细胞系从美国型培养物收藏（ATCC）（HEK293T/17
，Madin-Darby犬肾（MDCK），MDCK-London（MDCK-LN）和A549）和Thermo Fisher Scientific Sc​​ientific（Expicho-S-S-S-S和Expi293F细胞）中获得
。分别将EXPI293F和Expicho-S细胞分别维持在Expi293表达培养基（Gibco）和Expicho表达培养基（Gibco）中。DMS实验中使用的293-F细胞（Thermo Fisher）在Transduction Freestyle™293表达培养基（Thermo Fisher ，12338018）或由DMEM组成的变质后培养基中进行培养
，该培养基由DMEM + 10％FBS + 1％HEPES + 1％HEPES + 1％hepes + 1％pen/strep，与1.5μg/ml pursomecin一起选择 。经常对本研究中使用的所有细胞系进行支原体测试 ，并发现不含支原体
。野生型流感菌株是从国际试剂资源（CDC）和生物参考材料中心（NIBSC）获得的。如先前所述51进行了病毒量的传播 。In brief, MDCK-LN cells (FR-58, International Reagent Resource) were seeded at 6 × 106 cells in a T75 flask in growth medium (DMEM (11995040, Gibco), 10% FBS (97068-085, VWR), 0.01 M HEPES (15630-080, Gibco), 100 U ml−1 penicillin–100 µg ml−1链霉素（15140-122
，Gibco）），第二天在感染培养基中以0.1的多种感染（MOI）感染
。感染前用PBS洗涤细胞两次。在感染培养基（DMEM ，0.1％BSA
，0.01 M HEPES，100 U ML -1青霉素-100 µg ML -1链霉素）中稀释病毒 ，并在37°C下添加1 h 。吸收后
，去除病毒接种物，将细胞用PBS洗涤一次 ，并在10 ml的感染培养基中洗涤2 µg ml-1的-1-甲基酰胺-2-苯基乙基氯甲基氯聚甲基酮（TPCK）的细胞（100 mg; ls003740，worthingthingthingthingthingthingtonton tothemical to tothemical to tothemical to to tothemical to tothemical to tothemical to tothemical to tothemical to to tothemical to to to tothemical to to to tothemical to to to to to to tos）将感染的细胞在37°C下以IAV和35°C的IBV在组织培养培养箱中的IBV孵育24小时
。然后收集感染培养基
，以2,000克旋转5分钟，并收集上清液 ， 等分并存储在-80°C下。如下所述
，病毒滴度是通过每毫升焦点形成单位（FFU）确定的 。 　　从瑞士献血中心获得了来自健康个体的样本
。献血者通过书面信息同意书同意其血液或某些成分可以匿名用于研究目的。在当地机构审查委员会批准的研究方案（瑞士广州Ticino伦理委员会）批准的研究方案的背景下，在Vir Bellinzona进行了匿名血液样本 。 　　从冷冻保存的外周血单核细胞（PBMC）中分离出来自选定供体的记忆B细胞如下：CD19+ B细胞通过用PBMC从PBMC中富含PBMC ，用phycoerythrin（PE）Cy7标记的抗恒定抗人类CD19（BD Bioscience）在冰上进行30分钟（米兰）（米兰）（米兰）（米兰）（米兰）（米兰）
，旋转30分钟，旋转（米拉） ，并播放30分钟的米兰（Biosci）（米兰）（米兰）。20分钟
，最后在MAC分离LS柱（Miltenyi Biotec）上选择了阳性
。通过用链霉亲和素AF647（Lifeologies），抗人类Iga PE（Southeran Iga pe） ，抗生物技术和抗生物技术和抗生物技术和抗生物素化（n Na1）
，通过用生物素化的重组N1（H5N1 IAV-NA； VIVA Biotech）染色来分离来自IAV（N1-IAV）反应性记忆IgG+ B细胞的Na1。IgD PE（BD Bioscience）在冰上持续45分钟，并通过FACSARIA（BD Biosciences）上的荧光激活细胞分选（FACS） 。在存在2.5μgml-1 CpG 2006 ，500 U ML-1 IL-2，5 ng ML-1 IL-6（BD Pharmingen）的情况下
，将细胞与10％FBS一起恢复在IMDM中，50 ng ml-1 IL-6（BD Pharmingen） ，50 ng ml-1 IL-1 IL-10（IL-10）（IL-10）和10 ng ml-1 IL-21 IL-21（IMML-21 IL-21）（IMML-21）（IMML-21）（IMML-21）（IMML-21）（IMML-21）（IMML-21）（IMML-21）384孔微滴定板中的间充质干细胞（Corning）
。8-10天后
，将上清液在高通量Ella中筛选其NAI活性。在NAI Assay Munana（Ni-Munana）中，对具有NAI活性的B细胞上清液进行了对N1 ，N2和N9（Viva Biotech）的次要筛选 。裂解交叉反应性记忆B细胞
，并克隆重链和轻链的可变区域
。 　　从选定的B细胞培养中合成互补的DNA（cDNA），并以前描述的52通过PCR检索重链和轻链变量区域（VH和VL）序列。使用数据库IMGT（http://www.imgt.org） ，通过分析已知人类V
，D和J基因的VH和VL序列的同源性来确定VH和VL基因家族和体细胞突变的数量 。使用IMGT/V-Quest构建了VH和VL的未分泌的共同祖先（UCA）序列
。 　　使用在线多重序列对齐程序Clustal Omega（https://wwwwwwww.ebi.ac.ac.ac.uk/tools/tools/mmsa/msa/mmsa/clustalo/）对齐14个克隆相关mAb（FNI1 – FNI20）的VH和VL区域的DNA序列。随后，使用UA推理应用程序生成UCA序列 ，并分别使用Dnami Software和Ancestree Software进行系统发育树的生成和分析53 。假设在两个基因上都有相同的单个体细胞取代过程
，则产生了连接重链和轻链序列的系统发育树
。在单个替代过程的假设下，将每个重链序列附加到同一克隆的轻链序列中 ，以进行系统发育重建。使用blosum62氨基酸取代的RAXML-NG推断系统发育和祖先状态 。 　　将VH和VL区克隆到IgG1和Igκ表达向量52中，并通过使用Expifectamine Chostection Kit（Thermo Fisher Scientific）的瞬时转染（Thermo Fisher Scientific）重组表达。8天后
