小鼠（C57BL/6J，杰克逊实验室）的细胞核悬浮液是由2个雌性和4只雌性小鼠（60天大） ，1个雄性E18小鼠
，1个雄性P0（新生儿），1个雌性P4（4天雌性P4（4天） ，1个雌性P8、2雌性P12和2雌性P12和2雌性P16小鼠
，产生了小脑轮廓。成年小鼠以12小时的浅色黑暗时间表为组，并允许在抵达后的两个星期内适应其住房环境 。到达后6天 ，接收到定时的怀孕小鼠并安乐死以产生E18小鼠
。新生小鼠被安置为单个垃圾，长达16天。所有实验均由广泛的IACUC协议编号012-09-16批准 。 　　在E18
，P0，P4 ，P8
，P8，P12 ，P16和P60时
，C57BL/6J小鼠通过在流动3％异氟烷的气体室中给药1分钟，通过给药来麻醉
。通过检查负尾巴和爪子捏反应来确认麻醉。将小鼠移至解剖托盘中 ，并在过程的持续时间内通过流动3％异氟烷的鼻锥延长麻醉 。对成人
，孕妇（E18），P8 ，P12和P16小鼠进行了心脏灌注
，含有110 mM NaCl，10 mM HEPES ，25 mm葡萄糖，75 mm蔗糖
，75毫米蔗糖，7.5 mm MGCL2 ，以及2.5 mm MGCL2
，以及2.5 mm MM KCl的血液，可去除大脑的血液。P0和P4小鼠未渗透
。将大脑从P60 ，P8
，P12和P16小鼠中除去，并在液氮蒸气中冷冻3分钟。E18 ，P0和P4小鼠在同样冻结其脑部原地冻结后伴随着一分系 。将所有组织移至-80°C以进行长期存储
。可以通过protocols.io（https://doi.org/10.17504/protocols.io.bcbrism6）获得详细的协议。 　　冷冻的成年小鼠大脑被额叶皮层牢固地安装在带有OCT嵌入化合物的低温恒温器上
，以使包括小脑和脑干在内的整个后半部分被暴露于暴露和热不受干扰 。通过在低温恒温器中手动进行16个小脑vermal和皮质小叶中的每一个，并使用眼科微米（羽毛安全剃须刀P-715）在低温恒温器中进行解剖 ，并预先冷却至-20°C
，并置入四个手术助理
。整个E18，P0 ，P4，P8
，P12和P16小鼠小脑通过使用预冷冷冻的脑半球从呈菱形小脑含量来策划，使用预冷的1毫米可抛光的可抛光活检（Integra Miltex）。使用预冷的镊子将每个切除的组织解剖置于预冷的0.25 mL PCR管中 ，并存储在-80°C下 。根据协议（https://doi.org/10.17504/protococols.io.bck6iuze）可用的协议
，使用基于温和洗涤剂的分离从这种冷冻组织中提取细胞核，该协议是根据McCarroll Laboratory（Harvard Medical School）提供的 ，并加载到10X CHROM v3系统中
。逆转录和图书馆的生成是根据制造商的协议进行的。 　　如所述
，固定含有Alexa 594填充的斑块细胞的急性小脑切片，并在4°C下储存在70％乙醇中 ，直到杂交链反应（HCR） 。然后
，将它们进行“浮动hcr ”方案进行，其中可以同时将记录的细胞与HCR表达分析当地进行重新成像 ，并将其在小脑中的位置进行分类
。使用以下HCR探针和匹配从分子仪器购买的匹配的发夹：谷氨酸型代替受体8（grm8）lot lot lot lot prc005
，pra67 3322222222222）cadherin22（CDH22）批号PRC011，Neurexophilin 1（nxph1）批号PRC675和PRC466 ，富含亮氨酸的胶质瘤吸收蛋白2（LGI2）批号PRC012（LGI2）PRC012，pRC012
，SOSSTATATATIN（SST）lot Number Number Number Number Number Contorn lo lo lo lo los 3（索尔）3（sore）3（PRC004。使用的放大发夹分别为488 nm，647 nm和546 nm的B1型 ，B2和B3 。 　　浮动式HCR之后
