14-203, N14-203, OsNBR1-203, and N1-203 were infiltrated intoN. Benthamiana离开60小时
。然后将样品浸入或没有自噬抑制剂CONA（首先在DMSO时在0.5 m，然后添加1：1,000）10小时 ，然后在共聚焦显微镜下检查（Leica
，DMI8）。 　　对于病毒诱导的基因沉默（VIGS）测定，PTRV1和PTRV2或其衍生物被引入农业杆菌菌株GV3101中 。如前所述进行了VIGS分析
。62。简而言之 ，将具有PTRV1和PTRV2或其衍生物的农业培养物以1：1的比例混合
，并浸入六叶阶段N. Benthamiana植物的叶片中 。浸润后约10天，上叶出现了沉默的表型
。A. tumefaciens菌株GV3101含有CFP – NBATG8F的细胞和构造的表达载体BISP-101（BISP – YFP）和BPH14-203被渗入Benthamiana上叶N. Benthamiana上叶。 　　对于免疫元电子显微镜 ，将用BPH侵染的N14叶鞘切成0.1毫米块
，固定在预先冷的3％多聚甲醛中，用0.1％的戊二醛（在100 mm PBS中（100 mm PBS ，pH 7.4）固定，并立即将其放置在a vacuum中
，直到样品完全倒入液体中 。将样品转移到新鲜的0.1％戊二醛中，并在4°C孵育过夜
。第二天 ，将样品用PBS（pH 7.4）洗涤30分钟。通过连续洗涤在4°C下以30％和50％乙醇的连续洗涤来清除样品
，然后在-20°C下每个乙醇在70％，80％ ，85％
，90％和95％乙醇中，分别为30分钟 ，最后100％乙醇在-20°C下为60分钟 。根据制造商的说明
，将乙醇洗涤后后，将样品逐步嵌入Lowicry K4M树脂中
。用超大型E超小观机（Reichart-Jung）用钻石刀切割超薄切片（70 nm） ，并在3毫米铜（网格）网格上收集。如前所述
，使用标准程序进行叶片切片的免疫标记，如先前所述的59抗BISP抗体或以100 µg ml – 1的抗体和免疫血清和抗兔IgG IgG Gold偶联的二级抗体（Sigma-Aldrich ，g7277-4ml）在1:50延伸下进行 。然后将切片用2％乙酸铀酰（在70％乙醇中）染色15分钟，在蒸馏水中洗涤3次
，用柠檬酸铅染色12分钟，在NaOH缓冲液中洗涤 ，在蒸馏水中洗涤3次
，并在JEM-1230电子显微镜下进行检查。 　　For transmission electron microscopy observations, 2-week-old Bph14–Bisp transgenic lines, Bph14 and MH63 leaf sheaths were cut into 0.1-mm pieces, fixed in precooled 4% paraformaldehyde with 2% glutaraldehyde (in 100 mM PBS, pH 7.4) and immediately placed under a vacuum until the samples were completely submerged in the liquid.将样品转移到新鲜的2％戊二醛中，并在4°C孵育过夜
。第二天 ，将样品用PBS（pH 7.4）洗涤5次
，持续20分钟，并在室温下浸入1％的四氧化盐溶液中1-2小时 ，直到由于氧化而完全变成黑色。将样品用20分钟的间隔用PBS洗涤5次 。通过连续的洗涤清除样品
，每30分钟，乙醇 ，然后是80％
，85％，90％和95％的乙醇 ，每个乙醇20分钟，每个乙醇20分钟
，每个乙醇两次，每个乙醇两次
。洗涤乙醇后 ，按照制造商的指示将样品逐步嵌入垃圾树脂中。用超大刀（70 nm）用钻石刀使用超大型超大醇组（Reichart-jung）切割
，在3毫米铜（网状）网格上收集，用2％铀酰乙酸铀酰（70％乙醇）（在70％乙醇中洗涤3米） ，用稀疏的3次水平的水清洗
，并用盐水清洗，并用Na preser涂抹 ，并用盐水清洗
，并用盐水清洗，并用盐水清洗 ，并用含有液液洗涤
，并涂上液体，并用盐水清洗 ，并用na-cit，并用含有较低的水平 。在JEM-1230电子显微镜下检查
。为了量化自噬体
，计数每八个透射电子显微镜图像中的双膜自噬体，并用作一种生物学复制。每个基因型具有五个重复 。 　　如其他地方所述 ，将种子播种在直径10厘米的塑料杯中
，并在植物生长室（Conviron PGC2000）生长
。为了分析BISP水平和自噬之间的关系，在选定的时间点（在实验结束前的6、12 、24
、48和72小时）将4叶水稻植物与第二或第三类BPH若虫（每植物10个）感染。对照组并联 ，但没有BPH侵扰 。在处理的尽头
，将叶鞘用浸泡在酒精中的棉布擦拭以去除蜜糖，切除叶鞘 ，冷冻并磨碎到液氮中的细粉末
，并分离蛋白质
。按照上述程序在“蛋白质提取，免疫印迹和体内co-IP分析
”部分中进行的程序进行免疫印迹。所有治疗都重复了三次 。 　　为了测量BPH侵扰后的自噬和BISP水平 ，将4叶水稻植物用第二或第三类BPH若虫（每植物10）侵染24小时。然后除去昆虫
，并允许植物在标准条件下生长（如上所述）
。在去除BPH后选定的时间点，将蜜糖从叶鞘中取出 ，切除叶子，冷冻并磨碎至液氮中的细粉末
，并分离出蛋白质。按照上述程序进行免疫印迹 。所有治疗都重复了三次
。 　　对于自噬抑制剂CONA治疗，在收集样品之前 ，将BPH侵袭和非侵入的水稻植物用或不含CONA（10μM）处理12小时。根据上述程序进行叶鞘总蛋白提取和免疫印迹 。所有治疗都重复了三次
。 　　为了调查BPH14和BPH14 -BISP植物的农艺性能
，在常规管理下，在中国武汉的一个田地生长。在收获时 ，评估了每个图的中心排的中间植物的以下九种农艺性状：植物高度
，剑叶长度，剑叶宽度 ，每植物的圆锥花序数
，每个植物填充谷物的数量，每植物填充谷物的数量 ，填充谷物的百分比
，1,000粒的重量，1,000颗粒的重量 ，每植物的谷物产量和每植物的谷物产量63 。 　　没有使用统计方法来预先确定样本量
。实验不是随机的，在实验和结果评估过程中
，研究人员并未对分配视而不见。使用ImageJ软件进行了蛋白质丰度的定量分析 。所有值均表示为平均值±S.D.或平均±S.E.M.如所示
。数据点绘制在图上，并在相应的图传说中指示样品数量。在所有情况下 ，通过从新工厂收集材料来进行重复的采样
，并且在时间点之间进行了采样 。所有统计分析均通过使用MS Excel和GraphPad Prism（V.8.0.1，GraphPad软件）的单向方差分析进行。补充表4中提供了有关所有实验统计分析值的详细信息
。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。