，使用HITRAP蛋白A柱（Cytiva）上的äktaXpress快速蛋白质液相色谱（Cytiva）上的蛋白A色谱纯化细胞培养上清液，然后使用HIPREP使用HIPREP 26/10脱水柱（Cytiva）进行缓冲液与组氨酸缓冲液（Cytiva）
。使用MABPAC蛋白A色谱柱（Thermo Fisher Scientific）对纯化的抗体进行定量。FNI17和FNI19 Fab是通过使用与全IgG抗体报告的相同条件的瞬时转染来重组产生的 。FNI9 Fab是在HEK293悬浮细胞中生产的
。使用Captureselect IgG-CH1树脂（5943462005 ，Thermo Scientific）进行纯化
，然后将缓冲液交换成PBS。根据制造商的协议，使用Fabalactica Fab套件（A2-AFK-025 ，Genovis）通过相应的IgG片段化获得1G01 FAB 。 　　在人CMV启动子的控制下
，将IAV和IBV NA蛋白编码序列克隆到PHCMV1表达质粒（Genlantis）中
。在转染之前，在50毫升生物反应器中 ，转染之前
，分别以每毫升的6×106细胞或3×106个细胞为5 ml的每毫升3×106个细胞。按照转染试剂盒随附的方案，使用外叶置胺CHO或Expifectamine 293转染试剂盒（Thermo Fisher Scientific）将细胞用5 µg Na质粒转染 。然后将转染的细胞在37°C下在8％CO2下以250 rpm的轨道振动速度（轨道直径为25 mm）孵育48小时
。 　　通过与流式细胞仪结合在细胞表面表达的Na蛋白来进行对第1组和第2组IAV NAS的交叉反应血浆的选择 ，并评估最佳FNI mAb的宽度。收集表达expicho-s或expi293f细胞的NA
，在FACS缓冲液中洗涤两次（补充了2％FBS和2 mM乙二胺二乙酸乙酸），对96孔U-Bottom Plates（Corning）进行计数并分布 。将血清或mAB连续稀释 ，并在冰上与细胞一起孵育45分钟，然后在FACS缓冲液中洗涤
。在冰上孵育20分钟后
，将Alexa Fluor 647标记的山羊抗人IgG二级抗体（Jackson Immunoresearch）以1 µg ml-1的形式加入1 µg ml-1。然后用FACS缓冲液洗涤细胞，并在ZE5流式细胞仪（Bio-Rad）上进行分析 。将数据标准化为NA阳性细胞分数 ，并使用FlowJo软件进行分析。 　　通过在56.7-CM2细胞培养皿（NUNC）中转染HEK293T/17细胞来产生仅基于NA的颗粒（NA-VLP）
。使用X-三分法HP（Roche）与1 µg表达Na的质粒和8 µg互补的病毒基因组报告媒介PNL4-3.LUC+.E-R+一起转染细胞。使用A 1：3 DNA：X-三分法HP比
，并按照制造商的协议进行转染 。将转染的细胞孵育72小时，然后收集上清液并将其存储在-80°C中
。本研究中使用的伪粒子是由H1N1 A/SWINE HEBEI/0116/2017 ，H1N2 A/SWINE/KANSAS/A02246977/2021
，H7N3 A/CK/JA/JA/PAVX17170/2017，H7N3 A/CASCARANT/CANACA CANCA CANCARARY HAS生成的NAS生成的。duck/Netherlands/30/2011, H6N5 A/aquatic bird/Korea/CN5/2009, H4N6 A/swine Ontario/01911-1/99, H5N6 A/Hangzhou/01/2021, H5N6 A/Ck/Suzhou/j6/2019, H7N7 A/Ck/621572/03, H5N8A/CK/俄罗斯/3-29/2020和H7N9 A/Anhui/1/2013 。 　　含有N末端IGK轻链分泌序列 ，6×His-TAG
，AVITAG，四侧四聚体化结构域的NA蛋白 ，在37°C和8％CO2的EXPI293F细胞中表达在EXPI293F细胞中表达在EXPI293F细胞中表达的凝血酶或烟蛋白或烟蛋白或烟草蛋白酶
。转染后4天收集细胞培养上清液
，并使用Nickel-NTA琼脂糖（Qiagen）纯化蛋白质。使用SuperDex 200 10/300 GL或SuperDex 200（16/600）（Cytiva）列，将蛋白质被缓冲液交换为50 mM Tris-HCl ，150 mM NaCl和10 mM CaCl2（pH 8.0）（pH 8.0） 。NA来自A/Tanzania/205/2010，NA B/Perth/211/2001和Na B/Malaysia/2506/2004被缓冲液交换为PBS（136.8 mm NaCl
，2.5 mm KCl，0.8 mm Na2hpo4 ，Na2hpo4
，1.47 mm kh2po4，1.47 mm kh2po4 ，0.9 mm cacl2和0.9 mm cacl2和0.5 ccl 2和0.5 mmMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMM.MMMMMMM.MMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMM
。 　　将384孔（NUNC）或96孔半区域ELISA（Corning）板与25 µg ml-1的fetuin一起在4°C涂层过夜。用含有Ca2+ Mg2+（Gibco）的PBS中的BSA（Sigma-Aldrich）的1％W/V溶液阻止板块
，并在室温下孵育1小时 。同时，将mAb连续稀释 ，并与固定量的重组Na蛋白或Na-VLP混合
，并将混合物转移到以前已洗涤的Fetuin涂层板上
。在37°C下孵育过夜后，将板洗涤 ，并从花生 - 阿古谷丁蛋白（Sigma-Aldrich）用辣根过氧化物酶标记并在室温下孵育1 h中1 µg ml-1凝集素。进一步洗涤后
，添加Sureblue储备TMB 1组分（KPL），并在与1％盐酸溶液中阻断反应后在450 nm处读取板 。 　　在96孔黑板（Greiner）或384孔黑板（TTP LabTech）中 ，将mAb连续稀释并与固定量的重组Na蛋白混合，并在37°C下孵育30分钟。随后
，将Munana底物（Sigma Aldrich）以16.7 µm的最终浓度添加
。将板在37°C下孵育2.5-5 h，然后用Munana stop溶液（0.2 m甘氨酸/50％ET-OH ，pH 10.7）停止反应
，并使用Cytation 5（在365 nm处激发，在445 Nm时发射）通过荧光测量Na活性。 　　使用Biacore T200仪器进行测量 。具有共价固定的抗AVI TAG多克隆抗体（A00674-40 ，genscript）的CM5芯片用于表面捕获带有AVI标签的Na蛋白（Glndifeaqkiewhe）
。用HEPES缓冲液和添加的P-20和氯化钙（HBS P+ CaCl2：10 mM HEPES（4-（2-羟基乙基）-1-磷酸硫代硫酸酸）pH 7.5