，将切片安装在1号盖玻片之间，盖上有反式化合物（延长玻璃 ，Invitrogen）
，并在Andor Csu-X旋转磁盘共聚焦系统上收集图像，并耦合到配备了Andor Ikon-M摄像头的Nikon Eclipse Ti显微镜。这些图像是用60倍的油浸入物镜获得的
。Alexa 594补丁的细胞回填通道（561 nm）以及相关的HCR探针/发夹通道（488 nm和647 nm）通过10–20μm厚的Z系列投影 ，以便可以在填充填充的细胞及其HCR基因表达之间明确确定相关性。使用Nikon NIS Elements 4.4和Nikon Nis AR处理图像 。 　　人类供体组织由UCLA的人脑和脊髓资源中心通过NIH Neurobiobank提供
。这项工作是由研究对象保护办公室确定的
，不符合人类受试者研究的定义（项目ID NHSR-4235）。 　　来自人脑脑的核悬浮液是由两个神经病理学正常的对照病例产生的 - 一个年龄35岁的女性组织供体和一个雄性组织供体，年龄36岁 。这些新鲜的冷冻组织分别为12.5 h ，并在整个小脑室中提供了四个Coronal Slabs
。根据Protoctss.io（https://doi.org/10.17504/prototococols.io.bck6iue protive of Protive）
，使用柔和的，基于洗涤剂的分离在10倍加工和细胞核中进行了冻结小脑叶的截止点 ，并在10倍加工和细胞核之前进行了冰冻小脑小叶的划分。 　　急性副旁臂切片以240μm的厚度与年龄P30-P50的野生型小鼠厚度制备 。Mice were anaesthetized with an intraperitoneal injection of ketamine (10 mg kg−1), perfused transcardially with an ice-cold solution containing (in mM): 110 choline chloride, 7 MgCl2, 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 0.5 CaCl2, 25 glucose, 11.5 sodium ascorbate, 3 sodium pyruvate, 25Nahco3，0.003（R）-CPP
，用95％O2和5％CO2平衡
。将切片切成相同的溶液，然后转移到含有（以mm）为单位的人造脑脊髓液（ACSF）中 ，125 NaHCO3
，26 NaHCO3，1.25 NAH2PO4 ，2.5 KCl
，1 mgcl2，1.5 Cacl2 ，1.5 Cacl2和25 Glucose用95％O2和5％Co2平衡了30分钟34°C C.然后将切片保持在室温下直至记录。 　　所有UBC记录均在34–36°C下使用（以μm）2（r）-CPP
，5 NBQX，1 strychnine ，10 Sr95531（Gabazine）（Gabazine）和1.5 cgp进行浴缸
，以分离出代谢型 。用ACSF填充的贴片移液管制作了宽松的细胞连接记录
。将整个电压钳记录保持在-70 mV时，用内部包含（以mm为单位）：140 kcl ，4 naCl，0.5 cacl2
，10 hepes，4 mgAtp ，4 mgatp
，0.3 nagtp，0.3 nagtp ，5 egta 5和5 egta 5和2 qx-314
，pH pH调节至7.2 with Koh。使用Picospritzer II（General Valve Corp.）在细胞连接和全细胞构型中使用Picospritzer II（General Valve Corp.）进行短暂的谷氨酸（1毫米为50 ms），以确保一致的响应 。所有细胞的电流迹线的热图在所有细胞上的记录的奇异值分解（SVD）之后 ，在第一个主轴上的得分对分数进行了排序。 　　对于使用药理学的全细胞记录
，我们使用了k-甲磺酸盐内部含有内部含有（MM）：122 k-甲磺酸盐，9 NaCl ，9 hepes