，150 mm NACL，0.005％W/V P-20和10毫米CACL2）。再生条件是两次注射75 mM磷酸 ，每次注射1分钟 。在25°C下进行测量
。实验是用四倍稀释系列单体晶圆厂（800
、200、50和12.5 nm）进行的
，并作为单周期动力学运行。 　　使用BIACORE Insight软件将数据减去双重参考，并拟合到结合模型中 。使用恒定RMAX的1：1结合模型用于估计动力学参数
。对于每个配体（Na蛋白） ，在所有Fabs对于特定的Na蛋白配体的所有Fabs均具有相同的RMAX的假设
，它是默认1：1结合分析的所有FAB分析物的所有RMAX值的最大值。在所有周期中，每个配体的一致捕获水平（在8％以内）证明了这一假设 。对每个配体（NA蛋白）进行了两次技术重复进行两次实验
。KD值报告为两个重复的平均值。对于分离常数KD的测量值慢于仪器的检测范围（KD <10-6 s -1） ，结合亲和力（KD）表示为小于0.01 nm 。 　　通过免疫荧光染色，通过在MDCK-LN细胞上对MDCK-LN细胞上的FFU测定确定病毒滴度。将MDCK-LN细胞接种到平底组织培养96孔板（3904
，康宁），每孔25,000个细胞 ，并在37°C下在生长培养基中在37°C培养过夜
。二十四小时后
，在含有0.5 µg mL-1 TPCK处理的胰蛋白酶的感染培养基中制备了五倍的病毒储备，每次稀释均以四倍的稀释度进行了测试。用DMEM培养基洗涤细胞 ，然后用50 µL稀释的病毒感染 。在37°C下吸收30分钟后
，去除接种物，将细胞在DMEM培养基和100 µL感染培养基中洗涤一次 ，并具有2.4％的胶体纤维素覆盖层（435244
，Sigma）和0.5 µg ML-1 TPCK训练的胰蛋白酶蛋白酶均添加到每个孔中
。在37°C下孵育24小时后，IAV和35°C的IBV孵育后 ，用4％多聚甲醛（AA233689L
，Fisher）固定细胞在室温下30分钟固定30分钟，用洗涤液洗涤3次 ，用洗涤/pers缓冲液（pbs中的0.5％triton x-100）以100％允许居住在居住的小细胞中，然后允许使用居住的小细胞。缓冲液30分钟 。将细胞与50 µL抗Influenza A或抗Influenza B核蛋白抗体（AB128193或AB20711
，ABCAM）在1：1,000和0.5％BSA中在洗涤/Pers缓冲液中孵育1小时
。然后将细胞与50 µl山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor Plus 647（A-32728，Invitrogen）在1：1,000时 ，用2 µg ml-1 Hoechst染料（10 mg ml-1; H3570； H3570
，Invitrogen，Invitrogen ，Invitrogen）在1 h/pers for 1 h和3 hece flasts wash和pix ins/pix fuffer中进行。在S6通用M2板成像仪上成像板
，并通过计算包含10-20个不同焦点的井来计算产生的FFU滴度 。 　　通过调整先前描述的方案55，在多环形测定中评估了微中和化
。简而言之 ，将MDCK-LN细胞接种到平底组织培养96孔板中
，每孔25,000细胞，并在37°C下在生长培养基中在37°C培养过夜。二十四小时后 ，将病毒储备稀释在含有0.5 µg ml-1 TPCK处理的胰蛋白酶的感染培养基中
，最终浓度为每孔70 FFU，将细胞用DMEM培养基洗涤一次 ，然后将50 µL的稀释病毒添加到细胞中并在37°C下孵育30分钟 。在含有0.5 µg mL-1 TPCK处理的胰蛋白酶的感染培养基中制备了九分1：5的单次稀释液，每次稀释均以三份测试（最终范围：50,000-0.128 ng ml-1）
。将稀释的抗体与胶体纤维素覆盖层（最终浓度为2.4％）混合在含有0.5 µg ML-1 TPCK处理的胰蛋白酶的感染培养基中
，然后将感染的细胞用DMEM培养基洗涤一次，并将其与纤维素覆盖层一起添加到孔中。将细胞在37°C下以IAV孵育24小时 ，IBV B/VICTORIA/2/87样病毒和35°C的IBV B/Yamagata/Yamagata/16/88样病毒在组织培养物中的IBV B/2/87样病毒和35°C孵育48小时 。根据与上述病毒滴定测定法相同的程序测量病毒复制。在Cytation5读取器上成像板
。获取了全孔图像（每孔以×4放大倍数为×4的图像）
，并使用制造商的软件计数核素阳性细胞。为了控制背景，计算了未感染的井中阳性细胞的平均计数 ，并从所有数据点中减去 。将所有阳性细胞计数标准化为无抗体治疗控制
。使用GraphPad Prism软件（v9.0.0）对数据进行了分析和绘制。使用非线性回归模型（可变斜率模型
，四个参数）（抑制剂）计算IC50值 从y = 50处的曲线中插值，与响应和IC50值进行了插值 。两个独立实验的几何平均值 ，其中在Excel中计算了一式三份测试的抗体
。 　　为了确认每个病毒菌株中和测定中使用的输入病毒的实际TCID50
，并联进行TCID50病毒测定法。对于此测定，将输入病毒在50μL中的双重连续稀释添加到包含MDCK-LN细胞的重复井中 ，并在37°C下与微中性化测定法平行孵育30分钟 。将细胞用DMEM洗涤一次
，并将含有0.5 µg ML-1 TPCK处理的胰蛋白酶胰岛素的100 µL感染培养基添加到细胞中，并与中和板一起孵育
。根据与上述病毒滴定测定法相同的程序测量病毒复制。用Cytation5观察到感染的井 ，并使用Reed -Muench Method56计算产生的滴度 。每个实验的目标病毒输入为每孔100 TCID50
。 　　使用上述体外病毒中和程序对所有含有0.5 µg ML-1 TPCK治疗的胰蛋白酶进行的所有感染培养基进行的体外病毒中和过程进行了细胞浮雕和病毒感染。为了评估两种单克隆抗体之间的协同作用，在感染培养基中制备了Medi8852的七点1：3连续稀释（最终浓度：10-0.01372 µg mL-1） 。随后
，在感染培养基（最终浓度：7.5-0.001143 µg ml-1）中制备了FNI9的九分1：3，并在2-ml深孔平板中与Medi8852在1：1时混合FNI9。然后将稀释的药物组合与胶体纤维素叠加层（最终浓度为2.4％）混合
。将感染的细胞用DMEM洗涤一次 ，并将100 µL的抗体 - 药物与纤维素叠加层混合在井中
，每种条件一式三份测试。将板在组织培养孵化器中在37°C下孵育24小时 。根据病毒滴定测定法中所述的相同过程测量病毒复制，并在Cytation5读板读取器上成像板
。中和协同作用是通过将治疗孔的信号标准化到无抗体病毒控制井的标准化和无病毒细胞控制井 ，并将其导入到基于Web的软件协同试剂中。使用零相互作用的效力统计模型来计算总协同成绩
，其值大于10，表明两种药物之间的可能协同作用 。对每个病毒进行了三个技术重复 ，进行了两个独立的实验
。 　　通过筛选大量病毒种群或在抗体剂量升级的情况下通过串行传播病毒来分离抗体的突变体。For the former approach, MDCK cells were plated into 96-well plates (CON3596, Corning) at 30,000 cells per well in 100 μl of culture medium (MEM + GlutaMAX (41090-028, Thermo Fisher) + 10% FBS Hyclone (SH30070.03, VWR) + 50 U ml−1 penicillin–50 ng ml−1 streptomycin（4-01F00-H
，生物对照） + 100 µg ml-1 kanamycin（15160047，生命技术） + 1％NEAA（5-13K00-H ，生物对象） + 1％p级吡啶钠钠（11360039
，11360039，生命技术）在5％CO2下在37°C下过夜 。第二天 ，将A/香港/1/1968病毒输入与100μgml-1的FNI19抗体预孵育30分钟37°C
。然后将病毒 - 抗体混合物限制在感染培养基中（MEM补充1μgml-1 Tcpk- trypsin（LS003750，Bioconcept）和10μgml-1 kanamycin）以感染MOI的MOI
，在100μl中，在MOI中以100μl的MOI ，200μl的MOI
，200卢比（200卢比）的MOI感染。Sigma-Aldrich） 。三个小时后，加入含有100μgml -1 FNI19的每孔感染培养基100μl ，并将细胞再孵育72小时
。孵育时间后
，在Munana Buffer（32.5毫米MES和4毫米CACL2，PH 6.5）和50μL中 ，每井分配到96孔板中
，在Munana Buffer（32.5 mm Mes和4毫米CACL2，PH 6.5）中制备了20毫米Munana底物（69587-5mg ，Sigma）溶液。在停止溶液（0.2 M甘氨酸和50％ET-OH
，pH 10.7）中，加入每孔100μL ，并用Cytation5（Biotek-agilent）测量在445 nm处的荧光 。将荧光阈值设置为5×未感染细胞的信号，并在该截止物上进行了上清液
，以进行NA测序。使用Qiagen Qiamp病毒RNA试剂盒（52904，Qiagen）从140μl培养上清液中提取病毒基因组RNA 根据制造商的指示
。使用底漆Uni12（5'-AGC RAA AGC AGG-3'）的Superscript III RT试剂盒（18080044 ，Life Technologies）合成cDNA。使用Q5 HotStart DNA聚合酶试剂盒（M0493L
，Bioconcept）通过PCR扩增编码Na的基因，具有特定的引物向前：5'-Caattggctctgtctctctct-3'和反向：5'-ATGAAATGAAATTGAAATTGAAATTGATGATGATGTGTTCGCCCCCC-3'' 。PCR产物从1.5％琼脂糖凝胶中纯化 ，并用三个不同的引物进行测序：5'-caattggctctgtctctct-3'
，5'-Gaagagagccgatactagaa-3'和5'-tttctagtagtatcggcgtcttc-3'
。使用CLC Main Workbench 22软件进行了与A/香港/1/1968 NA的序列对齐。 　　对于串行传递性抗性实验，将MDCK-LN细胞以每个孔的120,000细胞在24孔板中播种 ，并在37°C下在生长培养基中培养过夜（DMEM
，10％FBS，0.01 M HEPES ，0.01 M HEPES和100 U ML-1 PERICICILIN – 100 µG ML-1 µG ML-1链霉素） 。二十四小时后
，将H1N1 A/California/07/2009或A/New Caledonia/20/99 Virus库存和FNI9稀释，并在含有0.5 µg ML-1 TPCK验证的胰蛋白酶的感染培养基中混合1：1 ，最终浓度为1,000 pfu，每孔Virus和0.5 r-iC5 ic 50 rng iC5 ic99.41
。将病毒 - 抗体混合物放置在37°C下
，并在预杂附加条件下进行30分钟。包括细胞和病毒对照孔的细胞摄影（CPE）比较器 。将细胞在DMEM中洗涤两次，然后将100 µL病毒 - 抗体复合的混合物 ，病毒和细胞对照在37°C下添加1小时
。病毒吸附后
，将细胞在DMEM中洗涤两次，然后将500 µL稀释的抗体或含有0.5 µg ML-1 TPCK处理的胰蛋白酶的感染培养基添加回各自的井中。将板在37°C下孵育 ，并在病毒 - 抗体良好的50％CPE中收集病毒 。将病毒上清液在-80°C的120 µL等分试样中冷冻
，用于下一个耐药性，将一个等分试样用于下一个等分试样 ，将一个等分试样添加到360 µL的DNA/RNA屏蔽中
，以进行RNA萃取，并保存一个等分试样 ，以保存一个等分试样
。对于通道2
，用原始的0.5×和1×IC50浓度的FNI9重复该过程，其中最高的抗体浓度显示CPE为下一个段落选择。对于每个额外的段落 ，重复来自选定井的浓度以及2×浓度 。在CA09研究中，有八个病毒通道
，最终浓度为64×FNI9的IC50（3,200 ng ml -1）。 　　为了鉴定基因组突变，使用Zymo QuickRNA病毒试剂盒（R1034）根据制造商的说明提取病毒基因组RNA ，并使用Qubit RNA BR Assay试剂盒（Q10210
，Invitrogen）测量RNA浓度
。使用铂Taq DNA聚合酶（12574018，Invitrogen）使用Superscript III单步RT – PCR系统合成cDNA使用Ampure XP磁珠（A63880 ，Beckman Coulter）纯化引物和PCR片段。接下来
，使用NEBNEXT ULTRA II FS DNA库预备套件（E6177L，NEB）进行分散的扩增子 ，然后使用Nebnext多重寡速差（7335L
，NEB）添加适配器和索引 。使用NEBNEXT样品纯化珠纯化DNA样品，然后使用Qubit DNA HS分析试剂盒（Q32854 ，Invitrogen）进行定量
，并使用D500磁带站（G2964AA，Agilent）进行验证
。最后 ，将样品稀释并汇总，然后使用Miseq Reagent Kit V3（MS-102-3003）和Phix Control V3（FC-1110-3001）进行测序。Na突变I223R和S247N首先出现在第6和7段中
，每个传段都达到了下一代总测序（NGS）的50％，读取的段落8 。 　　为了评估补体依赖性细胞毒性（CDC测定） ，MDCK-LN细胞被A/California/07/2009（H1N1）感染
，MOI为6
。在37°C的5％CO2下18 h 18 h时，将细胞用胰蛋白酶 ，洗涤并分配到扁平扁平的384-粒子中。将抗体在AIM-V培养基中连续稀释
，与感染的靶细胞混合，并在室温下孵育10分钟 。孵育后 ，将先前用AIM-V培养基稀释为1：5的豚鼠低TOX补体（Cedarlane）被添加到每个孔中
。还包括含有靶细胞的对照井