，0.036 cacl2，1.62 mgcl2 ，1.62 mgcl2，4 mgatp
，4 mgatp，0.3 gtp ，0.3 gtp（tris salt）
，14 reactine ph ph ph ph ph ph 7.18 eg4和0.18 egta，和0.18 e18 ，和0.18 ers）
，和0.18 ers），和0.18
。在记录过程中 ，补偿了-8 mV的连接电位。与上面列出的突触阻滞剂结合使用了300nm TTX 。三个填充含有1 mm谷氨酸
，100μMDHPG或1μMLY354740的移液管位于记录的细胞的20μm之内
。每种激动剂的压力施加在10 psi的持续时间为40–50 ms。激动剂应用分开30 s 。为每种激动剂收集了两到三个试验
。 　　MLI记录在大约32°C下使用（以毫米为单位）150 k-葡萄糖酸盐，3 kCl ，10 hepes
，3 mgATP，0.5 GTP ，5 GTP，5磷酸蛋白Tris2和5磷酸蛋白TRIS2和5磷酸磷酸盐NNA2
，2 mg ml-1 biocytin and 0.1 alexa and alexa 594（phoh tose）（phoh tose）（7.17）310 MOSM kg -1）。通过从硼硅酸盐毛细管玻璃（BF150-86-10，Sutter仪器）中取出的约4MΩ电阻的贴片移液器获得了视觉引导的全细胞记录 。使用多灯700B放大器（轴突仪器）获取电生理学数据 ，以20 kHz数字化并以4 kHz过滤
。为了在MLI记录中分离尖峰
，将细胞保持在-65 mV的电压夹中，并将以下受体拮抗剂添加到溶液（以μm为单位）中 ，以阻断突触电流：2（r）-CPP
，5 NBQX，1 strychnine ，1 strychnine
，10 Sr95531（gabazine）（gabazine），1.5 cgp。所有药物均购自Abcam和Tocris 。为了获得输入输出曲线 ，将MLI保持在60-65 mV的情况下
，并具有恒定的超极化电流，并以10 pa增量注入了从-30 PA到+100 PA的250 ms电流步骤
。为了激活超极化诱发的电流（IH） ，将MLIS保持在-65 mV和30 PA超极化电流的持续时间为500 ms。计算IH的幅度是由超极化电流步骤与当前步骤末端（480-500毫秒）的平均稳态电流引起的最大电流之间的差 。使用10 PA，50 ms超极化电流步骤确定电容和输入电阻（RI）。为了防止过度的透析并确保在记录细胞中成功检测mRNA
，记录的总持续时间不超过10分钟
。使用MATLAB（MATHWORKS），IGORPRO（WAVEMERTIC）或AXOPHOPHX编写的自定义例程对电生理数据进行了获取和分析。数据报告为中位数±四分位数范围 ， 如前所述
，使用Mann -Whitney或Fisher的精确测试进行了统计分析 。假定在p <0.05时统计显着性
。 　　为了确定Spikelets的存在，使用峰值检测来基于原始迹线的平均绝对偏差（MAD）来生成带有阈值的事件触发的平均波形。对尖峰记录进行了评分 ，以使尖刺的存在视为细胞的分子身份 。该分析仅限于在存在突触阻滞剂存在下记录的细胞
。 　　MLIS通过贴片移液管填充了100μMAlexa-594
，以使用两光子成像来形象化其形态。电生理记录完成后，将贴片电极缓慢地缩回并重新密封 。我们使用了一个定制的两光子激光扫描显微镜 ，具有40倍
，0.8个数值光圈（Na）物镜（Olympus光学）和脉冲两光子激光器（变色龙或Mira 900，相干 ，800 nm兴奋）
。在每个实验的末尾获取了DIC图像
，并记录了切片中每个单元的位置。在ImageJ中进一步处理了两光子图像 。 　　记录和成像后，将小脑切片转移到固定板中 ，并在PBS中浸入2–4％PFA中（pH 7.4），并在4°C下孵育过夜
。然后将切片在PBS（3×5分钟）中洗涤