，并与50 µL 2％Triton X-100相辅相成，以测量最大裂解或靶细胞 ，并仅补充以评估自发性裂解。根据制造商的说明
，使用LDH检测试剂盒（11644793001，Roche）测量乳酸脱氢酶（LDH）释放34°C后34°C孵育3小时后 ，定量细胞死亡 。使用动力学方案，每分钟每分钟测量一次490 nm和650 nm处的吸光度
，并确定比例的裂解百分比
。 　　对抗体依赖性细胞毒性进行在6549的A549细胞上进行的A/8/8/34（H1N1），MOI为6。在37°C的37°C用5％CO2的18小时后 ，用胰蛋白酶
，洗涤并分配到圆形的384-well pec- per-per-per-per-per-per-pere（7.5°5％）（7.5°5; 5％）的靶细胞划分为7.5×103×103×103×103×103×103×103×103×103 。在AIM-V中制备了抗体的系列稀释液，将其添加到细胞中 ，并在室温下孵育10分钟。使用Macsxpress WB NK细胞分离试剂盒（130-127-695
，Miltenyi Biotec）从新鲜血液中分离出人类天然杀手（NK）细胞，并按照制造商的指示进行了说明
。温育后 ，将NK细胞以每孔4.5×104的细胞密度添加
，以达到效应子与目标比的6：1。还包括对照井来测量最大裂解（含有3％Triton X-100的靶细胞）和自发裂解（含有靶细胞和无抗体效应细胞） 。根据制造商的指示，使用LDH检测试剂盒（11644793001 ，Roche）测量LDH释放
，在37°C下与5％CO2孵育4小时后，确定细胞死亡
。使用动力学方案 ，每2分钟测量一次490 nm和650 nm处的吸光度，持续8分钟
，并确定比例的特定裂解百分比。使用来自A/Perth/16/2009（H3N2）的NA进行瞬时表达抗体依赖性细胞吞噬作用的测定，并用PKH67（Sigma-Aldrich）标记 。将来自健康供体的外周血单核细胞标记为CellTrace Violet（Invitrogen） ，并用作吞噬效应细胞的来源
。在RPMI-1640培养基中连续稀释抗体。将标记的靶细胞（每孔1×104）与稀释的mAB孵育10分钟
，然后与标记的PBMC（每孔1.8×105）混合 。在37°C和5％CO2的过夜孵育之后，用APC标记的抗CD14 MAB（BD Pharmingen） ，BV605标记的抗CD16 MAB（Biole-opolegend）
，Biolegend），Biole-CD14 MAB（BD Pharmingen）将细胞染色20分钟
。 BV711标记的抗CD19 MAB（Biolegend） ，PERCP/CY5.5标记的抗CD3 MAB（Biolegend）和APC/CY7标记的抗CD56 MAB（Biolegend）用于鉴定CD14+ Monocytes。孵育后
，在ZE5细胞分析仪（Bio-Rad）上获得之前，将细胞洗涤并用4％多聚甲醛固定 。使用FlowJo软件分析数据
。计算抗体依赖性细胞吞噬作用的百分比为PKH67阳性的单核细胞（CD14+细胞）的百分比。测定在两个不同的供体上进行 ，并计算曲线下的面积 。 　　补充表5中提供了样品制备的摘要。简而言之
，将Na蛋白与1.3-1.5倍的FNI Fabs混合，并在冰上孵育1小时
。使用SuperDex 200 10/300 GL（Cytiva）柱在50 mM Tris-HCl（pH 8.0） ，150 mM NaCl和10 mM CaCl2中平衡的SuperDex 200 10/300 GL（Cytiva）柱通过尺寸排斥色谱法进行纯化。在玻璃化之前，使用Amicon Ultra离心过滤器（Millipore Sigma）将含有分数的复合物汇合并浓缩 。每种Na-FAB复合物的0.2-0.25 mg ml-1的含量为0.70×临界胶束浓度（CMC）
，有或没有N-二二烷基-β-麦尔替剂（DDM），将3 µl加载到新鲜光芒上排放到1.2/1.3 Ultrafoil free flunge flofivic fistrivic a Mark的新鲜光芒上 ，然后使用VITROBIV（photto）fistotiv（在100％湿度和4°C时
，印迹时间为7 s
。 　　FNI9 – NA（N2 A/Tanzania/205/2010）的数据集是在配备了Gatan K3 Direct检测器和Gatan Bioquantum Energy滤波器的300 kV Titan Krios上收集的，该速度为30 eV。使用SeriaLem57以标称×81,000的超分辨率模式下的序列倍率进行半自动数据收集 ，以0.53Å的大小为0.53 。剂量为48 e -Å2
，在40帧的75毫秒内分离
。 　　对于其他数据集，在配备有Falcon 4相机的200 kV Fei Glacios传输电子显微镜（TEM）上获取数据 ，或者配备了300 kV Fei Titan Krios TEM
，配备了Gatan K3 Summit Direct Direct Direct Dicter和Gatan Quif Gif Energy Filter，该量子器在零损耗模式下操作 ，具有20 ev的SLIT模式。使用Leginon58以标称放大倍数为×150,000
，对晶状体数据集的像素大小为0.927Å，而KRIOS数据集则进行自动数据收集 。将剂量率调整为每秒1.4个像素的计数 ，并且每件电影的冰川数据集中的24帧分数为110毫秒，对于KRIOS数据集
，每件电影的剂量速度为110毫秒，为40毫秒的35或38帧
。 　　对于每个数据集 ，收集了1,089至5,433部电影
，其中包括-1.0至-2.5μm之间的散焦范围。补充表5中提供了数据收集的摘要 。 　　对于FNI9 – NA（N2 A/Tanzania/205/2010）的数据集，使用59,60用于冷冻电子显微镜（Cryo-EM）数据处理
。使用MotionCor2（参考文献61）的相关实现进行剂量加权的电影框架对齐 ，以说明阶段漂移和梁引起的运动。使用CTFFIND4（参考文献62）估算每个显微照片的对比传递函数（CTF） 。使用的laplacian算法用于无模板的自动粒子拾取。将提取的颗粒进行2D分类
，只有那些有助于Na -fab平均值的详细观点的颗粒才用于进一步分析
。使用Relion从所有选定的粒子中生成了初始的3D映射。具有四个Fabs结合的Na – FAB复合物用作与3D分类的输入，其中将3-fab和4-fab复合物分离出来 。这些单独的3D类已提交进一步的改进 ，包括CTF的细化
，贝叶斯抛光和掩盖
。没有将对称性（C1）应用于Na-3-fab图的进一步细化，但是将C4对称性用于Na – 4-fab细化。 　　对于所有其他数据集 ，使用MotionCor2（参考文献61）或CryoSparc63中的全帧或斑块运动校正来完成剂量加权的电影框架对齐
，以说明阶段漂移和梁诱导的运动 。使用CTFFIND4（参考文献62），GCTF64或CryoSparc中的Patch CTF估算每个显微照片的CTF
。使用自动采摘协议选择单个颗粒 ，并在Relion59,60或CryoSparc中提取到粒子堆中。在CryoSparc中，将颗粒和/或2D类提取的颗粒和/或2D类显示了2D和/或3D分类 。从所有选定的粒子开始生成初始地图
。最佳的3D类已提交给包括动态掩蔽的均质3D细化
，以及应用C1（用于1-FAB或3-FAB BOND BOND NAS）或C4（适用于4-FAB结合的NAS）对称性的对称性。 　　报告的分辨率基于0.143 Criterion65的金标准傅里叶壳相关性 。补充表5中提供了冷冻EM数据统计数据的摘要
。 　　来自A/坦桑尼亚/205/2010 H3N2（蛋白质数据库（PDB）ID：4GZX）的N2 Na的原子模型或B/Phuket/3073/2013（PDB：6V4O）的原子模型被用作UCSF Chimera66的冷冻em映射的初始模型。COOT67和ISOLDE68用于在NAS上手动重建氨基酸突变和聚糖并建造Fabs 。模型是由Prosmart69自我掩盖的，并由CCPEM v1.6.0软件suite Suite71中的RefMac ServalCat70精制。模型验证和MAP模型FSC是通过验证：CCPEM V1.6.0中的模型工具生成的
。 　　使用Pymol72生成数字。使用MOE（v2020.0901; https：//www.chemcomp.com） ，通过确定FNI Fabs
，1G01，SA或Oseltamivir中任何原子中的Na残基在5.0Å中的Na残基中鉴定出来 。MOE QuickPrep用于准备NA复合物进行静态表位分析
。 　　用液相色谱 - 质谱法（LC-MS）绘制肽映射 ，用于在两个NAS上（A/Tanzania/205/2010和A/Hong/2671/2019）介绍位点特异性糖基化位点。通过胰蛋白酶
，GLU-C，LYS-C或ASP-N蛋白酶 ，根据序列上下文选择性消化
，仅通过选择性消化，仅实现仅包含一个特定聚糖的糖肽 。通过LC -MS（Agilent AdvanceBio肽映射柱和Thermo Q Stryo Q Strapive Plus Orbitrap MS）分析每种消化产物（具有单个聚糖的肽）25 µg
。在Biopharma Finder 3.2数据分析软件上分析了肽映射数据。通过将25 µg消化产物从同一样品小瓶注入LC -MS三次进行技术重复 。 　　FNI17-NA（Tanzania/2010）和FNI9 – NA（坦桑尼亚/2010）的坐标是从Cryo-EM（见上文）获得的 ，其通过肽映射LC-MS确定的Glycans（如前所述的ISOLDE模拟的肽图7）（扩展数据图7）如前所述68,73
。然后使用QuickPrep（MOE V2020.0901; https：//www.chemcomp.com）制备所得模型。 　　FNI9 – Na四聚体和FNI17-NA四聚体络合物结构均使用AMBER74中的TLEAP参数为MD
，并使用FF14SB蛋白力field75，GlyCAM_06J-GLYCAM_06J-GLYCAN FORES FIELL76和TIP3P WATER FORT FORD FIELD77；Joung和Cheatham Force Field78用于离子 。 　　我们通过进行十个独立的MD模拟 ，每个均具有不同的初始速度
。如前所述79，将这20个模拟中的每一个最小化并平衡。具体而言
，在实验数据中解决的所有重原子都受到限制：在最小化期间​​，100 ps的MD加热至300 K；300 K时100 ps的MD;250 ps的MD ，在300 K处具有十倍弱约束力常数 。所有骨干原子在结构中都得到了限制：10,000步的最小化步骤；300 K时100 ps的MD;100 ps的MD在300 K（十倍弱约束力常数）；100 ps在300 K时MD
，另外十倍降低了力常数；100 ps在300 K时MD，另外十倍降低了力常数（每分摩尔0.1 kcal）。最后 ，在300 K处的2.5 ns不受约束的MD
。生产MD涉及20个独立模拟中的每一个中的每一个
，涉及0.8μs的不受约束的MD模拟，然后为FNI9 – Na中的5个额外的0.7μs和FNI17 – NA中的5个模拟 ，用于fni9 -ni9 -ni9 -ni9 -ni9 -na和11.5μs的骨料均值。 　　如前所述79
，使用CPPTRAJ80处理仿真 。使用MOE中的接触分析（CCG MOE 2020.09）计算表位 - 参与式相互作用，其中所有氢键 ，金属
，离子，芳烃和基于距离的相互作用（在5Å之内）均考虑在内
。该分析是对每10 ns采样的MD帧进行的。报告的MOE能量得分是总MD中每个相互作用对的平均能量 。报道的占用百分比反映了存在特定接触的11.5μsMD模拟数据集中的帧百分比
。 　　在测试设施的机构动物护理委员会（IACUC）批准动物程序后 ，在Burleson Researching Technology Inc.（北卡罗来纳州）评估了MUFNI9和MUFM08在伯勒森研究技术公司（北卡罗来纳州）的BALB/C小鼠中对感染A/Puerto Rico/8/34感染的BALB/C小鼠的预防功效。七至八周的BALB/C雌性小鼠（Charles River Laboratories）获得了单剂量的MUFNI9，MUFEDI8852
，MUFNI9（N297Q），MUFNI9（N297Q） ，MUMEDI8852（N297Q）（N297Q）或通过静脉注射的第-1天
，基于静脉注射，基于静脉注射 ，基于静脉注射
，基于静脉注射，基于静脉注射 。在第0天 ，用流感A/Puerto Rico/8/34病毒（VR-95PQ
，ATCC）内鼻内感染动物（每组n = 6）
。每天从0-3天开始对小鼠进行一次监测，从第4-14天开始每天两次。从第4天到第14天 ，每天测量体重
，并在第0天（感染前）收集血清以进行MAB定量 。 　　Medi8852和FNI17的预防活性单独或以1：1的组合在对H1N1 A/Puerto rico/8/34感染或人类Medi8852，FNI19和FNI19和MumeDi8852和Mufni9 Mabs的响应中 ，对H3n2 A/1/1/1/H3n2 a/hhong -kong Kong/hhong -kong Kong/hhong Kong/hhong Kong/hhhong Kong/hhong Kong/hhong Kong/h 3 kong/hhong Kong/hh 3n2 a/hhong knong/雌性小鼠为0.25或0.125 mg kg -1
。体重减轻和感染后第14天到第14天的体重减轻和生存被用作主要终点。使用GraphPad Prism 9计算了负峰的面积，定义为每只动物的体重线与0％体重减轻基线之间的面积
，并用于比较抗HA茎，抗NA和两个MAB的组合的预防活性 。 　　FNI9对流感B/Victoria/504/2000和B/Brisbane/60/2008的预防功效在7-8周龄BALB/C雌性小鼠中通过静脉注射 ，在第-1天通过静脉注射