，然后将其保存在无RNase的水中70％乙醇中，直到进行HCR。 　　使用带有默认设置的CellRanger v3.0.2对鼠标小脑实验的测序读数进行反复列出 ，并与鼠标（MM10）PremRNA参考对齐 。使用细胞旋转器计数函数生成数字基因表达矩阵。使用Drop-Seq Alignment Workflow2对人小脑实验的测序读数进行了反复的曲线并与人（HG19）PremRNA参考排列
，该作品也用于生成下游数字基因表达矩阵
。 　　为了估计小脑中足够采样稀有细胞类型的概率，我们使用了Satija实验室提出的方法（https://satijalab.org/howmanyycells） ，并假定在最多10个非常稀有的细胞类型中
，每种方法都与0.15％的percepercorce of Percepence。我们根据我们确定的两种最稀有的单元格类型的观察到的患病率（opc_4，purkinje_aldoc_2）得出了最低限度 。我们将70个细胞设置为足够采样的阈值 ，并将总体概率计算为负二项式（NB）密度： 　　其中k = 70
，p = 0.0015，m = 10 ，n代表采样的单元格总数
。 　　如上所述
，在生成数字基因表达矩阵之后，我们以少于500 UMIS的核酸核过滤了核。然后 ，我们通过降低尺寸降低，聚类和去除具有高线粒体表达的假定双重双线和细胞进行了多个尺寸降低
，聚类和去除 。对于初步聚类步骤，我们进行了标准的预处理（UMI归一化 ，高度可变的基因选择
，缩放），如先前所述38
。我们使用了带有30个组件的主成分分析（PCA） ，并使用分辨率为0.1的Louvain社区检测来识别主要集群（导致34个簇）。在此阶段
，我们基于规范细胞类型标记的共享表达合并了几个簇（主要是颗粒细胞簇），并删除了一个顶部差异表达基因的簇是线粒体（导致11个簇） 。 　　对于这些主要细胞类型簇中的群集注释的随后一轮 ，我们使用整合性非负基质分解（INMF）应用了先前描述的Liger工作流程的变体
，以限制样品和性别特异性基因表达的效果
。简而言之，我们通过选定的高度可变基因7和空间可变基因的UMIS数量将每个细胞归一化（请参见下面的部分） ，进行INMF
，并使用Louvain社区检测进行聚类（省略分位数归一化步骤）。在注释过程中除去了不同细胞类型或线粒体基因表达高表达的污染的簇，在注释过程中除去了线粒体基因的污染 ，但未包含在随后的注释中 。重复此迭代注释过程，直到在一轮聚类中未识别出污染簇为止
。使用Seurat的Findallmarkers功能
，使用Wilcoxon秩和测试进行注释回合中的差异表达分析。使用PRESTO软件包39的Wilcoxauc函数进行了所有46个最终注释簇的全面差分表达分析 。Liger注释步骤中使用的完整参数和更多细节可以在补充表4中找到。 　　如图1B所示，我们合并了所有注释的高质量核并重复的初步预处理步骤 ，然后使用25个主成分进行UMAP
。 　　在生成人核谱的数字基因表达矩阵之后
，我们以少于500 UMIS的核心过滤了核。然后，我们使用标准的Liger工作流程（跨批次集成）进行了初步的细胞类型注释 ，以识别主要的人间神经元间种群（UBCS
，MLIS和PLIS，Golgi细胞 ，颗粒细胞；基于与补充表1中相同的标记物） 。我们重复了上面指定的四个细胞群体（具有额外的分位数标准化步骤）的相同工作流程的迭代
，以识别和删除假定的Doublet和人为群体
。最后，我们按照先前所述的40进行了INMF Metagene投影 ，将人数据集投射到从相应的鼠标单元类型数据集派生的潜在空间中。然后
，我们执行了分位数归一化和卢文集群，根据先前注释的鼠标数据簇分配关节簇 。对于颗粒细胞关节分析 ，我们首先将小鼠数据限制为仅包括在人类数据收集中采样的五个小脑区域（Lobules II，VII
，VIII，IX和X）
。对于高尔基细胞关节分析 ，我们进行了INMF（跨物种的整合）