，通过静脉注射，在7-8周大的BALB/C雌性小鼠中进行。Oseltamivir（Medchemexpress）治疗组中的小鼠通过2小时感染前2小时 ，感染后6小时接受10 mg-kg-1的小药物
，然后根据第-2天的体重进行感染后第3天直到感染后第3天
。动物在第0天内用流感B/Victoria/504/2000或流感B/Brisbane/60/2008（Virapur）病毒的流感B/Victoria/504/2000或流感的动物感染动物。第3天对动物进行了安乐死，并记录了肺和体重 。使用斑块测定法 ，在第3天收集的肺匀浆上清液中测量了传染病病毒滴度
。 　　体内预防性研究涉及人类FNI9 IgG MAB和A/Puerto Rico/8/34（PR8）和A/Singapore/INFHH-16-19/2016病毒
，并遵守联邦法律和机构指南，并已得到圣路易斯IAC的华盛顿大学的批准。根据抗体治疗和病毒感染之前的年龄 ，随机分组了7至9周的雌性BALB/C小鼠 。在病毒感染前24小时
，将抗NA mAB作为单次静脉注射给药
。对于奥塞达米维尔治疗，小鼠在感染前2小时口服10 mg -kg -1的磷酸oseltamivir磷酸盐 ，然后每天一次持续5天。在感染当天，将小鼠用2％的异氟烷​​和鼻内感染的5倍致死剂量50（5 ld50）的病毒感染
，在50μl的PBS中稀释 。感染后，每天监测小鼠 ，并记录其重量
。为了确定肺病毒滴度
，感染后4天杀死小鼠。收集肺并在-80°C下储存 。将组织在1 mL的MEM中匀浆，并在37°C下在MDCK-LN细胞上孵育1小时 ，然后进行两个PBS洗涤
。感染培养基（MEM含有100 U ML-1青霉素
，50μgml-1链霉素，100 µg ML-1 Kanamycin和0.5μgml-1 TPCK处理的胰蛋白酶） ，将200 µL添加到细胞中。在37°C下孵育3天后
，除去50 µL上清液，并将50 µL的0.5％火鸡红细胞添加到50 µL的上清液中 ，并评分了血液凝集的终点稀释 。使用Spearman -Karber公式计算TCID50滴度。 　　使用基于电化学的免疫测定进行IgG定量
。将标准曲线和质量控制稀释在BALB/C小鼠血清（Biovit）中
，并在等分试样中存储在-20°C下，直到需要进行定量测定。将试剂和样品平衡至室温至少30分钟 。然后将血清 ，标准曲线和QC在使用前以1,000克离心5分钟
。对于鼠mAb的定量，分别用Na蛋白（N9）或HA蛋白（H5）覆盖了多阵列96孔标准板（Meso量表发现）
，分别在4 µg mL-1或2 µg ml-1处涂覆。将板在4°C下孵育过夜，然后用PBS – 0.05％Tween（PBS-T）洗涤 ，并在PBS（Thermo Fisher）中用酪蛋白在室温下用酪蛋白封闭2小时 。用BALB/C小鼠血清将血清稀释1:20
，然后用1:50（用于抗NA mAb）或1：100（用于抗Ha mAb）酪蛋白稀释，这是针对标准曲线和QCS进行的
。用PBS-T洗涤板 ，然后将50 µL稀释的样品
，标准曲线和QC添加到适当的井中，并在室温下孵育1小时。FNI9的山羊抗小鼠硫标签（MESO量表诊断）用于检测1 µg ml-1的浓度为1 µg ml-1 ，Mumedi8852用于先前用PBS-T洗涤并孵育1 h的板上的MUMEDI8852的0.75 µg mL-1 。用PBS-T洗涤后
，每孔添加150 µL MSD读取缓冲液，并在Meso Quickplex SQ 120上读取板
。使用相同的方法对人mAb进行了量化 ，但使用抗LS抗体进行捕获和抗-CH2-Sulfo标签进行检测。 　　深层突变扫描方法用于确定Na氨基酸突变如何影响mAb结合 。生成了基于N1 A/California/07/2009的细胞表面显示库
，其中包括170个精选氨基酸的所有变体
。突变的残留物包括与从冷冻EM获得的结合晶圆厂（FNI17-FAB和FNI19 – FNI19 – FNI19-FAB）在与N2 A/Tanzania/205/2010的复合物中获得的表位残留物和FNI3 – FNI3-FAB（fni3 – Fab in2 a/tanzania/2055/2011）mem5 – fab（PDB：2AEP）和B10 – FAB（PDB：6N6B））。此外，包括H1N1和H5N1的GISAID中已知序列变化的残基被包括在内 。 　　图书馆的建设 ，慢病毒生产，下一代测序和数据反卷积是通过麻省理工学院和哈佛大学广泛研究所的遗传扰动平台（GPP）进行的。先前已经描述了每种方法的详细描述81
。对于库合成
，慢病毒矢量PMT025编码野生型N1 A/California/07/2009开放阅读框架，并通过2×G4S链接器添加了C端最小HA标签 ，并用作模板来生成变体库池。在Twist Biosciences上合成了具有5'和3'侧翼适配器的全长变体池 。在限制消化克隆和pDNA扩增之后
，使用Illumina nextera XT平台评估了pDNA库的变体组成
。检测到所有3,472个设计的变体，并且变体的分布近似值正态 ，在各种变体的读取计数中
，标准偏差为1.3倍。慢病毒颗粒是根据通过GPP（http://www.broadinstitute.org/rnai/public/public/resources/protocols）获得的方案产生的 。该库以大约0.3的MOI转换为自由泳293-F细胞（Thermo Fisher Scientific），并以每个变体的平均表示为2,000个细胞
。 　　对于屏幕 ，通过流式细胞术确定了与细胞表面脱落的Na的mAb结合。通过游离胺缀合直接将mAB与Alexa Fluor 647（Thermo Fisher Scientific）连接在一起
，以实现基于荧光的检测 。选择紫霉素后5-7天收集了含有NA变体文库的293-F细胞，在含3％BSA的PBS中洗涤 ，然后在黑暗中在4°C下与Alexa Fluor 647偶联的MAB孵育1小时
。用4％多聚甲醛洗涤细胞并固定细胞
，然后在两个单独的分类器（BD Aria Fusion或Sony MA900）上以技术重复分类。使用活/死固定的蓝色死细胞染色套件（Thermo Fisher Scientific）将死细胞排除在分析之外 。每个技术复制的FACS至少准备了6000万个细胞
。将表达NA变体库的293-F细胞通过FACS分类为负，低和高的单元单位结合箱 ，并且每个垃圾箱中的变体的分布由NGS确定，如下所述。NA开放式阅读框架包括最小的C末端HA标签
，该标签也与使用Alexa Fluor 488抗HA.11表位标记抗体（Biolegend）一起筛选，以确定170个选定残基的突变如何影响一般蛋白质表达 。对于每个屏幕 ，至少收集了500万个未分类的图书馆单元
，以用作未分类的对照。 　　将基因组DNA从排序的样品和与QIAAMP DNA FFPE组织试剂盒中的未分类对照分离（随后进行了修改：将0.3 M NaCl添加到裂解缓冲液中，并在56°C下孵育56°C） ，分别将Qiaamp DNA血液套件（QIAGEN）延伸至4 h）