，而不是metagene投影。 　　为了识别具有较高区域差异的基因，我们首先计算了每个基因的分散索引（对数方差与均值比率 ，LOGVMR）的对数 。接下来
，我们模拟了一个高斯无效分布，其中心为logVMR模式 ，通过执行logVMR的内核密度估计（使用R中的密度函数
，然后是转口函数）
。高斯的标准偏差是通过反映小于中心模式的值来计算的。LogVMR的基因在上尾部，p <0.01（调整后的Benjamini – Hochberg）被排除为空间可变 。对于颗粒细胞和PC簇分析 ，调整后的P值阈值分别设置为0.001和0.002
。 　　为了确定簇的小叶组成是否与相应的外部水平细胞类型小叶分布有显着不同
，我们使用了由Pearson的Chi-squared Test近似于K-1的自由度的多项式测试，其中k是k的总叶子总数（16）。群集I和小叶J的预期核数量如下： 　　其中Ni是群集I和NJ中的核总数是小叶J中的核数（在外部水平细胞类型中的所有簇中 ，所定义的所有簇） 。使用R中的p. phjust函数对所得的P值进行了FDR调整（Benjamini – Hochberg）。 　　每个集群I和每个小叶J的小叶富集（LE）得分由以下方式计算： 　　其中NIJ是群集I和Lobule J中观察到的核的数量，而NJ是小叶J中的核数（在外部水平细胞类型中的所有簇中）
。对于此分析
，我们使用了图2a中彩色的粗细胞类型定义，并合并了PLI簇。在下面的小叶组成测试和复制一致性分析中 ，我们将颗粒细胞缩小到60,000个核（接下来的大量细胞类型是具有45,767个核的MLI和PLI簇） 。 　　为了确定每个区域中重复的小叶富集得分的一致性
，我们通过将每个区域中最有代表的重复分配的核分配给“重复1
”和核从第二个区域中第二大复制中的第二个区域分配给“复制1”，从而指定了两组复制
。之所以使用这项任务 ，是因为并非所有地区都有所有个人的代表
，有些人只有两个人的代表。我们使用每个重复集分别计算了每个群集的小叶富集得分；然后，我们计算了每个集群的两组小叶富集得分之间的Pearson相关性 。当小叶富集在生物学上一致时 ，我们希望簇的相关性很高
。我们注意到
，一个群集（Purkinje_aldoc_2）被排除在重复一致性分析之外，因为在此设计下 ，它仅来自一个汇总的重复。但是
，我们证实了该簇的小叶富集与艾伦脑图表达染色非常一致（扩展数据图3C） 。 　　为了表征跨细胞类型的分子变异，我们试图量化给定细胞类型对的缩放基因表达的连续性 ，这是通过伪级等级排序的（使用MonoCle2计算）
。对于每个基因，我们将逻辑曲线拟合到缩放基因表达值
，并计算出所得曲线的最大斜率（M），因为细胞的数量和动态拟合的动态范围都归一化。为了限制计算复杂性 ，我们将细胞类型对降低至5,000个总核 。 　　我们适合五个细胞类型对的最显着差异表达基因的曲线和计算的M值（图3B）
。使用Seurat的Findmarkers功能确定差异表达的基因。然后
，我们绘制了每个细胞类型对的前200个基因的M值的累积分布 。根据缩放基因表达和伪级等级之间的绝对长矛人相关性来选择基因。 　　在产生了周期和产后小鼠谱的数字基因表达矩阵之后，我们以少于500 UMIS的核心过滤了核
。我们应用了Liger工作流程（类似于成年小鼠数据分析） ，以识别与主要发育途径相对应的群集。然后
，我们分离了与GABA能祖细胞相对应的簇（以TFAP2B和其他规范标记的表达为标志） 。我们在该人群上进行了第二次迭代的Liger INMF和Louvain聚类，并产生了UMAP表示
。使用此UMAP表示 ，我们计算了具有单封型341的相应轨迹图和相应的轨迹图。为了识别沿计算轨迹变化的基因模块
，我们使用了graph_test和find_gene_modules函数 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得
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