。如前所述
，为NGS制备了基因组DNA。简而言之，通过PCR通过以下引物（正向：5'-attctccttggaatttgccctt-3''进行开放式阅读框 ，并进行反向：5'-catagcgtaaaaaggagaagaagaagaagcaaca-3'）
，并使用Illumina nextera imlumina nextera tectera for for NG进行了处理 。使用NextSeq2000测序平台对样品进行测序，以获得具有2×150个周期的配对末端读数
。如先前所述 ，使用突变检测软件ASMV1.0进行了序列数据处理和变体调用。81 。每个样本的归一化读数是log2转换的
。将log2折叠变化值比较了否定分类箱与未分类池以及每个库变体的低结合和高结合FACS分类箱
，然后平均用于抗HA标签和抗NA抗体。潜在的逃逸被定义为具有接近静音突变的HA标记信号的那些（最大两个标准偏差远离静音突变的平均值），并且具有接近终止密码子突变的抗NA信号（最大三个标准偏差远离终止密码子突变的平均值） 。 　　H3N2（IAV） ，H1N1（IAV），H5N1（IAV）
，H7N9（IAV），H5N8（IAV） ，H5N6（IAV）
，Victoria（ibv）和Yamagata（IBV）NA蛋白质序列来自Gisaid（wwwwwww.gisaid）
。使用MAFFT82将蛋白序列比对与参考NA序列。对于图2，从2000年1月到2022年10月 ，从GISAID存储库中检索了所使用的序列
，用于H1N1序列的A/California/07/2009（NC_026434.1）的相应参考对于H1N1序列（NC_026434.1），用于A/Newyork/Newyork/392/392/2004（YP_308842.1）for H38842.1/B320/B320/B320/B3n/YAN 。（AAN39803.1）对于维多利亚州和Yamagata IBV序列
。对于图5的扩展数据 ，用于H3N2
，H1N1，H5N1 ，H7N9 H5N9 H5N8和H5N6序列
，以及B/Yamagata/1988的胜利（H1N1，H7N1 ，H7N9，H7N9
，H7N1，H7N1 ，H7N1
，H7N1，H7N1 ，H7N1
，H7N1，H7N1 ，H7N1
，H7N1，H7N1 ，H7N1
，H7N1，H7N1 ，H7N1，H7N1
，H7N1，H7N1 ，H7N1
，H7N1，H7N1 ，H7N1
，H7N1，H7N1 ，H7N1
，H7N1，H7N1 ，H7N1
，H7N1，H7N1 ，H7N1，H7N1
，H7N1，AN）Yamagata IBV序列。用R（https://www.r-project.org/）V.4.0.4分析了多个序列比对 。使用R软件包“ GGSEQLOGO
” V.0.1（参考文献83）生成徽标图。使用R软件包“ BioStrings” V.2.58.0（https://bioconductor.org/packages/biostrings）计算每个残留物的保护
。 　　所有统计测试均如指示的图例中所述使用Prism v9.0进行。执行的独立实验的数量在相关的图例中指示 。 　　本研究中生成的材料可应相应的作者的要求提供 ，可能需要进行重大转移协议
。 　　图5A – D
，G，H和扩展数据中报道的所有涉及动物的实验均由Burleson Research Technologies ，Inc。（BRT）动物护理和使用委员会批准（研究编号：BRT20220306
，BRT 2022072和BRTQ20220307），并由实验室动物福利（PHS Assurance Assurance Assurance Assurance Nubsance Nubsance assurance Nubsance Nubs of Labortoration Animal Andial Assial Fellts Assurance Nubs 。BRT已获得国际实验室动物护理评估和认证协会的认可
。批准该方案的IACUC主席也是这些研究的主要兽医 ，并与研究主管一起被告知每天进行这些研究的体重减轻和临床观察。此外
，兽医和研究主管均亲自检查了整个研究中的研究小鼠的状态 。 　　在BRT的流感模型的扩展经验的基础上，在图5a -d和扩展数据中报告的研究未设置特定的减肥极限 ，图9（BRT20220306和BRTQ20220711）
，因为30％（或更大）体重减轻的小鼠具有正常的CAGE活性水平，该水平正常与食物相互作用 ，可以访问食物并替代食物，并培养了食物并渴望添加
。此外
，体重减轻超过30％的小鼠被证明能够从该模型中的感染中恢复。在这种情况下，BRT不会安乐死鼠标 ，而是要等到下一个观察期重新评估行为以及任何进一步的体重减轻 。在每个观察期间
，铅兽医和研究主管均专门检查了满足安乐死要求的动物，如研究方案和IACUC方案中所述
。 　　鉴于研究的性质和所涉及的减肥性 ，采取了措施
，以尽可能地减少疼痛，困扰和不适 ，包括提供减肥套
，以帮助提供从感染到第14天到第14天的水分和营养，动物观察的频率增加 ，每天两次
，每天的观察到4-14天的观察到每天的观察到5 h，并且在其他几天之间进行了不利的迹象 ，并在其他几天之间进行了体现，并在不利的情况下进行了典范
，并且在不利的情况下进行了体现，如果认为动物不太可能从感染中恢复 ，兽医和人道安乐死。 　　除了方案驱动的安乐死要求外
，尽管体重减轻并未用作终点，但它被用来进一步评估小鼠并有助于为安乐死的决定提供信息 。例如 ，如果体重减轻很高并且没有稳定
，并且/或体重减轻很高，并且观察到其他临床迹象（尤其是运动或活动的强烈减少） ，则立即对动物进行人工安乐死
，因为这两种情况通常都很好地表明，小鼠不可能从感染中恢复过来。 　　程序 ，设施和住房符合《 NRC护理和使用实验动物的护理指南》
。根据感染后3天（图5G
，H; BRT 2022072）或在整个14天的观察期（图5A – D和扩展数据图9; BRT20220306和BRTQ20220711）在14天的观察期（图5a – d和扩展数据）根据AVMA指南：2020年的AVMA指南：2020年的法律规定，并适用于所有适用于所有适用于所有法律 ，在整个14天的观察期（图5A – D和扩展数据图9; BRT20220306和BRTQ20220711）中，对小鼠进行了安乐死。 　　图5E中报道的所有涉及动物的实验均由圣路易斯IACUC的华盛顿大学（动物福利保证D16-00245）批准 。所有涉及动物研究的设施均获得了国际实验室动物护理评估和认证协会的认可
。程序
，设施和住房符合《 NRC护理和使用实验动物的护理指南》。根据《动物安乐死：2020年版》的AVMA指南，并符合所有适用的州和联邦法律 ，在感染后4天对小鼠进行安乐死 。 　　根据估计的效果大小和历史数据
，将功率分析（80％）设置为5％，以确定实验的动物数量 ，并将动物的数量保持在最低限度
。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。